备课素材知识点：逆转录病毒载体 高中生物人教版选择性必修3

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基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其构建目的是使目的基因能在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
载体（Vectr）作用，一是用它作为运载工具，将目的基因转移到受体细胞中去；二是利用它在受体细胞内对目的基因进行大量的复制（称为克隆）。最终在受体细胞中表达大量目的基因产物，经分离纯化被人们利用。
作为载体必须具有四个条件：
①在受体细胞中能保存下来并能大量复制；
②有一个至多个限制酶切点，而且每种酶切位点最好只有一个，如大肠杆菌pBR322就有多种限制酶的单一识别位点，可适于多种限制酶切割的DNA插入；
③有一定的标记基因，便于进行筛选。如大肠杆菌的pBR322质粒携带氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，就可以作为筛选的标记基因。
④对受体细胞无害。
一般来说，天然运载体往往不能满足上述要求，因此需要根据不同的目的和需要，对运载体进行人工改建。现今实际所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。
常用的载体主要有两类：
一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于拟核区DNA之外的环状DNA(一般有1～200 kb左右，kb为千碱基对)，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌拟核DNA中，随着拟核DNA的复制而复制。
另一类运载体是噬菌体或某些病毒等。
除以上两类外，人们还在不断寻找新的运载体，如叶绿体或线粒体DNA等也有可能成为运载体。
原因是它们有双链DNA分子，可以与目的基因进行连接。
而目前基因工程中常以逆转录病毒作为载体，其优点是逆转录病毒作为载体时可以将外源基因插入到受体细胞染色体，使外源基因随染色体DNA的复制而复制，并进行表达。
研究发现逆转录病毒基因组（RNA）的核心部分包括三个基因：gag 基因（编码病毒的核心蛋白）、pl基因（编码逆转录酶）、env基因（编码病毒的表面糖蛋白）。而位于这些基因两端的有LTR序列（含有启动子、调节基因等），控制着逆转录基因组核心基因的表达及转移。
上图是构建逆转录病毒载体及用于培育转基因小鼠的流程图。
首先通过逆转录法将病毒的RNA进行逆转形成双链DNA，将其中的gag、pl、env等3个核心基因对应的部分全部切下，并用目的基因替换到相应的部位。
然后，将通过以上操作得到的2个DNA分子分别构建基因表达载体并注入到同一个特殊的动物细胞中，2个DNA片段都能在特殊细胞中表达。
3个核心基因表达出病毒的外壳蛋白；含有目的基因的DNA片段能转录出含有LTR和目的基因的mRNA的RNA片段，在特殊细胞中逆转录病毒的外壳即可包装该RNA片段，形成新型的逆转录病毒即为构建的逆转病毒表达载体，从而成为一种含有目的基因的具有感染力的逆转录病毒颗粒。
这种逆转录病毒载体作为一种表达载体，在侵染了动物细胞后可以通过反转录法形成双链DNA并整合到动物细胞的染色体上，从而可以通过细胞分裂传给下一代的子细胞，并永久性地表达目的蛋白。
例1、有关逆转录病毒载体描述正确的是
A、为DNA病毒
B、随机整合入宿主基因组
C、定点整合入宿主基因组
D、安全性高
答案： B
例2、逆转录病毒载体是目前应用较多的动物基因工程载体之一。运用逆转录病毒载体可以将外源基因插入到受体细胞染色体，使外源基因随染色体DNA—起复制和表达。研究发现逆转录病毒基因组（RNA）的核心部分包括三个基因：gag基因（编码病毒的核心蛋白）、pl基因（编码逆转录酶）、env基因（编码病毒的表面糖蛋白）。位于这些基因的两端有LTR序列（含有启动子、调节基因等），控制着逆转录基因组核心基因的表达及转移。如图是构建逆转录病毒载体及用于培育转基因小鼠的过程。回答下列问题：
（1）逆转录病毒的遗传信息储存在_____________；过程①原料是__________________________。
（2）过程②中，外源基因一定要插入到病毒DNA的LTR序列中的启动子后，其主要目的_____________。
（3）过程③中，导入病毒蛋白编码基因（gag，pl和env)的目的是_________________________________。
（4）过程④中，逆转录病毒载体感染的细胞一般选择内细胞团细胞，因为这类细胞能_________________。此时，早期胚胎处于____________期。
（5）在胚胎移植前，需要对代孕母鼠进行___________处理，才能使其生殖器官（子宫）适于早期胚胎的植入和正常发育。研究中必须对嵌合小鼠进行筛选，只有能产生___________的嵌合和小鼠才能将获得的新性状遗传给子代。
答案：
（1） RNA中4种核苷酸排列顺序中 4种脱氧核苷酸
（2）控制外源基因的表达
（3）合成组成病毒的蛋白质
（4）发育成新个体的各种组织器官（具有发育的全能性） 囊胚
（5）同期发情 含外源基因配子
解析：图示为基因工程获得转基因鼠过程，基因工程的基本操作程序有四步：①目的基因的获取，②基因表达载体的构建，③将目的基因导入受体细胞，④目的基因的检测与鉴定．
基因工程至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体．
启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质．
（1）过程①是逆转录过程，模板是RNA，原料是4种脱氧核苷酸，需要逆转录酶参与；逆转录病毒的遗传物质是RNA，其遗传信息储存在RNA中4种核糖核苷酸排列顺序中．
（2）启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位．启动子可控制外源基因的表达，所以外源基因要插入启动子后．
（3）基因可控制蛋白质的合成，病毒蛋白编码基因的作用是合成组成病毒的蛋白质．
（4）囊胚期的内细胞团具有发育的全能性，可发育成新个体的各种组织器官．
（5）胚胎移植前，需要对代孕母鼠进行同期发情处理，即用促性腺激素处理，使其生殖器官（子宫）适于早期胚胎的植入和正常发育．亲子代之间遗传的桥梁是配子，只有含有外源基因配子的小鼠才能将新性状遗传给子代．