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高中人教版 (2019)第2节 基因工程的基本操作程序集体备课ppt课件
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这是一份高中人教版 (2019)第2节 基因工程的基本操作程序集体备课ppt课件，共60页。PPT课件主要包含了课前自主预习案，课堂互动探究案，受体细胞性状，预期表达产物，Bt抗虫蛋白基因，已知结构，功能清晰，序列信息，Bt抗虫蛋白，序列比对等内容，欢迎下载使用。
知识梳理·填准记牢——自主·预习·先知知识点一 目的基因的筛选与获取1．目的基因(1)概念：用于改变____________或获得____________等的基因。(2)实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是______________。2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的________和________的基因中进行筛选。(2)实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的________，也对Bt基因的表达产物——____________有了较为深入的了解。(3)认识基因结构和功能的技术方法：________技术、________数据库、________工具。
3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是________________的缩写，它是一项根据____________的原理，在体外提供____________的各种组分与反应条件，对__________________进行大量复制的技术。(2)条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种________、4种___________、________________。
(3)过程：①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA________________。②复性：温度下降到50 ℃左右时，________通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中的______________在耐高温的____________的作用下加到引物的____端合成子链。④重复循环多次。(4)结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即呈________形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。
知识点二 基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的(1)使目的基因在受体细胞中__________，并且可以________给下一代。(2)使目的基因能够________和发挥作用。
2．基因表达载体的组成
3．基因表达载体的构建首先用一定的________切割载体，使它出现一个切口，然后用________限制酶或______________的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，再利用__________将目的基因片段拼接到载体的切口处。
知识点三 将目的基因导入受体细胞1．转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内________和________的过程。2．目的基因导入受体细胞的方法(1)目的基因导入植物细胞①花粉管通道法a．用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入________中。b．在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助____________进入________。
②农杆菌转化法a．农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染________植物和________植物；农杆菌的Ti质粒上的________能够整合到所侵染细胞的___________上。b.转化方法：将目的基因插入农杆菌______________中，让农杆菌侵染植物细胞。
(2)目的基因导入动物细胞①常用方法：________法。②常用受体细胞：________。(3)目的基因导入微生物细胞①方法：用________处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组表达载体导入其中。②常用受体细胞：原核生物(使用最广泛的是大肠杆菌)。
知识点四 目的基因的检测与鉴定1．分子水平检测(1)通过________等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。(2)从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行__________杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。2．个体水平鉴定包括抗虫、抗病的________实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。
知识应用·强化落实——效果·检测·定向判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)1．如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同。( )2．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。( )
× 提示：cDNA文库中的基因一般没有启动子和内含子序列，而基因组文库含有。
× 提示：Taq酶是热稳定DNA聚合酶。
3．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用。( )4．利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞。( )5．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。( )
× 提示：终止密码子位于mRNA上，在翻译过程中起作用。
× 提示：利用DNA分子杂交的目的是检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因。
× 提示：抗虫效果的鉴定要在个体生物学水平上做抗虫接种实验来鉴定。
6．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得。( )7．将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。( )8．从大肠杆菌细胞中获得人胰岛素基因的mRNA，说明目的基因完成了表达。( )
× 提示：人肝细胞中不含胰岛素基因的mRNA。
× 提示：获得人胰岛素基因的mRNA，只能说明目的基因完成了转录。
课程标准阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 素养达成1.结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。(科学思维)2．针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。(科学探究)
设疑激趣我国是棉花生产和消费的大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。大量施用农药杀虫不仅会提高生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。要是能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种，这一问题就会迎刃而解，我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉就是在这样的背景下产生的。为什么传统的杂交育种方法培育不出抗虫棉，基因工程却可以呢？基因工程是如何进行操作的？它给我们的生产和生活带来了怎样的影响？
夯基提能·分层突破——互动·探究·智涂学习主题一 目的基因的筛选与获取活动1 阅读下列材料，思考并回答下列问题：巴西等拉美国家深受致倦库蚊的危害。致倦库蚊可携带多种病毒和寄生虫，能够传播脑炎、丝虫等传染病，而这些传染病常年在拉美国家肆虐。为了抑制疾病的传播，科学家培育出了一种转基因雄性致倦库蚊。科学家在雄性致倦库蚊体内植入一种特殊基因，当具有该基因的雄蚊与野生雌蚊交配时，这种基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从而达到减少该种蚊子的数量，抑制疾病传播的目的。
1．该项研究的目的基因是什么？其作用是什么？ 2．利用PCR技术扩增该特殊基因需要提供哪些条件？
提示：植入雄性致倦库蚊体内的一种特殊基因是该项研究的目的基因。该基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从而减少该种蚊子的数量，抑制疾病传播。
提示：需要模板、酶、原料、引物以及适宜的温度和pH等条件。即以DNA两条链为模板，在耐高温的DNA聚合酶的作用下，4种脱氧核苷酸(A、T、C、G)作为合成子链的原料，从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。反应过程中，缓冲溶液维持反应的pH，并保证变性、复性和延伸需要的适宜温度。
3．什么是引物？PCR过程中为什么需要引物？ 4．PCR过程中两种引物的碱基序列能否互补？说明理由。
提示：引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。存在于自然界中生物的DNA复制和人工合成中的多聚酶链式反应(PCR)之所以需要引物，是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能从5′端到3′端合成子链。
提示：不能。因为两种引物分别与两个DNA单链的3′端互补结合，而DNA的两条单链的3′端碱基序列往往不同，如果2种引物的碱基序列互补那么会影响引物与DNA单链的结合。
5．如果在某基因组定位了一个目的基因X，但是其核苷酸序列未知，现已知X邻近区域的上、下游的部分DNA序列，此时如何设计引物？
提示：虽然目的基因X的核苷酸序列未知，但X临近区域的上、下游的部分DNA序列已知，因此可根据X临近区域的上、下游已知序列设计引物。
活动2 阅读下列材料，思考回答下列问题：实时荧光RT－PCR(逆转录PCR)在诊断新型冠状病毒感染中发挥着关键作用，该方法是提取检测者的mRNA在试剂盒中逆(反)转录出cDNA，并大量扩增，同时利用盒中荧光标记的新型冠状病毒核酸探针来检测PCR产物中是否含有新型冠状病毒的cDNA，在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，可通过荧光强度的变化监测产物量的变化。
1．请根据信息分析“荧光RT－PCR技术”所用的试剂盒中应含有哪些物质？ 2．在检测过程中，若有荧光标记的“杂交双链”出现，则说明检测结果呈阳性，荧光强度能否一直增强？请说明理由。
提示：检测者的mRNA、耐高温的DNA聚合酶、荧光标记的新型冠状病毒核酸探针、逆(反)转录酶、引物、4种脱氧核苷酸、缓冲液等。
提示：不能。试剂盒中所加入的引物数量一定。
[总结归纳]目的基因获取方法的选择(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过用受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中获取目的基因。(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可通过DNA合成仪利用化学方法人工合成。(3)如果只知道待扩增目的基因的两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，则可通过PCR技术扩增目的基因。
[易错警示]PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA片段要长，从第三次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种引物。
1.筛选合适的目的基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
2．从基因文库中获取目的基因(1)基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。(2)基因文库的种类①基因组文库：包含一种生物所有的基因。②部分基因文库：只包含一种生物的一部分基因，如cDNA文库。说明：用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库。
(3)从基因文库中获取目的基因的方法根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
3．利用PCR技术扩增目的基因(1)PCR技术：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。(2)PCR原理：DNA半保留复制。(3)前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列(以便根据这一序列合成引物)。
(4)扩增过程：目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在耐高温的DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环多次。如图所示。
注意：利用PCR技术扩增目的基因可以在PCR扩增仪中自动完成。提醒：①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
4．用化学方法人工合成目的基因(1)条件：基因比较小，且核苷酸序列已知。(2)仪器：DNA合成仪。
5．PCR技术扩增与DNA复制的比较
1．(学业水平一、二)如图为基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。相关叙述中正确的是( )A．这三种方法都是在体内进行的B．①②③碱基对的数量和排列顺序相同C．方法a和c均用到DNA聚合酶D．方法c需要模板
解析：题中三种方法都是在体外进行的，且都用到酶(方法a需要反转录酶和DNA聚合酶，方法b需要限制酶，方法c需要DNA聚合酶)，A错误、C正确。方法a得到的目的基因不含有内含子，方法c得到的目的基因的碱基序列可能有多种，因此①②③碱基对的数量和排列顺序不相同，B错误。方法c不需要模板，D错误。
2．(学业水平一、二)在核酸分子杂交技术中，常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)。为了获得B链作探针，可应用PCR技术进行扩增，应选择的引物种类是( )A．引物1与引物2 B．引物3与引物4C．引物2与引物3 D．引物1与引物4
解析：要获得B链，则需要获得引物之间的DNA片段，根据PCR中子链延伸方向为5′到3′，故需选择引物2与引物3进行扩增，选C。
3．(学业水平三、四)利用PCR技术将某小段DNA分子扩增n代，需( )A．测定DNA片段两端的核苷酸序列，以便设计引物对B．2n－1对引物参与子代DNA分子的合成C．向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶等D．保持反应体系温度恒定，确保扩增的正常进行
解析：利用PCR技术扩增DNA时需要引物的参与，因此需要测定DNA分子两端的核苷酸序列，以便设计引物对，A正确；DNA分子复制方式为半保留复制，因此2n－1对引物参与子代DNA分子的合成，B错误；PCR技术中双链DNA解开不需要解旋酶，且PCR扩增DNA分子是在较高温度下进行的，因此需要耐高温的DNA聚合酶，C错误；PCR扩增的过程为高温变性、低温复性、中温延伸，可见整个过程中并不是保持恒温，D错误。
4．(学业水平三、四，不定项选择)新冠疫情的快速控制，离不开政府的科学决策和我国对新冠病毒(RNA病毒)的快速检测能力。荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接受到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。Ct值(循环阈值)的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
下列说法正确的是( )A．检测新冠病毒时，需加入逆转录酶将新冠病毒RNA转化为cDNAB．PCR每个循环包括变性、退火(引物和模板结合)、延伸3个阶段C．Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性越高D．若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，检测结果可能为阴性
解析：检测新冠病毒时，需加入逆转录酶将新冠病毒RNA转化为cDNA，才能被检测到，A正确；PCR每个循环包括变性(解开双链)、退火(引物和模板结合)、延伸(Taq酶作用)3个阶段，B正确；Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越少，患者危险性越低，C错误；若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，则逆转录无法得到相应DNA，检测结果可能为阴性，D正确。
学习主题二 基因表达载体的构建活动1 阅读教材P80内容，思考并回答下列问题：1．培育转基因生物的核心工作是什么？构建基因表达载体的目的是什么？
提示：培育转基因生物的核心工作是基因表达载体的构建。构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
2．作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么基因表达载体中还需要加入启动子、终止子、标记基因等元件？ 3．为什么不直接把目的基因导入受体细胞，而要用载体？
提示：不可以。启动子是RNA聚合酶的识别和结合部位，能驱动基因转录出mRNA；终止子让转录在需要的地方停下来；标记基因用来鉴别受体细胞中是否含有目的基因。
提示：游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。
活动2 阅读下列材料，思考回答下列问题：普通番茄细胞中含有多聚半乳糖醛酸酶基因，控制细胞产生多聚半乳糖醛酸酶，该酶能破坏细胞壁，使番茄软化，不耐储藏。科学家将抗多聚半乳糖醛酸酶基因导入番茄细胞，培育出了抗软化、保鲜时间长的转基因番茄。抗多聚半乳糖醛酸酶基因导入受体细胞之前，需构建基因表达载体，图1、2表示为质粒及目的基因所在DNA片段，图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。
1．构建基因表达载体时，能不能使用SmaⅠ切割外源DNA和质粒？请说明理由。 2．构建基因表达载体时，可用EcRⅠ同时切割质粒和外源DNA，请分析使用该酶可能会存在哪些问题？如何避免这些问题。
提示：不能。SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因。
提示：可能导致自身环化、目的基因不能定向连接等问题，为避免以上问题出现，应使用BamHⅠ和Hind Ⅲ(或EcRⅠ和Hind Ⅲ)两种限制酶。
[易错警示]基因表达载体易错点剖析(1)基因工程中的基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。(2)目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。(3)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶。如果两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
[教材延伸]目的基因是否导入受体细胞中还需要有标记基因作为筛选标记。一般情况下，质粒载体有1～2个标记基因，为受体细胞提供易于检测的表型特征。由于构建基因表达载体的目的不同，需要的标记基因也不同。有的标记基因是质粒上固有的，有的标记基因是人为加上去的。
1.基因表达载体的构建
2．基因表达载体构建时有关限制酶的选择选择限制酶时要考虑目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类①应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ。②不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma Ⅰ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的酶切位点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类①所选限制酶与切割目的基因的限制酶一般相同，以确保具有相同的黏性末端。②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶应不能切割质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，用于重组DNA的鉴定和选择。如图乙中质粒不能使用限制酶Sma Ⅰ切割，因为会破坏标记基因。
3．基因表达载体中启动子、终止子的来源(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子。在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。(2)如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
4．启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别
1．(学业水平一、二)下列哪项不是基因表达载体的组成部分( )A．启动子 B．终止密码子C．标记基因 D．目的基因
解析：基因表达载体的组成为目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因等。终止子位于基因的下游，是一段有特殊序列结构的DNA片段，可使转录在所需要的地方停止；终止密码子是mRNA上3个相邻的碱基，使翻译过程在相应的地方停止。
2．(学业水平一、二)在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要( )①DNA连接酶 ②限制性内切核酸酶 ③RNA聚合酶 ④具有标记基因的质粒 ⑤目的基因 ⑥四种脱氧核苷酸A．③⑥ B．②④C．①⑤ D．①②④
解析：构建重组质粒时，首先要用限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和质粒，其次需要用DNA连接酶将目的基因与质粒连接；RNA聚合酶催化转录过程，获得重组质粒时不需要RNA聚合酶；获得重组质粒时，需要具有标记基因的质粒作为载体；重组质粒是由目的基因与质粒形成的；四种脱氧核苷酸是合成DNA的原料，获得重组质粒不需要四种脱氧核苷酸。
3．(学业水平三、四)如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的该基因与该质粒重组，则扩增的该基因两端需分别引入哪两种限制酶的识别序列( )A.NdeⅠ和BamHⅠ B．NdeⅠ和XbaⅠC．XbaⅠ和BamHⅠD．EcRⅠ和KpnⅠ
解析：构建基因表达载体时应将目的基因插入启动子和终止子之间。由题图可知，启动子与终止子之间存在三种限制酶切点，但XbaⅠ在质粒上有两个切割位点，因此为使PCR扩增的该基因能准确插入启动子与终止子之间，扩增时该基因两端需分别引入NdeⅠ和BamHⅠ两种限制酶的识别序列。
4．(学业水平三、四)下列对基因工程中基因表达载体的叙述，错误的是( )A．基因表达载体上的标记基因不一定是抗生素抗性基因B.基因表达载体的构建是基因工程的核心C．基因表达载体中一定不含有起始密码子和终止密码子D．基因表达载体的构建需要使用限制性内切核酸酶和DNA聚合酶等特殊工具
解析：基因表达载体上的标记基因可以是抗性基因或荧光蛋白基因等。基因表达载体一般包含启动子、目的基因、标记基因、终止子等结构，起始密码子和终止密码子位于mRNA上。构建基因表达载体时，需要使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶，不需要DNA聚合酶。
学习主题三 将目的基因导入受体细胞活动1 阅读下图，思考回答下列问题：
1．农杆菌向植物细胞移动的原因是什么？ 2．将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？
提示：当双子叶植物或裸子植物细胞受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类物质，吸引农杆菌移向这些细胞。
提示：基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感受态，利于重组质粒的导入。
3．在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上？ 4．农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。
提示：农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。
提示：能，可从双子叶植物中提取该化合物，再用该化合物处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。
活动2 思考并回答下列问题：1．用花粉管通道法导入受体细胞的目的基因是否需要和载体结合？试分析原因。 2．为什么动物的体细胞一般不作为受体细胞？
提示：需要。因为目的基因只有和载体结合成基因表达载体才容易在受体细胞中稳定维持和表达。
提示：动物体细胞全能性受到限制，不能发育为一个新个体。
3．为什么微生物细胞适合作为基因工程的受体细胞？但若通过基因工程生产人的糖蛋白，从细胞器的功能分析是否可用大肠杆菌作为受体细胞呢？ 4．将目的基因导入动物细胞的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？
提示：微生物细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少的优点。不可以用大肠杆菌作为生产人糖蛋白的受体细胞，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。
提示：还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物体。
[易错警示]1．在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。2．微生物细胞作为受体细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等优点。将基因表达载体(重组质粒)导入微生物细胞的常用方法是Ca2＋处理法(感受态细胞法)。3．农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的TDNA的中间部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的TDNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。
1.转化目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(1)此处的“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同。(2)导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。
3.受体细胞的选择(1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。(2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。(3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌有优势。
4．目的基因在受体细胞中的位置不同会引起遗传上的差别
(1)图中a细胞分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因(如花粉)。(2)图中b在进行细胞分裂时，细胞核中的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，细胞中目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
1．(学业水平一、二)将目的基因导入大豆茎尖分生区细胞和小鼠受精卵，常用的方法分别是( )A．显微注射法、农杆菌转化法B．显微注射法、花粉管通道法C．农杆菌转化法、显微注射法D．花粉管通道法、显微注射法
解析：大豆是双子叶植物，农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物细胞常用的方法；显微注射法是将目的基因导入动物受精卵最常用的方法。
2．(学业水平一、二)下列关于目的基因导入受体细胞的叙述，不正确的是( )A．利用花粉管通道法将目的基因导入动物细胞的方法最为有效B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法C．大肠杆菌最常用的转化方法是：使细胞的生理状态发生改变D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
解析：目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射技术，此方法最为有效；大肠杆菌细胞最常用的转化方法是用钙离子处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，从而完成转化过程。
3．(学业水平一、二)科学家采用基因工程技术将矮牵牛中控制蓝色色素合成的基因G转移到玫瑰中，以培育蓝玫瑰。下列操作正确的是( )A．将基因G直接导入土壤农杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞B．将基因G导入玫瑰细胞后，即可通过植物组织培养培育出蓝玫瑰C．提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得DNA，再扩增基因GD．将基因G导入玫瑰细胞液泡中，防止其经花粉进入野玫瑰
解析：目的基因需要和载体连接形成重组质粒后再导入农杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞，A错误；将基因G导入玫瑰细胞后，还要检测和筛选出含有目的基因的受体细胞，然后再通过植物组织培养培育出蓝玫瑰，B错误；提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录得到DNA，然后扩增，可获得大量的基因G，方法为逆转录法，C正确；细胞液泡中不含基因，因此不能将基因G导入液泡中，可将基因G导入叶绿体或线粒体中，这样可防止其经花粉进入野玫瑰，D错误。
4．(学业水平三、四，不定项选择)下图表示培育转基因抗病毒农作物的过程示意图。下列叙述正确的是( )A．过程a需要限制酶和DNA连接酶的参与B．过程b需要用CaCl2处理，以提高农作物细胞壁的通透性C．抗病毒基因一旦整合到农作物细胞的染色体上，就能正常表达D．转基因抗病毒农作物是否培育成功可通过接种特定病毒进行鉴定
解析：题图中过程a为构建基因表达载体，需要用到限制酶和DNA连接酶，A正确；CaCl2处理只是提高农杆菌(原核细胞)细胞壁的通透性，B错误；植物抗病毒基因整合到农作物细胞的染色体上，不一定能表达，C错误；转基因抗病毒农作物是否培育成功可通过接种特定病毒，观察农作物是否被感染来进行鉴定，D正确。
学习主题四 目的基因的检测与鉴定活动1 目的基因在受体细胞内能够维持稳定和表达其遗传特性，需要逐步进行检测。思考回答下列问题：1．从分子水平上采用________技术，目的是要检测什么？ 2．检测目的基因是否翻译成蛋白质，采用________法。具体做法又如何？
提示：PCR 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA。
提示：抗原—抗体杂交 从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。
活动2 下图为抗虫棉的接种实验，结合图示(左图为抗虫转基因棉使虫体发育不正常)探究以下问题：1．判断抗虫棉的接种实验属于_____________鉴定。2．检测方法是______________，观察指标是___________。
[易错提醒]1．基因工程操作过程中碱基互补配对现象基因工程操作过程中只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有碱基互补配对现象；第一步筛选与获取目的基因，用人工合成、PCR获取或基因文库获取，三种常用方法都涉及碱基互补配对；第二步基因表达载体的构建中DNA连接酶连接目的基因与质粒载体，第四步利用PCR技术检测的方法检测(DNA、mRNA)，也都存在碱基互补配对现象。2．不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。
1.操作目的目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作，也是检查基因工程是否操作成功的一步。
2．目的基因的检测与鉴定归纳
3．目的基因的检测与鉴定的方法比较
4.常见不同转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法个体水平的鉴定实际上是检测目的基因是否表达出所控制的性状，不同的转基因生物检测方法不同。
1．(学业水平一、二)转基因抗虫棉培育过程中，下列有关目的基因检测与鉴定方法的叙述，错误的是( )A．检测抗虫基因是否导入——农杆菌转化法B．检测抗虫基因是否转录——PCR技术C．检测抗虫基因是否翻译——抗原—抗体杂交D．检测抗虫蛋白生物功能——抗虫接种实验
解析：农杆菌转化法是将抗虫基因导入植物细胞的方法，不能用于检测目的基因是否导入受体细胞，A错误；可用PCR技术检测抗虫基因是否转录出mRNA，B正确；检测目的基因是否翻译成蛋白质，常用抗原—抗体杂交，C正确；检测抗虫蛋白生物功能，可在个体水平上进行抗虫接种实验，D正确。
2．(学业水平一、二) 将鱼的抗冻蛋白基因导入番茄，有效地提高了番茄的耐寒能力。能最终鉴定转基因番茄培育是否成功的方法是( )A．在试验田中观察番茄的耐寒能力B．检测番茄的体细胞中是否存在鱼的抗冻蛋白C．检测鱼的抗冻蛋白基因是否转录出了mRNAD．检测番茄体细胞中是否有鱼的抗冻蛋白基因
解析：在试验田中观察番茄的耐寒能力是在个体水平上的鉴定，也是最终鉴定转基因番茄培育是否成功的方法，A项正确；检测番茄的体细胞中是否存在鱼的抗冻蛋白，是检测目的基因是否翻译，B项错误；检测鱼的抗冻蛋白基因是否转录出了mRNA，是检测目的基因是否转录，C项错误；检测番茄体细胞中是否有鱼的抗冻蛋白基因，是检测目的基因是否导入受体细胞，D项错误。
3．(学业水平三、四，不定项选择)目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定与检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是( )A．检测受体细胞中是否有目的基因B．检测受体细胞中是否有致病基因C.检测目的基因是否转录出了mRNAD．检测目的基因是否翻译成蛋白质
解析：目的基因的分子检测包括三个方面：①检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，方法是采用PCR技术；②检测目的基因是否转录出了相应的mRNA，方法是采用PCR技术；③检测目的基因是否翻译成了相应的蛋白质，常用的方法是抗原—抗体杂交。
4．(学业水平三、四)研究者将含有乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因的DNA片段分别制成探针，与从转基因奶牛的乳腺细胞、口腔上皮细胞、蹄部细胞中提取的mRNA分别进行杂交，结果如下表所示。下列叙述正确的是( )A.乳铁蛋白肽基因可在转基因奶牛的多种体细胞中表达B．人干扰素基因可在转基因奶牛的多种体细胞中表达C．表中两种基因探针所含的脱氧核苷酸的序列相同D．乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因都是mRNA片段
解析：据表分析可知，牛乳铁蛋白肽基因探针只在乳腺细胞出现了杂交带，即只在乳腺细胞中表达，A错误；据表格信息：人干扰素基因探针在三种细胞中都出现了杂交带，说明该基因可以在转基因奶牛的全身多种细胞中表达，B正确；表中两种基因探针所含的脱氧核苷酸的序列不同，才会出现不同的杂交结果，C错误；乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因都是特定的DNA片段，D错误。
强化落实·学业达标——归纳·提升·素养
高效课堂·实践运用——随堂·巩固·达标1.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是( )A．人工合成基因B．目的基因与载体结合C．将目的基因导入受体细胞D．目的基因的检测和表达
解析：人工合成基因需要碱基互补配对，A不符合题意；目的基因与载体结合需要碱基互补配对，B不符合题意；将目的基因导入受体细胞不需要碱基互补配对，C符合题意；目的基因的检测和表达需要碱基互补配对，D不符合题意。
2．基因工程步骤不包括( )A．对染色体进行改造B．目的基因与载体结合C．将目的基因导入受体细胞D．目的基因的检测与鉴定
解析：目的基因提取，没有对染色体改造，A错误；目的基因与载体结合，B正确；将目的基因导入受体细胞，C正确；目的基因的检测与鉴定，D正确。
3．实验室常用PCR技术对DNA进行体外扩增，下列相关叙述正确的是( )A．95 ℃时DNA的磷酸二酯键断开B．引物与模板结合后向5′方向延伸C．反应过程包括变性→复性→延伸D．需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
解析：95 ℃时DNA的氢键断开，A错误；引物与模板结合后向3′方向延伸，B错误；反应过程包括变性→复性→延伸，C正确；PCR技术通过高温解旋，不需要解旋酶，D错误。
4．微生物常被用于基因工程中。下列相关叙述正确的是( )A．从耐热的细菌中获取PCR技术所需的DNA连接酶B．大肠杆菌、酵母菌等是基因工程常用的载体C．作为载体的DNA分子需具有合成抗生素的基因D．常利用土壤农杆菌将目的基因导入植物细胞
解析：从耐热的细菌中可获取PCR技术所需的DNA聚合酶，A错误；大肠杆菌、酵母菌等是基因工程常用的受体细胞，B错误；作为载体的DNA分子一般具有抗生素抗性基因或荧光蛋白基因作为标记基因，C错误；将目的基因导入受体细胞常用农杆菌转化法，D正确。
5．科学家通过基因工程方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其过程大致如下图所示。根据题意，回答下列问题：
(1)基因工程的操作程序主要包括的四个步骤是：________________、_________________、____________________、___________________。(2)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T－DNA，把目的基因插入Ti质粒的T－DNA中是利用T－DNA__________________________________________的特点。(3)Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内并成功实现表达的过程，在基因工程中称为________。(4)将目的基因导入受体细胞的方法有很多种，该题中涉及的是_____________。(5)目的基因能否在棉株体内稳定维持和表达其遗传特性的关键是____________________________________，这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是__________。
将目的基因导入受体细胞
可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上
目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA上
解析：农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法，利用它能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，以及其Ti质粒上的T－DNA能转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上的特点，可以把目的基因插入其Ti质粒的T－DNA中，借助其作用使目的基因成功导入受体细胞。
疑难解答·名师指津——释疑·解惑·教材(一)从社会中来提示：参见本节正文中的内容。(二)旁栏思考题1．提示：mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNADNA杂交分子；第二步，核酸酶H降解RNADNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子(如图)。
2．提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体植物。
(三)到社会中去1．提示：这是一个开放性的问题，需要学生查找资料来回答。随着田间监测数据的更新及新的科研论文发表，每年学生获得的证据是不一样的。例如，科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。教师要注意引导学生搜集科学、可靠的证据，如科研论文、权威的官方报道等。
2．提示：科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。(1)基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性，包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
(2)田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%～30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高粱、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境。始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。(3)国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全性评价等。
(四)练习与应用概念检测1．(1)√ (2)× (3)×2．D拓展应用提示：外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
知识梳理·填准记牢——自主·预习·先知知识点一 目的基因的筛选与获取1．目的基因(1)概念：用于改变____________或获得____________等的基因。(2)实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是______________。2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的________和________的基因中进行筛选。(2)实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的________，也对Bt基因的表达产物——____________有了较为深入的了解。(3)认识基因结构和功能的技术方法：________技术、________数据库、________工具。
3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是________________的缩写，它是一项根据____________的原理，在体外提供____________的各种组分与反应条件，对__________________进行大量复制的技术。(2)条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种________、4种___________、________________。
(3)过程：①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA________________。②复性：温度下降到50 ℃左右时，________通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中的______________在耐高温的____________的作用下加到引物的____端合成子链。④重复循环多次。(4)结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即呈________形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环的次数)。
知识点二 基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的(1)使目的基因在受体细胞中__________，并且可以________给下一代。(2)使目的基因能够________和发挥作用。
2．基因表达载体的组成
3．基因表达载体的构建首先用一定的________切割载体，使它出现一个切口，然后用________限制酶或______________的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，再利用__________将目的基因片段拼接到载体的切口处。
知识点三 将目的基因导入受体细胞1．转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内________和________的过程。2．目的基因导入受体细胞的方法(1)目的基因导入植物细胞①花粉管通道法a．用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入________中。b．在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助____________进入________。
②农杆菌转化法a．农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染________植物和________植物；农杆菌的Ti质粒上的________能够整合到所侵染细胞的___________上。b.转化方法：将目的基因插入农杆菌______________中，让农杆菌侵染植物细胞。
(2)目的基因导入动物细胞①常用方法：________法。②常用受体细胞：________。(3)目的基因导入微生物细胞①方法：用________处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将重组表达载体导入其中。②常用受体细胞：原核生物(使用最广泛的是大肠杆菌)。
知识点四 目的基因的检测与鉴定1．分子水平检测(1)通过________等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。(2)从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行__________杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。2．个体水平鉴定包括抗虫、抗病的________实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。
知识应用·强化落实——效果·检测·定向判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)1．如果某种生物的cDNA文库中的某个基因与该生物的基因组文库中的某个基因控制的性状相同，则这两个基因的结构也完全相同。( )2．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶。( )
× 提示：cDNA文库中的基因一般没有启动子和内含子序列，而基因组文库含有。
× 提示：Taq酶是热稳定DNA聚合酶。
3．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用。( )4．利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞。( )5．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。( )
× 提示：终止密码子位于mRNA上，在翻译过程中起作用。
× 提示：利用DNA分子杂交的目的是检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因。
× 提示：抗虫效果的鉴定要在个体生物学水平上做抗虫接种实验来鉴定。
6．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得。( )7．将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。( )8．从大肠杆菌细胞中获得人胰岛素基因的mRNA，说明目的基因完成了表达。( )
× 提示：人肝细胞中不含胰岛素基因的mRNA。
× 提示：获得人胰岛素基因的mRNA，只能说明目的基因完成了转录。
课程标准阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。 素养达成1.结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。(科学思维)2．针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。(科学探究)
设疑激趣我国是棉花生产和消费的大国。棉花在种植过程中，常常会受到一些害虫的侵袭，其中以棉铃虫最为常见。棉铃虫可以使棉花产量减少三分之一，严重时，甚至能使一片棉田绝收。大量施用农药杀虫不仅会提高生产成本，还可能造成农产品和环境的污染。要是能培育出自身就能抵抗虫害的棉花新品种，这一问题就会迎刃而解，我国拥有自主知识产权的转基因抗虫棉就是在这样的背景下产生的。为什么传统的杂交育种方法培育不出抗虫棉，基因工程却可以呢？基因工程是如何进行操作的？它给我们的生产和生活带来了怎样的影响？
夯基提能·分层突破——互动·探究·智涂学习主题一 目的基因的筛选与获取活动1 阅读下列材料，思考并回答下列问题：巴西等拉美国家深受致倦库蚊的危害。致倦库蚊可携带多种病毒和寄生虫，能够传播脑炎、丝虫等传染病，而这些传染病常年在拉美国家肆虐。为了抑制疾病的传播，科学家培育出了一种转基因雄性致倦库蚊。科学家在雄性致倦库蚊体内植入一种特殊基因，当具有该基因的雄蚊与野生雌蚊交配时，这种基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从而达到减少该种蚊子的数量，抑制疾病传播的目的。
1．该项研究的目的基因是什么？其作用是什么？ 2．利用PCR技术扩增该特殊基因需要提供哪些条件？
提示：植入雄性致倦库蚊体内的一种特殊基因是该项研究的目的基因。该基因可以进入雌蚊的基因组，并使雌蚊死亡，从而减少该种蚊子的数量，抑制疾病传播。
提示：需要模板、酶、原料、引物以及适宜的温度和pH等条件。即以DNA两条链为模板，在耐高温的DNA聚合酶的作用下，4种脱氧核苷酸(A、T、C、G)作为合成子链的原料，从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。反应过程中，缓冲溶液维持反应的pH，并保证变性、复性和延伸需要的适宜温度。
3．什么是引物？PCR过程中为什么需要引物？ 4．PCR过程中两种引物的碱基序列能否互补？说明理由。
提示：引物是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始序列，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。存在于自然界中生物的DNA复制和人工合成中的多聚酶链式反应(PCR)之所以需要引物，是因为在DNA合成时DNA聚合酶只能从5′端到3′端合成子链。
提示：不能。因为两种引物分别与两个DNA单链的3′端互补结合，而DNA的两条单链的3′端碱基序列往往不同，如果2种引物的碱基序列互补那么会影响引物与DNA单链的结合。
5．如果在某基因组定位了一个目的基因X，但是其核苷酸序列未知，现已知X邻近区域的上、下游的部分DNA序列，此时如何设计引物？
提示：虽然目的基因X的核苷酸序列未知，但X临近区域的上、下游的部分DNA序列已知，因此可根据X临近区域的上、下游已知序列设计引物。
活动2 阅读下列材料，思考回答下列问题：实时荧光RT－PCR(逆转录PCR)在诊断新型冠状病毒感染中发挥着关键作用，该方法是提取检测者的mRNA在试剂盒中逆(反)转录出cDNA，并大量扩增，同时利用盒中荧光标记的新型冠状病毒核酸探针来检测PCR产物中是否含有新型冠状病毒的cDNA，在检测过程中，随着PCR的进行，反应产物不断累积，“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加，可通过荧光强度的变化监测产物量的变化。
1．请根据信息分析“荧光RT－PCR技术”所用的试剂盒中应含有哪些物质？ 2．在检测过程中，若有荧光标记的“杂交双链”出现，则说明检测结果呈阳性，荧光强度能否一直增强？请说明理由。
提示：检测者的mRNA、耐高温的DNA聚合酶、荧光标记的新型冠状病毒核酸探针、逆(反)转录酶、引物、4种脱氧核苷酸、缓冲液等。
提示：不能。试剂盒中所加入的引物数量一定。
[总结归纳]目的基因获取方法的选择(1)如果不知道目的基因的核苷酸序列，可以通过构建基因文库的方法，即通过用受体菌储存并扩增目的基因后，从基因文库中获取目的基因。(2)如果知道目的基因的核苷酸序列，而且基因比较小，可通过DNA合成仪利用化学方法人工合成。(3)如果只知道待扩增目的基因的两端的核苷酸序列，而且基因又比较大，则可通过PCR技术扩增目的基因。
[易错警示]PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA片段要长，从第三次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种引物。
1.筛选合适的目的基因从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
2．从基因文库中获取目的基因(1)基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。(2)基因文库的种类①基因组文库：包含一种生物所有的基因。②部分基因文库：只包含一种生物的一部分基因，如cDNA文库。说明：用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库。
(3)从基因文库中获取目的基因的方法根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。
3．利用PCR技术扩增目的基因(1)PCR技术：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。(2)PCR原理：DNA半保留复制。(3)前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列(以便根据这一序列合成引物)。
(4)扩增过程：目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在耐高温的DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环多次。如图所示。
注意：利用PCR技术扩增目的基因可以在PCR扩增仪中自动完成。提醒：①在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
4．用化学方法人工合成目的基因(1)条件：基因比较小，且核苷酸序列已知。(2)仪器：DNA合成仪。
5．PCR技术扩增与DNA复制的比较
1．(学业水平一、二)如图为基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。相关叙述中正确的是( )A．这三种方法都是在体内进行的B．①②③碱基对的数量和排列顺序相同C．方法a和c均用到DNA聚合酶D．方法c需要模板
解析：题中三种方法都是在体外进行的，且都用到酶(方法a需要反转录酶和DNA聚合酶，方法b需要限制酶，方法c需要DNA聚合酶)，A错误、C正确。方法a得到的目的基因不含有内含子，方法c得到的目的基因的碱基序列可能有多种，因此①②③碱基对的数量和排列顺序不相同，B错误。方法c不需要模板，D错误。
2．(学业水平一、二)在核酸分子杂交技术中，常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针(探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段)。为了获得B链作探针，可应用PCR技术进行扩增，应选择的引物种类是( )A．引物1与引物2 B．引物3与引物4C．引物2与引物3 D．引物1与引物4
解析：要获得B链，则需要获得引物之间的DNA片段，根据PCR中子链延伸方向为5′到3′，故需选择引物2与引物3进行扩增，选C。
3．(学业水平三、四)利用PCR技术将某小段DNA分子扩增n代，需( )A．测定DNA片段两端的核苷酸序列，以便设计引物对B．2n－1对引物参与子代DNA分子的合成C．向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶等D．保持反应体系温度恒定，确保扩增的正常进行
解析：利用PCR技术扩增DNA时需要引物的参与，因此需要测定DNA分子两端的核苷酸序列，以便设计引物对，A正确；DNA分子复制方式为半保留复制，因此2n－1对引物参与子代DNA分子的合成，B错误；PCR技术中双链DNA解开不需要解旋酶，且PCR扩增DNA分子是在较高温度下进行的，因此需要耐高温的DNA聚合酶，C错误；PCR扩增的过程为高温变性、低温复性、中温延伸，可见整个过程中并不是保持恒温，D错误。
4．(学业水平三、四，不定项选择)新冠疫情的快速控制，离不开政府的科学决策和我国对新冠病毒(RNA病毒)的快速检测能力。荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当Taq酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接受到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。Ct值(循环阈值)的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
下列说法正确的是( )A．检测新冠病毒时，需加入逆转录酶将新冠病毒RNA转化为cDNAB．PCR每个循环包括变性、退火(引物和模板结合)、延伸3个阶段C．Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性越高D．若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，检测结果可能为阴性
解析：检测新冠病毒时，需加入逆转录酶将新冠病毒RNA转化为cDNA，才能被检测到，A正确；PCR每个循环包括变性(解开双链)、退火(引物和模板结合)、延伸(Taq酶作用)3个阶段，B正确；Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越少，患者危险性越低，C错误；若样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，则逆转录无法得到相应DNA，检测结果可能为阴性，D正确。
学习主题二 基因表达载体的构建活动1 阅读教材P80内容，思考并回答下列问题：1．培育转基因生物的核心工作是什么？构建基因表达载体的目的是什么？
提示：培育转基因生物的核心工作是基因表达载体的构建。构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
2．作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么基因表达载体中还需要加入启动子、终止子、标记基因等元件？ 3．为什么不直接把目的基因导入受体细胞，而要用载体？
提示：不可以。启动子是RNA聚合酶的识别和结合部位，能驱动基因转录出mRNA；终止子让转录在需要的地方停下来；标记基因用来鉴别受体细胞中是否含有目的基因。
提示：游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。
活动2 阅读下列材料，思考回答下列问题：普通番茄细胞中含有多聚半乳糖醛酸酶基因，控制细胞产生多聚半乳糖醛酸酶，该酶能破坏细胞壁，使番茄软化，不耐储藏。科学家将抗多聚半乳糖醛酸酶基因导入番茄细胞，培育出了抗软化、保鲜时间长的转基因番茄。抗多聚半乳糖醛酸酶基因导入受体细胞之前，需构建基因表达载体，图1、2表示为质粒及目的基因所在DNA片段，图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。
1．构建基因表达载体时，能不能使用SmaⅠ切割外源DNA和质粒？请说明理由。 2．构建基因表达载体时，可用EcRⅠ同时切割质粒和外源DNA，请分析使用该酶可能会存在哪些问题？如何避免这些问题。
提示：不能。SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因。
提示：可能导致自身环化、目的基因不能定向连接等问题，为避免以上问题出现，应使用BamHⅠ和Hind Ⅲ(或EcRⅠ和Hind Ⅲ)两种限制酶。
[易错警示]基因表达载体易错点剖析(1)基因工程中的基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。(2)目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。(3)切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶。如果两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
[教材延伸]目的基因是否导入受体细胞中还需要有标记基因作为筛选标记。一般情况下，质粒载体有1～2个标记基因，为受体细胞提供易于检测的表型特征。由于构建基因表达载体的目的不同，需要的标记基因也不同。有的标记基因是质粒上固有的，有的标记基因是人为加上去的。
1.基因表达载体的构建
2．基因表达载体构建时有关限制酶的选择选择限制酶时要考虑目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点及是否破坏目的基因和标记基因来确定限制酶的种类。
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类①应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ。②不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择Sma Ⅰ。③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的酶切位点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类①所选限制酶与切割目的基因的限制酶一般相同，以确保具有相同的黏性末端。②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶应不能切割质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，用于重组DNA的鉴定和选择。如图乙中质粒不能使用限制酶Sma Ⅰ切割，因为会破坏标记基因。
3．基因表达载体中启动子、终止子的来源(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子。在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。(2)如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
4．启动子和起始密码子、终止子和终止密码子的区别
1．(学业水平一、二)下列哪项不是基因表达载体的组成部分( )A．启动子 B．终止密码子C．标记基因 D．目的基因
解析：基因表达载体的组成为目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因等。终止子位于基因的下游，是一段有特殊序列结构的DNA片段，可使转录在所需要的地方停止；终止密码子是mRNA上3个相邻的碱基，使翻译过程在相应的地方停止。
2．(学业水平一、二)在基因工程的操作过程中，获得重组质粒不需要( )①DNA连接酶 ②限制性内切核酸酶 ③RNA聚合酶 ④具有标记基因的质粒 ⑤目的基因 ⑥四种脱氧核苷酸A．③⑥ B．②④C．①⑤ D．①②④
解析：构建重组质粒时，首先要用限制性内切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和质粒，其次需要用DNA连接酶将目的基因与质粒连接；RNA聚合酶催化转录过程，获得重组质粒时不需要RNA聚合酶；获得重组质粒时，需要具有标记基因的质粒作为载体；重组质粒是由目的基因与质粒形成的；四种脱氧核苷酸是合成DNA的原料，获得重组质粒不需要四种脱氧核苷酸。
3．(学业水平三、四)如图为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的该基因与该质粒重组，则扩增的该基因两端需分别引入哪两种限制酶的识别序列( )A.NdeⅠ和BamHⅠ B．NdeⅠ和XbaⅠC．XbaⅠ和BamHⅠD．EcRⅠ和KpnⅠ
解析：构建基因表达载体时应将目的基因插入启动子和终止子之间。由题图可知，启动子与终止子之间存在三种限制酶切点，但XbaⅠ在质粒上有两个切割位点，因此为使PCR扩增的该基因能准确插入启动子与终止子之间，扩增时该基因两端需分别引入NdeⅠ和BamHⅠ两种限制酶的识别序列。
4．(学业水平三、四)下列对基因工程中基因表达载体的叙述，错误的是( )A．基因表达载体上的标记基因不一定是抗生素抗性基因B.基因表达载体的构建是基因工程的核心C．基因表达载体中一定不含有起始密码子和终止密码子D．基因表达载体的构建需要使用限制性内切核酸酶和DNA聚合酶等特殊工具
解析：基因表达载体上的标记基因可以是抗性基因或荧光蛋白基因等。基因表达载体一般包含启动子、目的基因、标记基因、终止子等结构，起始密码子和终止密码子位于mRNA上。构建基因表达载体时，需要使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶，不需要DNA聚合酶。
学习主题三 将目的基因导入受体细胞活动1 阅读下图，思考回答下列问题：
1．农杆菌向植物细胞移动的原因是什么？ 2．将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？
提示：当双子叶植物或裸子植物细胞受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量酚类物质，吸引农杆菌移向这些细胞。
提示：基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感受态，利于重组质粒的导入。
3．在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，为什么一定要将目的基因插入Ti质粒的T－DNA上？ 4．农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物和裸子植物的一种方法，原因是双子叶植物和裸子植物能够产生一种吸引农杆菌的化学物质，而单子叶植物不能产生这种物质，能不能利用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物？说明原因。
提示：农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞的染色体DNA上。
提示：能，可从双子叶植物中提取该化合物，再用该化合物处理单子叶植物细胞，然后就可用农杆菌转化法将目的基因导入单子叶植物细胞。
活动2 思考并回答下列问题：1．用花粉管通道法导入受体细胞的目的基因是否需要和载体结合？试分析原因。 2．为什么动物的体细胞一般不作为受体细胞？
提示：需要。因为目的基因只有和载体结合成基因表达载体才容易在受体细胞中稳定维持和表达。
提示：动物体细胞全能性受到限制，不能发育为一个新个体。
3．为什么微生物细胞适合作为基因工程的受体细胞？但若通过基因工程生产人的糖蛋白，从细胞器的功能分析是否可用大肠杆菌作为受体细胞呢？ 4．将目的基因导入动物细胞的受体细胞除了受精卵外，还可以选择什么细胞？
提示：微生物细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少的优点。不可以用大肠杆菌作为生产人糖蛋白的受体细胞，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。
提示：还可以将目的基因导入胚胎干细胞，因为胚胎干细胞也能发育成动物体。
[易错警示]1．在将目的基因导入受体细胞之前，都必须进行基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不是直接导入目的基因。2．微生物细胞作为受体细胞具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等优点。将基因表达载体(重组质粒)导入微生物细胞的常用方法是Ca2＋处理法(感受态细胞法)。3．农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的TDNA的中间部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的TDNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。
1.转化目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。(1)此处的“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同。(2)导入的目的基因，可能存在于细胞质中，也可能整合到染色体DNA上。
3.受体细胞的选择(1)对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有全能性。(2)对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性高，而高度分化的动物体细胞的全能性受到抑制。(3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以在生产需要加工和分泌的蛋白质时，酵母菌比大肠杆菌有优势。
4．目的基因在受体细胞中的位置不同会引起遗传上的差别
(1)图中a细胞分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因(如花粉)。(2)图中b在进行细胞分裂时，细胞核中的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，细胞中目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。
1．(学业水平一、二)将目的基因导入大豆茎尖分生区细胞和小鼠受精卵，常用的方法分别是( )A．显微注射法、农杆菌转化法B．显微注射法、花粉管通道法C．农杆菌转化法、显微注射法D．花粉管通道法、显微注射法
解析：大豆是双子叶植物，农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物细胞常用的方法；显微注射法是将目的基因导入动物受精卵最常用的方法。
2．(学业水平一、二)下列关于目的基因导入受体细胞的叙述，不正确的是( )A．利用花粉管通道法将目的基因导入动物细胞的方法最为有效B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法C．大肠杆菌最常用的转化方法是：使细胞的生理状态发生改变D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
解析：目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射技术，此方法最为有效；大肠杆菌细胞最常用的转化方法是用钙离子处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，从而完成转化过程。
3．(学业水平一、二)科学家采用基因工程技术将矮牵牛中控制蓝色色素合成的基因G转移到玫瑰中，以培育蓝玫瑰。下列操作正确的是( )A．将基因G直接导入土壤农杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞B．将基因G导入玫瑰细胞后，即可通过植物组织培养培育出蓝玫瑰C．提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录获得DNA，再扩增基因GD．将基因G导入玫瑰细胞液泡中，防止其经花粉进入野玫瑰
解析：目的基因需要和载体连接形成重组质粒后再导入农杆菌，然后感染并转入玫瑰细胞，A错误；将基因G导入玫瑰细胞后，还要检测和筛选出含有目的基因的受体细胞，然后再通过植物组织培养培育出蓝玫瑰，B错误；提取矮牵牛蓝色花的mRNA，经逆转录得到DNA，然后扩增，可获得大量的基因G，方法为逆转录法，C正确；细胞液泡中不含基因，因此不能将基因G导入液泡中，可将基因G导入叶绿体或线粒体中，这样可防止其经花粉进入野玫瑰，D错误。
4．(学业水平三、四，不定项选择)下图表示培育转基因抗病毒农作物的过程示意图。下列叙述正确的是( )A．过程a需要限制酶和DNA连接酶的参与B．过程b需要用CaCl2处理，以提高农作物细胞壁的通透性C．抗病毒基因一旦整合到农作物细胞的染色体上，就能正常表达D．转基因抗病毒农作物是否培育成功可通过接种特定病毒进行鉴定
解析：题图中过程a为构建基因表达载体，需要用到限制酶和DNA连接酶，A正确；CaCl2处理只是提高农杆菌(原核细胞)细胞壁的通透性，B错误；植物抗病毒基因整合到农作物细胞的染色体上，不一定能表达，C错误；转基因抗病毒农作物是否培育成功可通过接种特定病毒，观察农作物是否被感染来进行鉴定，D正确。
学习主题四 目的基因的检测与鉴定活动1 目的基因在受体细胞内能够维持稳定和表达其遗传特性，需要逐步进行检测。思考回答下列问题：1．从分子水平上采用________技术，目的是要检测什么？ 2．检测目的基因是否翻译成蛋白质，采用________法。具体做法又如何？
提示：PCR 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA。
提示：抗原—抗体杂交 从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。
活动2 下图为抗虫棉的接种实验，结合图示(左图为抗虫转基因棉使虫体发育不正常)探究以下问题：1．判断抗虫棉的接种实验属于_____________鉴定。2．检测方法是______________，观察指标是___________。
[易错提醒]1．基因工程操作过程中碱基互补配对现象基因工程操作过程中只有第三步“将目的基因导入受体细胞”没有碱基互补配对现象；第一步筛选与获取目的基因，用人工合成、PCR获取或基因文库获取，三种常用方法都涉及碱基互补配对；第二步基因表达载体的构建中DNA连接酶连接目的基因与质粒载体，第四步利用PCR技术检测的方法检测(DNA、mRNA)，也都存在碱基互补配对现象。2．不论是复制水平、转录水平还是翻译水平的检测，都是在体外进行的。
1.操作目的目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作，也是检查基因工程是否操作成功的一步。
2．目的基因的检测与鉴定归纳
3．目的基因的检测与鉴定的方法比较
4.常见不同转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法个体水平的鉴定实际上是检测目的基因是否表达出所控制的性状，不同的转基因生物检测方法不同。
1．(学业水平一、二)转基因抗虫棉培育过程中，下列有关目的基因检测与鉴定方法的叙述，错误的是( )A．检测抗虫基因是否导入——农杆菌转化法B．检测抗虫基因是否转录——PCR技术C．检测抗虫基因是否翻译——抗原—抗体杂交D．检测抗虫蛋白生物功能——抗虫接种实验
解析：农杆菌转化法是将抗虫基因导入植物细胞的方法，不能用于检测目的基因是否导入受体细胞，A错误；可用PCR技术检测抗虫基因是否转录出mRNA，B正确；检测目的基因是否翻译成蛋白质，常用抗原—抗体杂交，C正确；检测抗虫蛋白生物功能，可在个体水平上进行抗虫接种实验，D正确。
2．(学业水平一、二) 将鱼的抗冻蛋白基因导入番茄，有效地提高了番茄的耐寒能力。能最终鉴定转基因番茄培育是否成功的方法是( )A．在试验田中观察番茄的耐寒能力B．检测番茄的体细胞中是否存在鱼的抗冻蛋白C．检测鱼的抗冻蛋白基因是否转录出了mRNAD．检测番茄体细胞中是否有鱼的抗冻蛋白基因
解析：在试验田中观察番茄的耐寒能力是在个体水平上的鉴定，也是最终鉴定转基因番茄培育是否成功的方法，A项正确；检测番茄的体细胞中是否存在鱼的抗冻蛋白，是检测目的基因是否翻译，B项错误；检测鱼的抗冻蛋白基因是否转录出了mRNA，是检测目的基因是否转录，C项错误；检测番茄体细胞中是否有鱼的抗冻蛋白基因，是检测目的基因是否导入受体细胞，D项错误。
3．(学业水平三、四，不定项选择)目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定与检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是( )A．检测受体细胞中是否有目的基因B．检测受体细胞中是否有致病基因C.检测目的基因是否转录出了mRNAD．检测目的基因是否翻译成蛋白质
解析：目的基因的分子检测包括三个方面：①检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，方法是采用PCR技术；②检测目的基因是否转录出了相应的mRNA，方法是采用PCR技术；③检测目的基因是否翻译成了相应的蛋白质，常用的方法是抗原—抗体杂交。
4．(学业水平三、四)研究者将含有乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因的DNA片段分别制成探针，与从转基因奶牛的乳腺细胞、口腔上皮细胞、蹄部细胞中提取的mRNA分别进行杂交，结果如下表所示。下列叙述正确的是( )A.乳铁蛋白肽基因可在转基因奶牛的多种体细胞中表达B．人干扰素基因可在转基因奶牛的多种体细胞中表达C．表中两种基因探针所含的脱氧核苷酸的序列相同D．乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因都是mRNA片段
解析：据表分析可知，牛乳铁蛋白肽基因探针只在乳腺细胞出现了杂交带，即只在乳腺细胞中表达，A错误；据表格信息：人干扰素基因探针在三种细胞中都出现了杂交带，说明该基因可以在转基因奶牛的全身多种细胞中表达，B正确；表中两种基因探针所含的脱氧核苷酸的序列不同，才会出现不同的杂交结果，C错误；乳铁蛋白肽基因和人干扰素基因都是特定的DNA片段，D错误。
强化落实·学业达标——归纳·提升·素养
高效课堂·实践运用——随堂·巩固·达标1.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是( )A．人工合成基因B．目的基因与载体结合C．将目的基因导入受体细胞D．目的基因的检测和表达
解析：人工合成基因需要碱基互补配对，A不符合题意；目的基因与载体结合需要碱基互补配对，B不符合题意；将目的基因导入受体细胞不需要碱基互补配对，C符合题意；目的基因的检测和表达需要碱基互补配对，D不符合题意。
2．基因工程步骤不包括( )A．对染色体进行改造B．目的基因与载体结合C．将目的基因导入受体细胞D．目的基因的检测与鉴定
解析：目的基因提取，没有对染色体改造，A错误；目的基因与载体结合，B正确；将目的基因导入受体细胞，C正确；目的基因的检测与鉴定，D正确。
3．实验室常用PCR技术对DNA进行体外扩增，下列相关叙述正确的是( )A．95 ℃时DNA的磷酸二酯键断开B．引物与模板结合后向5′方向延伸C．反应过程包括变性→复性→延伸D．需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
解析：95 ℃时DNA的氢键断开，A错误；引物与模板结合后向3′方向延伸，B错误；反应过程包括变性→复性→延伸，C正确；PCR技术通过高温解旋，不需要解旋酶，D错误。
4．微生物常被用于基因工程中。下列相关叙述正确的是( )A．从耐热的细菌中获取PCR技术所需的DNA连接酶B．大肠杆菌、酵母菌等是基因工程常用的载体C．作为载体的DNA分子需具有合成抗生素的基因D．常利用土壤农杆菌将目的基因导入植物细胞
解析：从耐热的细菌中可获取PCR技术所需的DNA聚合酶，A错误；大肠杆菌、酵母菌等是基因工程常用的受体细胞，B错误；作为载体的DNA分子一般具有抗生素抗性基因或荧光蛋白基因作为标记基因，C错误；将目的基因导入受体细胞常用农杆菌转化法，D正确。
5．科学家通过基因工程方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其过程大致如下图所示。根据题意，回答下列问题：
(1)基因工程的操作程序主要包括的四个步骤是：________________、_________________、____________________、___________________。(2)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T－DNA，把目的基因插入Ti质粒的T－DNA中是利用T－DNA__________________________________________的特点。(3)Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内并成功实现表达的过程，在基因工程中称为________。(4)将目的基因导入受体细胞的方法有很多种，该题中涉及的是_____________。(5)目的基因能否在棉株体内稳定维持和表达其遗传特性的关键是____________________________________，这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是__________。
将目的基因导入受体细胞
可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上
目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA上
解析：农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞的常用方法，利用它能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，以及其Ti质粒上的T－DNA能转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体DNA上的特点，可以把目的基因插入其Ti质粒的T－DNA中，借助其作用使目的基因成功导入受体细胞。
疑难解答·名师指津——释疑·解惑·教材(一)从社会中来提示：参见本节正文中的内容。(二)旁栏思考题1．提示：mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNADNA杂交分子；第二步，核酸酶H降解RNADNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子(如图)。
2．提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建。这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体植物。
(三)到社会中去1．提示：这是一个开放性的问题，需要学生查找资料来回答。随着田间监测数据的更新及新的科研论文发表，每年学生获得的证据是不一样的。例如，科研人员对长江流域种植的转基因抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平；2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等并未对转Bt基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒素的连续抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。教师要注意引导学生搜集科学、可靠的证据，如科研论文、权威的官方报道等。
2．提示：科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为以下几个方面。(1)基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性，包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一；现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如CrylAa和CrylAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
(2)田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%～30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花；在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高粱、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境。始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。(3)国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全性评价等。
(四)练习与应用概念检测1．(1)√ (2)× (3)×2．D拓展应用提示：外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
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