押江苏卷第24题 基因工程-备战高考生物临考题号押题（江苏卷）

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基因工程的流程和应用是高考的必考点，且常考常新，预计2023年高考也不例外，依然会对其进行考查，有可能与新的科研实事结合，综合考查基因工程的流程和应用，比如新冠病毒疫苗的研发，还可能与细胞工程、胚胎工程等综合起来考查。
能准确识记课本内容，会正确分析图形，并从题干中摘取关键信息，规范答题。能够结合背景材料分析问题、解决问题。从题图中提取有效信息并结合这些信息，运用所学知识与观点，通过比较、分析与综合等方法对某些生物学问题进行解释、推理，做出合理的判断或得出正确结论。把握知识间的内在联系，要求能运用所学知识解决生活中的一些实际问题，或运用所学知识解释生活中的一些现象
(2022江苏卷T24). 纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
（1）纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是__________________。
（2）某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaC1至2．0m1/L的目的是__________________。PCR扩增时，需在__________________催化下，在引物__________________端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
（3）为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒（在EcRⅤ位点插入片段）。请完成下表。
（4）为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经_____________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的_____________倍。
【答案】（1）与有丝分裂有关（参与纺锤体的形成，是纺锤体形成中心）
（2） ①. 溶解DNA ②. 耐高温DNA聚合酶（Taq酶） ③. 3'
（3） ①. a、b ②. 1100 ③. Q4 ④. X蛋白参与中心体的形成
（4） ①. 逆转录 ②. 32
【解析】
【分析】PCR技术的条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；PCR的操作过程：①高温变性：DNA解旋过程（PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开）；低温复性：引物结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。
【小问1详解】
中心体与有丝分裂有关，是纺锤体的组织中心。
【小问2详解】
从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，DNA在2．0m1/L的NaC1溶液中的浓度最大，高于或低于这一浓度，DNA的溶解度均会下降，因此实验过程中添加NaC1至2．0m1/L的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在耐高温的DNA聚合酶（即Taq聚合酶）的催化下，在引物的3’端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
【小问3详解】
PCR扩增目的DNA片段时，在引物的3’端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图II中的引物a和引物b，PCR目的产物约为300+800=1100bp。确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcR V的识别序列，下游含有EcR V+BamH I的识别序列，根据题干信息构建Y-M重组质粒（在EcRⅤ位点插入片段），Y-M的连接处测序后部分序列应含有EcR V+BamH I的识别序列，根据EcR V识别位点，应选择序列Q4。对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X参与中心体的组成。
【小问4详解】
研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数），说明病人基因Z表达较弱，设健康人Z基因的cDNA数为x，病人Z基因的cDNA数为y，则有x×215=y×220，从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的25=32倍。
(2021江苏卷T23). 某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：
（1）目的基因的扩增
①提取真菌细胞______，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致______。
③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有______
A．Taq酶最适催化温度范围50～60℃
B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性
（2）重组质粒的构建
①将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进______，形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及______酶等，完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在______。
（3）融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是______。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明______，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
【答案】（1） ①. mRNA ②. 蛋白M上不含tag标签 ③. BC
（2） ①. 黏性末端碱基配对 ②. DNA连接 ③. 基因m的连接处、基因m的内部
（3） ①. 受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因可以长成菌落 ②. 融合基因表达（或融合基因正确解码）
【解析】
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【小问1详解】
①以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的mRNA。
②从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若m基因的转录产物mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。
③A、从题干信息可知，“80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增”，故Taq酶最适催化温度范围为94℃左右，A错误；
B、PCR 反应的最初加热过程中，样品温度上升到70℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA 聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物错配形成的产物的扩增，影响反应的特异性；热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提高反应的特异性，B正确；
C、DNA分子复制具有方向性，都是从5′端向3′端延伸，C正确；
D、Taq酶没有特异性，与普通的DNA聚合酶相比，Taq酶更耐高温，D错误。
故选BC。
【小问2详解】
①从图上看，载体A只有一个Sma I的酶切位点，故被Sma I切开后，载体由环状变为链状DNA，将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。
②重组质粒中，载体A被Sma I切开的位置已经与基因m相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在基因m的连接处或基因m内部。
【小问3详解】
①筛选目的菌株的机理是：导入了质粒A-m的目的菌株由于含有URA3基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则不能存活。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含lag标签，位于lag标签上游的基因m应该正常表达，说明融合基因表达（或融合基因正确解码）。
【点睛】本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记原理及操作步骤，掌握各操作步骤中需要注意的细节，能将教材中的知识结合题中信息进行知识迁移，准确答题。
1．血凝素基因（H）编码的血凝素是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分。成熟的血凝素包含HA1和HA2两个亚单位，其中HA1含有病毒与受体相互作用的位点。lgGFc基因片段（长度为717bp）编码人lgG抗体中的一段小肽，常作为融合蛋白标签。蛋白质分泌依赖于信号肽的引导，本研究中用信号肽IL-2SS代替HA自身信号肽，科研人员尝试构建IL-2SS/HA/lgG Fc融合蛋白表达载体，并导入大肠杆菌表达和分泌，请回答：
(1)流感病毒囊膜主要由______组成，囊膜上血凝素的合成场所在______。
(2)本实验用信号肽IL-2SS代替HA自身信号肽有利于______，PCR扩增目的基因时应该选择图中引物____设计引物时，不能包含基因HA的终止密码子的编码序列，原因是____。
(3)应选择限制酶____来切割质粒A，然后直接将PCR产物与质粒A混合，同时加入____酶，使得目的基因与质粒A相连。
(4)若目的基因与质粒A正向连接，HA1基因转录时的模板链是由图中的引物______（填“a”、“b”、“c”或“d”）在PCR时延伸而成；若目的基因与质粒A反向连接，用BamHI和SacI同时切割重组质粒，完全酶切后的产物进行凝胶电泳，其中最靠近加样孔的条带长度约为________bp。
(5)融合蛋白中的标签蛋白有利于目的蛋白的分离和纯化，基因工程生产HA作为疫苗时，选择人IgGFc作为标签的优点还有________。
【答案】(1) 磷脂和蛋白质 宿主细胞的核糖体
(2) 融合蛋白分泌到大肠杆菌细胞外 b和引物c 防止产生的HA 上不含IgG Fc标签
(3) EcRV T4DNA连接
(4) c 5181
(5)降低免疫排斥反应
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）流感病毒囊膜属于膜结构，主要成分是蛋白质（血凝素）和磷脂组成，血凝素的化学本质是蛋白质，其合成场所是宿主细胞的核糖体（或宿主细胞的核糖体和内质网）。
（2）IgGFc基因片段（长度为717bp）编码人IgG抗体中的一段小肽，常作为融合蛋白标签，HA1含有病毒与受体相互作用的位点，科研人员尝试构建IL-2SS/HA1/IgG Fc融合蛋白表达载体，并导入大肠杆菌表达和分泌，说明用信号肽IL-2SS代替HA自身信号肽有利于有利于融合蛋白分泌到大肠杆菌细胞外。由图可知，引物bc可与HA1两端的碱基序列结合，故PCR扩增目的基因是应选择图中引物b和引物c。若设计引物是含有HA1的终止密码子，则核糖体读到终止密码子时就停止翻译，导致IgGFc基因不能正常表达，产生的HA1上不含IgG Fc标签。
（3）由图可知，限制酶EcRV切割可产生平末端，其识别切割位点恰巧处于IL-2SS和IgGFc中间，可选择该酶对质粒进行切割，然后直接将PCR产物与质粒A混合，同时加入T4DNA连接酶（将DNA片段连接起来），使得目的基因与质粒A相连。
（4）HA2基因的编码序列是由图中的引物c在PCR时延伸而成，若目的基因与质粒A正向连接，HA1基因转录时的模板链是由图中的引物c在PCR时延伸而成。若目的基因与质粒A反向连接，HA1基因片段长度为1038-51=987bp，重组质粒长度为5554+1038-51=6541bp，IgGFc基因片段长度为717bp，二者反向相连时BamHI作用于HA1中，SacI酶作用于IgGFc末端，完全酶切后的产物的长度约为717+（987-344）=1360，6541-1360=5181，其中最靠近加样孔的条带长度约为5181bp。
（5）基因工程生产HA1作为疫苗时，选择人IgGFc优点在于降低免疫排斥反应。
2．Cre/lxP酶系统是在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造的一种技术，可以在DNA的特定位点上执行碱基序列的删除、插入以及重组等，从而实现基因的定点编辑。
(1)图1是利用Cre/lxP酶系统敲除基因的过程。lxP序列具有方向性，由中间的间隔序列和两侧的反向重复序列组成。当某一条DNA片段上待敲除基因的两端存在同向lxP序列时，Cre酶识别并结合到lxP序列的反向重复序列区。两个lxP序列的间隔序列被Cre酶定点切开，4个黏性末端序列交错两两连接，其中待敲除基因两端的序列进行连接，连接时形成的化学键是___________，敲除的基因片段会形成___________（填“线状”或“环状”）结构。
(2)图2是利用Cre/lxP酶系统构建融合基因的过程。首先要用PCR对Bt基因和Bar基因分别扩增，以获得所需要的DNA片段，然后对连接后的DNA片段用Cre/lxP酶系统处理获得Bt-Bar融合基因片段。在用PCR1扩增Bt基因时，所用的2种引物的结合位置在____________；又有研究表明，大多数限制酶对裸露的位点不能识别切割，因此必须对识别序列5'末端进行修饰并加上一个至几个保护碱基，如GGG。由此推测，对Bar基因引物5’端序列的要求是___________。
(3)图3是用Cre/lxP酶系统敲除转基因烟草细胞内Bar基因的部分过程。已知图中的启动子和终止子可在烟草细胞中正常发挥作用，Cre酶基因在环境中存在Tam化学物质时才能激活表达。重组Ti质粒中的Bar基因作为基因表达载体中的___________可对转化后的烟草细胞进行筛选。进行图3所示敲除后，DNA片段1中的Bt基因不能正确表达，据图分析，原因是___________；若不对融合基因中的Bar基因进行敲除处理，仅在翻译水平上不让Bar基因表达，请利用Cre/lxP酶系统提出解决方案___________。
(4)图4是经过修饰后的转基因烟草细胞内的融合基因所在片段及相关引物的结合位点。为检测Bar基因是否被成功敲除同时未影响Bt基因的正常表达，可用PCR技术进行鉴定：
实验组：首先提取在有Tam环境下培养的转基因烟草细胞质中的总RNA，进行逆转录获得cDNA，然后加入引物1和引物2进行PCR扩增，再进行琼脂糖凝胶电泳，观察有无Bt基因和Bar基因的条带。
对照组：用未进行敲除处理的转基因烟草细胞，其余同实验组。
若实验组敲除成功，则实验组和对照组的电泳结果分别为___________。
【答案】(1) 磷酸二酯键 环状
(2) Bt的两种引物分别在启动子外侧和终止子内侧（启动子和终止子的左侧） 引物的5'端均要连接上lxP序列，并在末端加上保护碱基序列（GGG）
(3) 标记基因 缺少Bar的终止子 利用Cre/lxP酶系统在Bt基因和Bar基因之间插入终止密码子对应的DNA序列
(4)实验组两种基因的条带都无，对照组两种基因的条带都有
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样．将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）基因中一条链上脱氧核苷酸之间是通过磷酸二酯键连接，因此待敲除基因两端的序列进行连接时，形成的化学键是磷酸二酯键。据图可知，当某一条DNA片段上待敲除基因的两端存在同向lxP序列时，Cre酶识别并结合到lxP序列的反向重复序列区，这样敲除的基因片段的两端因为是用同种酶进行切割，产生的是互补的黏性末端，他们会通过碱基互补配对原则形成环状结构。
（2）启动子是决定RNA聚合酶转录起始位点的DNA序列，终止子是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列，启动子一般在目的基因的左侧（外侧），终止子在目的基因的右侧（内侧），因为要获得Bt-Bar融合基因片段，即需要Bt带上启动子（不需要终止子）、Bar带上终止子（不需要启动子），因此在用PCR1扩增Bt基因时，所用的2种引物的结合位置在Bt的两种引物分别在启动子外侧和终止子内侧。据图2可知，Bt-Bar融合基因片段中Bar基因的左侧和右侧都含有lxP序列，又因为大多数限制酶对裸露的位点不能识别切割，因此必须对识别序列5'末端进行修饰并加上一个至几个保护碱基，如GGG，据此可知，对Bar基因引物5’端序列的要求是引物的5'端均要连接上lxP序列，并在末端加上保护碱基序列（GGG）。
（3）图3是用Cre/lxP酶系统敲除转基因烟草细胞内Bar基因的部分过程，基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因和终止子组成，因此推测Bt基因是目的基因，Bar基因是标记基因，可对转化后的烟草细胞进行筛选。Bt-Bar融合基因片段中的启动子是Bar基因的，终止子是Bar基因的，图中DNA片段1中不存在Bar基因及其终止子，因此DNA片段1中的Bt基因不能正确表达。若不对融合基因中的Bar基因进行敲除处理，仅在翻译水平上不让Bar基因表达，在Bt基因后面插入能翻译终止的mRNA序列，这样Bar基因就会因为没有启动子不能转录，因此利用Cre/lxP酶系统提出解决方案为：利用Cre/lxP酶系统在Bt基因和Bar基因之间插入终止密码子对应的DNA序列。
（4）PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的，如果Bar基因被成功敲除同时未影响Bt基因的正常表达，实验组中引物1不能结合到要扩增的目的基因上，不能进行扩增，因此两种基因的条带都无，对照组因此基因没有敲除，因此两个基因都能正常扩增，因此两种基因的条带都有。
3．新冠病毒（＋RNA）的刺突蛋白S通过与人体黏膜细胞表面的ACE2受体结合而进入细胞，是宿主抗体的重要作用位点。下图1是科研人员利用新冠病毒的＋RNA提取S蛋白基因和S蛋白受体结合域RBD基因作为抗原基因序列，研制新冠病毒双抗原疫苗的技术路线。已知PCR1与PCR2要分别进行，然后将产物混合，使用引物1和引物4进行PCR3，最终获得大量S－RBD融合基因（1500bp）。
(1)PCR3过程中，片段1与片段2连接形成S－RBD融合基因，需要使用______酶。为使S－RBD融合基因能与pX质粒相连接，并在工程菌中表达时先合成S蛋白，则PCR1过程中，应在引物1的5'端添加的限制酶序列是______。
(2)为初步检测过程B构建是否成功，用EcRⅠ、NdeⅠ、HindⅢ对重组pX系列质粒进行完全酶切，然后对重组pX系列质粒及其酶切产物进行凝胶电泳检测，结果如图2，据图可知，重组质粒pX2和pX5构建成功的依据是______。
(3)在工程菌的筛选时，可先后用两种抗生素进行影印培养实验（即使用无菌的绒毡布压在培养基A的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B上），在培养基B中存活的菌落是否含有目的基因_______（填“是”或“否”）。鉴定重组pX质粒是否导入工程菌还可以采用的方法是_______。
(4)试从免疫学角度分析此种双抗原疫苗比常规S蛋白疫苗更具优势的原因_______。
【答案】(1) 耐高温的DNA聚合（Taq DNA聚合酶） 5'CATATG3'
(2)重组质粒pX2和pX5酶切后形成的1000bp和500bp片段碱基对总和等于S－RBD融合基因长度1500bp
(3) 否 观察菌落是否具有荧光
(4)此种双抗原疫苗含有S蛋白受体结合域RBD，有利于进入靶细胞．从而激发细胞免疫
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）由于操作过程具有较高的温度，故PCR过程中，需要的酶是耐高温DNA聚合酶；该酶的作用是将单个的脱氧核苷酸连接到引物的3'端。据图可知，目的基因应插入到启动子和终止子之间，可选择的酶有HindⅢ、Ndel，启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，用于驱动基因的转录，原核细胞中基因表达时可以边转录边翻译，引物4对应的区段靠近启动子时先转录出S蛋白的mRNA序列，故引物4对应的区段要连接在靠近启动子部位，引物1对应的区段要连接在靠近终止子部位。引物1的5'端添加的限制酶序列应与NdeI限制酶切割的黏性末端的序列能碱基互补，所以引物1的5'端添加的限制酶序列是5'CATATG3'。
（2）使用引物1和引物4进行PCR3，最终获得大量S－RBD融合基因（1500bp）,用EcRⅠ、NdeⅠ、HindⅢ对重组pX系列质粒进行完全酶切，然后对重组pX系列质粒及其酶切产物进行凝胶电泳检测；重组质粒pX2和pX5构建成功的依据是重组质粒pX2和pX5酶切后形成的1000bp和500bp片段碱基对总和等于S－RBD融合基因长度1500bp。
（3）在工程菌的筛选时，由于含目的基因的菌落对第二次培养时使用的抗生素无抗性，故在第二次培养时存活的菌落不含目的基因；鉴定pX质粒是否导入工程菌还可以采用的方法是：观察菌落是否具有荧光，有荧光的则含有pX质粒。
（4）分析题意可知，此种双抗原疫苗含有S蛋白受体结合域 RBD，有利于进入靶细胞，从而激发细胞免疫，故此种双抗原疫苗比常规S蛋白疫苗更具优势。
4．重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术，可通过定点诱变在体外改造DNA分子，并将改造后的目的基因导入质粒构建目的基因表达载体。
(1)上图所示的重叠延伸PCR技术中，PCR1的引物是_________。PCR4可获得大量定点诱变目的基因，此时的引物为__________。PCR3时模板DNA不能选择DNA分子③的原因是___________。
(2)为使重叠延伸PCR技术改造后的目的基因（该基因序列不含图中限制酶的识别序列）能与载体正确连接，PCR4时，应在基因上、下游引物的_________端分别添加限制酶_________的酶切位点。
(3)将目的基因、质粒及大肠杆菌混合，温育一段时间后涂在含四环素的平板上培养，一段时间后平板上长出菌落。这些菌落的菌体内_________（填“一定不一定”）含有目的基因，理由是_________。
【答案】(1) 引物A、引物C 引物C、引物D 子链的延伸方向只能从5’→3'，以DNA分子③作模板时子链不能延伸
(2) 5 Kpnl、EcRl
(3) 不一定 含有空白质粒的大肠杆菌也能在该培养上生长
【分析】PCR原理：在DNA复制中，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，以四种游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物的作用下，DNA聚合酶从引物3’端开始延伸DNA链。
【详解】（1）由于DNA合成的方向是从子链的5’端到3’端延伸的，根据PCR1的产物，可知引物是引物A、引物C。根据PCR2的产物，PCR2的引物为引物B、引物C，将DNA分子②④混合后退火可得到③⑤，PCR3获得DNA⑥，DNA⑥分子的3’端与引物D互补配对，5’端与引物C互补配对，所以PCR4的引物为引物C、引物D；PCR3为了获得重叠链，模板DNA不能选择DNA分子③的原因是子链的延伸方向只能从5’→3'，以DNA分子③作模板时子链不能延伸。
（2）为使重叠延伸PCR技术改造后的目的基因能与载体正确连接，PCR4时，应在基因上、下游引物的5'端分别添加限制酶，因为子链的延伸是从3' 端开始的。目的基因应插在启动子和终止子之间，由于pstI靠近终止子，所以应在基因上、下游引物的5'端分别添加限制酶Kpnl、EcRl。
（3）目的基因、质粒及大肠杆菌混合，可能有一些质粒与目的基因成功连接，可能也有些质粒没有与目的基因连接，这些质粒若成功导入大肠杆菌，由于质粒上有四环素抗性基因，所以都能在含四环素的的平板上长出菌落，所以这些菌落不一定含有目的基因。
5．为探究Bcl-2相关抗凋亡蛋白3（BAG3）在细胞自噬中的作用，科研人员计划从质粒A中获取BAG3基因，将其接入质粒pGEX-4T1，然后在宿主细胞内表达目标蛋白，用于后续研究。请回答下列问题：
(1)BAG3的基因序列如下图所示：
由于BAC3基因两侧没有合适的酶切位点，并确定内部不含有EcRI、XhI限制酶的识别序列。在设计引物时，需将引物与限制酶的识别序列相连，以便将目的基因与载体相连。设计出的引物是（ ）
A．引物5'-TTGAATTCATGAGCGCCGCCACCCACTC-3'
B．引物5'-TTGAATTCTACTCGCGGCGGTGGGTGAG-3'
C．引物5'-TAGAGCTCCGGTGCTGCTGGGTTACCAC-3'
D．引物5'-TACTCGAGCGGTGCTGCTGGGTTACCAG-3'
(2)合成引物后，以_____为模板进行PCR，为了确认是否扩增出了目的基因，可对扩增产物进行_____，取出凝胶置于紫外灯下观察照相，与DNAmarker（标准参照物）进行对比，切下含目的基因片段的琼脂糖凝胶，通过试剂盒回收目的基因。
(3)用双酶切法分别处理回收的目的基因和pCEX-4TI质粒，为了提高目的基因与表达质粒的连接效率，需要排除_____的干扰。
(4)用_____处理大肠杆菌细胞，使其处于一种能_____的生理状态，将构建好的重组质粒导入其中。为了筛选出工程菌，以便后期提取质粒，检测是否含有目的基因片段，请写出工程菌的纯培养过程。_____。
【答案】(1)AD
(2) 质粒A（含目的基因的片段） 琼脂糖凝胶电泳(电泳）
(3)酶切后的非目标片段
(4) Ca2+ 吸收周围环境中DNA分子 在含有氨苄青霉素的固体培养基上培养，挑取单菌落接种到液体培养基中扩增培养
【分析】基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【详解】（1）目的基因BAC3基因两侧没有合适的酶切位点，并确定内部不含有EcRI、XhI限制酶的识别序列，为防止目的基因被限制酶切开，故在设计引物时，应选择EcRI、XhI限制酶与引物的5'段进行连接。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。A选项中，GAATTC为EcRI限制酶的识别位点，5'-ATGAGCGCCGCCACCCACTC-3'是以目的基因BAC3的互补链为模板合成的，A符合题意；D选项中，CTCGAG为XhI限制酶的识别位点，5'-CGGTGCTGCTGGGTTACCAG-3'是以目的基因BAC3为模板合成的，D符合题意。
故选AD。
（2）由题干“科研人员计划从质粒A中获取BAG3基因”可知，在合成引物后，以质粒A（含目的基因的片段）为模板进行PCR，PCR产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
（3）用双酶切法分别处理回收的目的基因和pCEX-4TI质粒，由于酶切后的非目标片段也含有相同的黏性末端，因此需要排除酶切后的非目标片段的干扰。
（4）将重组质粒导入受体细胞，一般需要用Ca2+处理大肠杆菌，形成感受态，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。pGEX-4T1质粒中含有氨苄青霉素抗性基因，为了检测重组质粒中是否含有目的基因片段，可以将其在含有氨苄青霉素的固体培养基上培养，挑取单菌落接种到液体培养基中扩增培养。
分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向）
①选择图Ⅱ引物_____________；
②PCR目的产物约为_____________bp。
确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcR V的识别序列，下游含有EcR V+BamH I的识别序列
③质粒测序，图Ⅲ中正确的是____________（选填序列编号）
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明________________________。