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新教材备战高考生物一轮复习全考点精讲课堂 第37讲 发酵工程（课件）
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这是一份新教材备战高考生物一轮复习全考点精讲课堂 第37讲 发酵工程（课件），共60页。PPT课件主要包含了章节知识体系，CONTENT，考点分析，发酵工程及其应用等内容，欢迎下载使用。
第3课时 发酵工程
第十六单元 生物技术与工程
能明确发酵的概念和基本原理，简述传统发酵技术；通过泡菜、果酒和果醋等传统发酵食品的制作，了解传统发酵技术应用的优点和不足。
明确培养基的配制方法和微生物纯培养的基本要求，能将无菌操作、倒平板和平板划线等基本技能应用到酵母菌的纯培养过程中。
明确发酵工程的基本环节，了解发酵工程的应用。
能应用生物与环境相适应的观点阐明微生物选择培养的原理，能应用稀释涂布平板法和微生物数量测定的方法，进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。
1、发酵与传统发酵技术
一、传统发酵技术的应用
发酵是指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。
直接利用原材料中 的微生物，或利用前一次发酵 的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术一般称为传统发酵技术。
经过微生物(如酵母、曲霉和毛霉等，其中 起主要作用)的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分的 ，味道鲜美，易于消化吸收，而腐乳本身又便于保存。
传统发酵以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主，通常是家庭式或作坊式的。
配制质量分数为5%〜20%的盐水，煮沸、冷却待用。
新鲜蔬菜洗净，切成块状或条状，晾干后装入泡菜坛内；装至半坛时，放入调味剂，继续装至八成满。
将盐水倒入坛中，使盐水没过全部菜料，盖好坛盖。
向坛盖边沿的水槽中注满水，并在发酵过程中注意经常向水槽中补充水，根据室内温度控制发酵时间。
2、尝试制作传统发酵食品
①原理：利用乳酸菌的无氧呼吸，将葡萄糖分解成乳酸。
●食盐的作用是调味和抑制其他微生物的生长。●盐水浓度要适宜。过低会造成细菌污染，导致泡菜变质；过高会抑制乳酸菌 发酵，延长泡菜成熟的时间。●盐水煮沸的目的是杀菌除氧；盐水冷却待用是防止高温杀死乳酸菌。
●泡菜坛密封性要好；●蔬菜洗净后，若没有晾干，泡菜容易变质。可在坛内加入少量白酒，防止泡 菜变质；●泡菜装八成满是防止发酵液从坛内溢出；●创造无氧环境的：盐水煮沸、盐水没过菜料、坛边水槽注满水等；
泡菜成熟的时间受蔬菜种类、发酵温度、食盐浓度等的影响
选择新鲜的葡萄，榨汁前先冲洗，后除去枝梗，以防葡萄汁流失及杂菌污染。不要反复冲洗，避免菌种流失。葡萄冲洗清理后要沥干。
发酵瓶、榨汁机等器具洗净，并用70%的酒精消毒，晾干备用
原理：利用酵母菌(异养兼性厌氧菌)无氧呼吸产生酒精。温度：18~30℃时间：10~12天对氧的需求：前期通气，后期密封
●发酵瓶装入葡萄汁后，要留有大约1/3的空间，盖好瓶盖。如用带盖的瓶子(A图)制果酒，每隔12h左右将瓶盖拧松排气（注意：不是打开瓶盖，防止杂菌污染），此后再拧紧瓶盖。●若用B图装置制酒，装入葡萄汁后应封闭充气口。
原理：利用醋酸菌(异养好氧菌) 在：①O2和糖源都充足时，将糖分解成乙酸；②O2充足，缺少糖源时，能将乙醇→乙醛→乙酸。温度：30~35℃时间：7~8天对氧的需求：全程需氧
A图 B图
葡萄酒制作完成后，打开瓶盖，盖上一层纱布，进行葡萄醋的发酵。
3、传统发酵技术存在的不足
传统发酵食品的制作过程中，没有接种菌种，利用的天然菌种，菌种差异、杂菌情况不明和发酵过程的控制缺乏标准等，往往会造成发酵食品的品质不一。
2、泡菜制作过程中，各阶段菌种如何变化？ ①发酵初期：主要是大肠杆菌、酵母菌活跃，消耗大量氧气，使坛内形成无氧环境，会使好氧菌生命活动逐渐被抑制。 ②发酵中期（风味最佳）：乳酸菌活跃使乳酸不断积累，pH下降，会使不耐酸菌被抑制 ③发酵后期：乳酸继续增加，到一定程度后会使乳酸菌的生长繁殖被抑制。
1、在泡菜制作过程中营造“无氧环境”的3项措施是什么？
（1）选择的泡菜坛要密封性好。（2）加入蔬菜后要注入煮沸冷却的盐水，使盐水没过全部菜料。（3）盖上坛盖后要在坛盖边沿的水槽中注满清水。
3、正常情况下，泡菜制作过程中，乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的含量如何变化？
乳酸菌含量先增加后下降；乳酸含量逐渐增多，最后趋于稳定；亚硝酸盐含量先增加后下降，最后趋于稳定。
5、某同学在制作泡菜前，查阅资料得知，可以向泡菜坛中加入一些“陈泡菜水”；在用质量分数为5%的食盐水制作泡菜时，他在不同时间测定了泡菜中亚硝酸盐的含量，结果见曲线图。（1）据图分析，从亚硝酸盐的含量来看，你认为该泡菜在什么时间食用比较合适？为什么？
第11天后。因为这时亚硝酸盐的含量已经降到较低水平。
（2）他第一次制作出的泡菜“咸而不酸”，造成这个结果最可能的原因是什么？
（3）加入“陈泡菜水”的目的是什么？
可能是食盐浓度过高，发酵温度过低等原因导致泡菜未能正常发酵。
“陈泡菜水”中含有纯度较高的乳酸菌，加入“陈泡菜水”相当于接种酵母菌。
4、为什么泡菜坛内有时会长一层白膜？你认为这层白膜是怎么形成的？
白膜是由产膜酵母的繁殖形成的。酵母菌是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌繁殖。
6、在制作果酒和果醋的过程中，发酵液分别有哪些变化？其中最明显的变化发生在发酵后多少天？引起变化的原因是什么？
在葡萄酒的制作过程中，发酵液中会产生气泡，这是因为酵母菌发酵产生CO2；如果是用紫色葡萄制作葡萄酒，随着发酵时间的延长，由果皮进入发酵液的花青素会越来越多，因而发酵液的颜色会逐渐加深变成深红色。葡萄醋发酵过程中一般不会出现气泡，发酵完成时，在发酵液的表面上会出现一层菌膜，这是醋酸菌膜。
7、在制作果酒的过程中，除了酵母菌，是否还有其他微生物生长？它们会对果酒发酵产生影响吗？如果有，如何避免这种影响？
制作果酒的过程中，除酵母菌之外，还会有其他杂菌生长，它们会在酒精发酵中污染发酵液，而避免发酵液污染需要从发酵制作的过程全面考虑。例如，榨汁机、发酵瓶要清洗干净，装入葡萄汁后，封闭充气口；每次排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等。
8、有3位同学分别采用了3种不同的发酵装置来制作果醋。A同学用的是带盖的塑料瓶；B同学用了没有盖的塑料瓶，在发酵过程中无盖的瓶口一直由捆绑在瓶口的8层纱布覆盖；C同学则设计了如下图所示的发酵装置。结合果醋的制作原理，你认为哪一种发酵装置更适合制作果醋？你还能继续改进这种装置吗？
9、当把少量制作转化为大规模生产时，需要解决哪些实际问题？
10、请判断对错。 ①微生物发酵产生了不同的代谢物使得臭豆腐具有特殊的味道。(√) ②乳酸菌是厌氧细菌，无氧呼吸产物是乳酸与CO2。(×) ③亚硝酸盐会危害人体健康，一定要禁止食用。(×) ④葡萄酒的自然发酵中，起主要作用的是突变型酵母菌。(×) ⑤只要O2充足醋酸菌发酵的产物是一样的。(×) ⑥在配制泡菜水时，应将清水煮沸冷却后再配制质量分数为5%～20%的盐水。(×) ⑦葡萄酒的制作离不开酵母菌，制作过程中随着发酵的进行发酵液中糖含量增加。(×) ⑧用白萝卜制作泡菜的过程中，向容器中通入无菌空气可缩短腌制时间。(×) ⑨随着发酵时间的延长，泡菜中乳酸含量逐渐增加，所以泡菜腌制时间越长越好。(×) ⑩在制作果酒过程中，只有酵母菌进行发酵，没有其他微生物生长。(×) ⑪在制作果醋的过程中，需将瓶盖打开为醋酸菌提供氧气，盖上纱布以减少空气中杂质的污染。(√) ⑫在果酒、果醋的发酵装置中，充气口的作用是在酒精发酵时连接充气泵进行充气，排气口的作用是在酒精发酵时排出二氧化碳。(×)
11、（2021·辽宁卷）利用菠萝蜜制作果醋的大致流程为：先在灭菌的果肉匀浆中接种酵母菌，发酵6天后，再接入活化的醋酸菌，发酵5天。下列有关叙述错误的是（ ） A. 乙醇既是乙酸发酵的底物，又可以抑制杂菌繁殖 B. 酵母菌和醋酸菌均以有丝分裂的方式进行增殖 C. 酵母菌和醋酸菌发酵过程中控制通气的情况不同 D. 接入醋酸杆菌后，应适当升高发酵温度 12、（2021·湖北卷）中国的许多传统美食制作过程蕴含了生物发酵技术。下列叙述正确的是（ ） A. 泡菜制作过程中，酵母菌将葡萄糖分解成乳酸 B. 制作过程中，酵母菌进行呼吸作用产生CO2 C. 米酒制作过程中，将容器密封可以促进酵母菌生长 D. 酸奶制作过程中，后期低温处理可产生大量乳酸菌
13、(2020·江苏卷)某同学在线提交了在家用带盖玻璃瓶制作果酒和果醋的实验报告，他的做法错误的是( ) A. 选择新鲜的葡萄略加冲洗，除去枝梗后榨汁 B. 将玻璃瓶用酒精消毒后，装满葡萄汁 C. 酒精发酵期间，根据发酵进程适时拧松瓶盖放气 D. 酒精发酵后去除瓶盖，盖一层纱布，再进行醋酸发酵 14、(2021·山东卷)葡萄酒的制作离不开酵母菌。下列说法错误的是( ) A．无氧条件下酵母菌能存活但不能大量繁殖 B．自然发酵制作葡萄酒时起主要作用的菌是野生型酵母菌 C．葡萄酒颜色是葡萄皮中的色素进入发酵液形成的 D．制作过程中随着发酵的进行发酵液中糖含量增加
15、[2022·枣庄模拟]泡菜(乳酸发酵过的蔬菜)是许多亚洲国家的传统食品，在发酵液中通常发现的微生物包括乳酸菌、酵母菌和丝状真菌。如图表示这3种不同微生物群中活细胞数和卷心菜乳酸发酵过程中pH的变化。发酵液中的溶解氧随时间下降，在第22天被完全耗尽。下列说法错误的是( ) A. pH从第1天到第3天的下降主要由乳酸菌产生的乳酸引起 B．酵母菌从第10天到第22天的生长与发酵液中的氧气有关 C．酵母菌在第26天后开始产生酒精 D．一些丝状真菌在低pH下表现出较高的耐受性
二、微生物的培养技术及应用
1、微生物的基本培养技术
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
水、无机盐、碳源、氮源等营养物质，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求
原理：生物与环境相适应概念：允许特定种类的微生物生长，同时抑制 或阻止其他种类微生物生长的培养基用途：富集、分离特定微生物
注意：有些碳源也是能源物质；有机氮源也能作为碳源，有些无机氮源也可作为能源；
氮元素是微生物合成蛋白质、核酸所必需的物质
①避免杂菌的污染，以获得纯净的微生物培养物；②避免操作者被微生物感染。
使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
煮沸消毒、巴氏消毒、化学药物消毒、紫外线消毒等
使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
湿热灭菌、干热灭菌和灼烧灭菌等
对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。为避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触，之后的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
煮沸消毒（100℃，5～6min）常用
巴氏消毒不破坏营养成分
化学药物消毒可擦拭的表面、液体
水蒸气为介，100kPa，121℃，15~30min
热空气为介质，160~170℃，2~3h
接种用具如涂布器、接种环、接种针或其它金属用具
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。
③实例——酵母菌的纯培养
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
配制培养基(包括调整PH)、灭菌、倒平板
将接种后的平板和一个未接种的平板(对照)倒置培养
④实例——酵母菌的纯培养
3、操作时，接种环通过灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是什么？
将聚集的菌体逐步稀释以便获得不连续的单个菌落。
2、倒平板操作中，平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是什么？
1、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
不能。因为空气中的微生物可能在皿盖和皿底之间的培养基上滋生，可能会造成污染。
防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上(污染培养基和破坏菌落)； 防止培养基水分过快蒸发。
4、某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？
最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌； 采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。
5、请判断对错。 ①在培养细菌时，要将培养基调至中性或弱酸性。 (×) ②消毒能杀死材料表面的所有微生物。 (×) ③配制培养基时应先灭菌再调pH（×） ④无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料（如培养基、接种环等）都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌（×） ⑤微生物的纯培养步骤为配制培养基→接种→灭菌→分离和培养等。 (×) ⑥需要将一个不接种的培养基放在相同的条件下培养，以检验培养基的灭菌是否合格。(√) ⑦倒平板就是等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。(×) ⑧倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。 (×) ⑨为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。 (×) ⑩若无菌操作合格，在接种酵母菌的培养基上应观察到不同形态、不同颜色的酵母菌菌落。(×) ⑪平板划线时要注意将最后一次的划线与第一次的划线相连。 (×)
6、养殖池中存在的有毒物质主要是氨和亚硝酸，这两种物质可由硝化细菌吸收利用。研究人员从养殖池池泥中分离出硝化细菌并进行了计数。下列有关叙述正确的是（ ） A. 需配制一定浓度含氨盐的牛肉膏蛋白胨培养基以分离硝化细菌 B. 配制的培养基经高压蒸汽灭菌后通常还需要调节pH才能使用 C. 涂布时，用涂布器蘸取少量菌液并均匀地涂布在培养基的表面 D. 使用稀释涂布平板法统计得到的菌落数目往往比活菌的实际数目少 7、(2020·江苏高考)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素分解菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是( ) A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整 B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落 C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的 D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
8、[2021·湖南卷]大熊猫是我国特有的珍稀野生动物，每只成年大熊猫每日进食竹子量可达12～38kg。大熊猫可利用竹子中8%的纤维素和27%的半纤维素。研究人员从大熊猫粪便和土壤中筛选纤维素分解菌。回答下列问题：（1）为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以________为唯一碳源的固体培养基上进行培养，该培养基从功能上分类属于_____培养基。（2）配制的培养基必须进行灭菌处理，目的是 。 。检测固体培养基灭菌效果的常用方法是______________________。（3）简要写出测定大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数的实验思路。
为了杀死培养基中的所有微生物(微生物和
不接种培养(或空白培养)
将大熊猫新鲜粪便样液稀释适当倍数后，取0.1 mL涂布到若干个平板(每个稀释度至少涂布三个平板)，对菌落数在30～300的平板进行计数，则可根据公式推测大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数。
（4）为高效降解农业秸秆废弃物，研究人员利用从土壤中筛选获得的3株纤维素分解菌，在37 ℃条件下进行玉米秸秆降解实验，结果如表所示。在该条件下纤维素酶活力最高的是菌株_____，理由是 。
接种C菌株后秸秆失重最多，纤维素降解率最大
9、[2020·全国卷Ⅰ]某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用____________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是_____。甲、乙培养基均属于______培养基。(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释____倍。(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是_________________________________________(答出1点即可)。
S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：_______________________________________________________。(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即________________________。
取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数
水、碳源、氮源和无机盐
10、[全国卷Ⅱ]物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题。(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是___。 (2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择____菌落进一步纯化，选择的依据是_____________________________________。(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即_______。
乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W
将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源
(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加_______，三处滴加量相同。②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明__________________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明___________________________。
酶E与天然酶降解W的能力相近
2、微生物的选择培养和计数
（1）选择培养基配方的设计(以分离土壤中尿素分解菌为例)
②设计培养基的配方
只以尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分与普通培养基相同
（2）微生物的选择培养(以土壤中尿素分解菌为例)
利用稀释涂布平板法和选择培养基对微生物进行选择培养。
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
①取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
④用涂布器将菌液均匀地涂布在选择培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被选择培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃培养1～2d。
在适宜稀释度的平板上可以分离得到单菌落。
（3）微生物的数量测定
①利用稀释涂布平板法计数
a、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30〜300的平板计数，并且在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，并求出平均值。
若105倍稀释下三个平板上的菌落数依次为26、30、31。此时可以设置新的稀释倍数5×104，以使平板上的菌落计数结果更加准确。
若105倍稀释下三个平板上的菌落数依次为38、42、195。由于数据偏差过大，此时应考虑重新实验。
b、统计结果往往比实际值少。
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
②利用显微镜进行直接计数
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
（4）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
①原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
②计数方法：稀释涂布平板法。
若土样稀释105倍，取0.1mL涂布在三个平板上，培养后三个平板上的菌落数依次为46、47、54。求每克土样中有多少分解尿素的细菌。
解：三个平板上的菌落数平均值=（46＋47＋54）个/3=49个；105倍稀释后菌液的种群密度=49个÷0.1mL=490/mL；高倍稀释后1mL≈1g，因此可记作490个/g；未稀释前菌液的种群密度=490个/g×105=4.9×107个 /g
问题：如何确定培养基是否有杂菌污染以及选择培养基是否有选择作用？
结果结论：若未接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被污染。
选择培养基是否具有筛选作用？
自变量：接种不同培养基(选择培养基和完全培养基)
结果结论：若接种后的完全培养基上的菌落明显多于选择培养基，说明选择培养基具有筛选作用。
未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板
未接种的选择培养基平板
接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板
提醒：本实验中有两组对照，一组是未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和选择培养基平板，另一组是已接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板。前一组的平板上如果没有菌落生长，可以说明培养基在使用前未被杂菌污染；后一组使用的牛肉膏蛋白胨培养基适合几乎所有土壤生物的生长和繁殖，如果该组平板上的菌落数显著多于同一稀释度的选择培养基平板上的，可以说明选择培养基具有选择作用。
2、利用稀释涂布平板法纯化分解尿素的细菌时，经培养后发现培养基上出现多种菌落，可能的原因有哪些？
出现杂菌污染的可能原因有： ①培养基制备过程中被杂菌污染； ②接种过程中，无菌操作不符合要求； ③系列稀释时，无菌操作不符合要求等。
1、为什么测定活菌的数量不能用平板划线法？
由于在所划的线中，一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个细菌形成的菌落，而其他一些菌落往往由两个细菌或多个细菌繁殖而成，而在计数时一个菌落对应着一个细菌，这样在划线所得的平板中，菌落数目远低于活菌的实际数值，所以不能用平板划线法测定活菌数量。
3、请判断对错。 ①选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。(× ) ②培养分解尿素的细菌，培养基的pH会增大。 ( √ ) ③在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应环境中去寻找。( √ ) ④统计的分解尿素的细菌菌落数目就是样品中分解尿素的活菌数目。( × ) ⑤稀释涂布平板法和平板划线法均能得到单菌落，都可用于细胞计数。( × ) ⑥稀释涂布平板法计数时，平板上的一个菌落就是一个细菌（×） ⑦刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌（×） ⑧利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量。( × ) ⑨利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数。( × ) ⑩统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行计数。 ( × )⑪对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法。( × )
4、下列关于测定土壤中微生物数量的叙述，错误的是( ) A．显微镜直接计数计算的结果比实际值偏大 B．当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落 C．采用稀释涂布平板法获得的菌落数往往少于实际的活菌数 D．统计菌落数目时，只要菌落数目在30～300的平板都可以计数，并以它们的平均值作为统计结果 5、下列关于“检测土壤中某种微生物总数”实验操作的叙述，错误的是( ) A．一般选择距地表约3～8 cm的土壤层进行取样 B．不同微生物均可取104、105、106倍的土壤稀释液进行接种操作 C．将实验组和对照组平板倒置，一般在适宜且恒温条件下培养1～2 d D．确定对照组无菌后，选择菌落数在30～300之间的实验组平板进行计数
6、如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是 ( )
A．3号试管中的菌落稀释倍数为103倍 B．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能是5号试管的10倍 C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×107个 D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高
7．下表是某同学配制的一种培养基的配方。下列有关叙述正确的是( )A. 若根据用途划分，该培养基属于选择培养基B．若用该培养基筛选土壤中的尿素分解菌，应将蛋白胨改成尿素C．在该培养基上生长的大肠杆菌，其菌落颜色呈红色D．该培养基中含有维生素，若培养霉菌需将pH调至碱性
8、饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，若在饲料中添加植酸酶，则能催化其水解为可以吸收利用的磷酸盐等。如图是从作物根部土壤中分离产植酸酶的菌株的过程，图中①～⑤表示操作过程。下列说法错误的是( )
A．通过图中①～④逐渐稀释，目的是获得单个菌落 B．图中培养基从功能上讲属于选择培养基 C．高压蒸汽灭菌锅灭菌的要求是100 ℃ D．实验结果显示产植酸酶的理想菌株是E菌株
9、(2019·北京高考)筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈(如图)，实验结果见下表。
有关本实验的叙述，错误的是( ) A．培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质 B．筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布 C．以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外 D．H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
10、(2021·山东)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是（ ） A. 甲菌属于解脂菌 B. 实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源 C. 可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比 D. 该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
11、(2018·全国卷Ⅰ)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制______的生长，加入了链霉素的培养基属于______培养基。(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有________________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有______________(答出两点即可)。(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是______，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是_______________________________。(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是__________________________________________________________________________。
淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈
乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差
12、(2020·全国Ⅰ)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用 的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是 。甲、乙培养基均属于_____培养基。(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释 倍。
高压蒸汽灭菌(湿热灭菌)
(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是 (答出1点即可)。(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤。
取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数
(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即 。
1、发酵工程的概念 发酵工程是指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。它涉及菌种的选育和培养、产物的分离和提纯等方面。
2、发酵工程的基本环节
2、发酵工程的基本环节
发酵罐内发酵(中心环节)
3、啤酒发酵的工业化生产流程及操作目的
大麦种子发芽，释放淀粉酶
酵母菌将糖转化为酒精和二氧化碳
4、啤酒发酵的工业化生产流程及操作目的
（1）在食品工业上的应用 生产传统的发酵产品、食品添加剂、酶制剂等。
（2）在医药工业上的应用 ①获得具有某种药物生产能力的微生物。 ②直接对菌种进行改造，再通过发酵技术大量生产所需要的产品。 ③利用基因工程，将病原体的某个或某几个抗原基因转入适当的微生物细胞，获得的表达产物可以作为疫苗使用。
（3）在农牧业上的应用：生产微生物肥料、农药和饲料。（4）其他方面的应用 ①利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质。 ②极端微生物的应用：嗜热菌、嗜盐菌可以用来生产洗涤剂，嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量。
1、发酵罐中设计搅拌叶轮进行搅拌的意义是什么？
使菌种与发酵底物更能充分接触，提高发酵效率； 有利于微生物发酵过程中产生的热量传递给冷却介质； 能使发酵液充分混合，发酵罐的发酵液中的固型物质保持悬浮状态。
2、生产啤酒时，需进行后发酵的原因是 。
主发酵结束后，发酵液不能适合饮用，要在低温、密闭的环境下储存一段时间后进行后发酵，这样才能形成澄清、成熟的啤酒
3、请判断对错。(1)在发酵工程中，可通过诱变育种、基因工程育种获得菌种( )(2)分离、提纯酵母菌发酵生产的单细胞蛋白，可采用过滤、沉淀等方法( )(3)在连续培养过程中补充的同种培养液和空气须先灭菌( )(4)乳酸菌可以代替酵母菌用于乙醇的生产( )(5)发酵罐中微生物的生长繁殖、代谢物的形成速度都与搅拌速度有关( )(6)单细胞蛋白是从微生物细胞中提取出来的( )(7)发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种 ( )(8)谷氨酸发酵生产时，在酸性条件下积累较多的谷氨酰胺( )(9)发酵工程的废弃物对环境污染小并且容易处理( )(10)发酵工程的产品主要包括微生物的代谢物、酶及菌体本身( )
4、(2018·江苏)某高校采用如图所示的发酵罐进行葡萄酒主发酵过程的研究，下列叙述错误的是( ) A. 夏季生产果酒时，常需对罐体进行降温处理 B. 乙醇为挥发性物质，故发酵过程中空气的进气量不宜太大 C. 正常发酵过程中罐内的压力不会低于大气压 D. 可以通过监测发酵过程中残余糖的浓度来决定何时终止发酵
（1）为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为 ，并不断提高其浓度，经多次传代培养（指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养）以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用 的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有________________等（答出两种方法即可）。
5、（2021·广东卷）中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜（甘蔗榨糖后的废弃液，含较多蔗糖）为原料，在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图。回答下列问题：
诱变育种、基因工程育种
稀释涂布平板法（血细胞计数法）
（2）基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60 g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60 d以上。该系统不需要灭菌的原因是_____________________________________________（答出两点即可）。
培养基是高盐浓度的液体环境，杂菌会由于渗透失水而死亡；培养基的液体环境是碱性的，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制
（3）研究人员在工厂进行扩大培养，在适宜的营养物浓度、温度、pH条件下发酵，结果发现发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中 可能是高密度培养的限制因素。（4）菌株H还能通过分解餐厨垃圾（主要含蛋白质、淀粉、油脂等）来生产PHA，说明其能分泌_____________________________________________________。
蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和PHA合成相关的酶
第3课时 发酵工程
第十六单元 生物技术与工程
能明确发酵的概念和基本原理，简述传统发酵技术；通过泡菜、果酒和果醋等传统发酵食品的制作，了解传统发酵技术应用的优点和不足。
明确培养基的配制方法和微生物纯培养的基本要求，能将无菌操作、倒平板和平板划线等基本技能应用到酵母菌的纯培养过程中。
明确发酵工程的基本环节，了解发酵工程的应用。
能应用生物与环境相适应的观点阐明微生物选择培养的原理，能应用稀释涂布平板法和微生物数量测定的方法，进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。
1、发酵与传统发酵技术
一、传统发酵技术的应用
发酵是指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物的代谢转化为人类所需要的产物的过程。
直接利用原材料中 的微生物，或利用前一次发酵 的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术一般称为传统发酵技术。
经过微生物(如酵母、曲霉和毛霉等，其中 起主要作用)的发酵，豆腐中的蛋白质被分解成小分的 ，味道鲜美，易于消化吸收，而腐乳本身又便于保存。
传统发酵以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主，通常是家庭式或作坊式的。
配制质量分数为5%〜20%的盐水，煮沸、冷却待用。
新鲜蔬菜洗净，切成块状或条状，晾干后装入泡菜坛内；装至半坛时，放入调味剂，继续装至八成满。
将盐水倒入坛中，使盐水没过全部菜料，盖好坛盖。
向坛盖边沿的水槽中注满水，并在发酵过程中注意经常向水槽中补充水，根据室内温度控制发酵时间。
2、尝试制作传统发酵食品
①原理：利用乳酸菌的无氧呼吸，将葡萄糖分解成乳酸。
●食盐的作用是调味和抑制其他微生物的生长。●盐水浓度要适宜。过低会造成细菌污染，导致泡菜变质；过高会抑制乳酸菌 发酵，延长泡菜成熟的时间。●盐水煮沸的目的是杀菌除氧；盐水冷却待用是防止高温杀死乳酸菌。
●泡菜坛密封性要好；●蔬菜洗净后，若没有晾干，泡菜容易变质。可在坛内加入少量白酒，防止泡 菜变质；●泡菜装八成满是防止发酵液从坛内溢出；●创造无氧环境的：盐水煮沸、盐水没过菜料、坛边水槽注满水等；
泡菜成熟的时间受蔬菜种类、发酵温度、食盐浓度等的影响
选择新鲜的葡萄，榨汁前先冲洗，后除去枝梗，以防葡萄汁流失及杂菌污染。不要反复冲洗，避免菌种流失。葡萄冲洗清理后要沥干。
发酵瓶、榨汁机等器具洗净，并用70%的酒精消毒，晾干备用
原理：利用酵母菌(异养兼性厌氧菌)无氧呼吸产生酒精。温度：18~30℃时间：10~12天对氧的需求：前期通气，后期密封
●发酵瓶装入葡萄汁后，要留有大约1/3的空间，盖好瓶盖。如用带盖的瓶子(A图)制果酒，每隔12h左右将瓶盖拧松排气（注意：不是打开瓶盖，防止杂菌污染），此后再拧紧瓶盖。●若用B图装置制酒，装入葡萄汁后应封闭充气口。
原理：利用醋酸菌(异养好氧菌) 在：①O2和糖源都充足时，将糖分解成乙酸；②O2充足，缺少糖源时，能将乙醇→乙醛→乙酸。温度：30~35℃时间：7~8天对氧的需求：全程需氧
A图 B图
葡萄酒制作完成后，打开瓶盖，盖上一层纱布，进行葡萄醋的发酵。
3、传统发酵技术存在的不足
传统发酵食品的制作过程中，没有接种菌种，利用的天然菌种，菌种差异、杂菌情况不明和发酵过程的控制缺乏标准等，往往会造成发酵食品的品质不一。
2、泡菜制作过程中，各阶段菌种如何变化？ ①发酵初期：主要是大肠杆菌、酵母菌活跃，消耗大量氧气，使坛内形成无氧环境，会使好氧菌生命活动逐渐被抑制。 ②发酵中期（风味最佳）：乳酸菌活跃使乳酸不断积累，pH下降，会使不耐酸菌被抑制 ③发酵后期：乳酸继续增加，到一定程度后会使乳酸菌的生长繁殖被抑制。
1、在泡菜制作过程中营造“无氧环境”的3项措施是什么？
（1）选择的泡菜坛要密封性好。（2）加入蔬菜后要注入煮沸冷却的盐水，使盐水没过全部菜料。（3）盖上坛盖后要在坛盖边沿的水槽中注满清水。
3、正常情况下，泡菜制作过程中，乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的含量如何变化？
乳酸菌含量先增加后下降；乳酸含量逐渐增多，最后趋于稳定；亚硝酸盐含量先增加后下降，最后趋于稳定。
5、某同学在制作泡菜前，查阅资料得知，可以向泡菜坛中加入一些“陈泡菜水”；在用质量分数为5%的食盐水制作泡菜时，他在不同时间测定了泡菜中亚硝酸盐的含量，结果见曲线图。（1）据图分析，从亚硝酸盐的含量来看，你认为该泡菜在什么时间食用比较合适？为什么？
第11天后。因为这时亚硝酸盐的含量已经降到较低水平。
（2）他第一次制作出的泡菜“咸而不酸”，造成这个结果最可能的原因是什么？
（3）加入“陈泡菜水”的目的是什么？
可能是食盐浓度过高，发酵温度过低等原因导致泡菜未能正常发酵。
“陈泡菜水”中含有纯度较高的乳酸菌，加入“陈泡菜水”相当于接种酵母菌。
4、为什么泡菜坛内有时会长一层白膜？你认为这层白膜是怎么形成的？
白膜是由产膜酵母的繁殖形成的。酵母菌是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌繁殖。
6、在制作果酒和果醋的过程中，发酵液分别有哪些变化？其中最明显的变化发生在发酵后多少天？引起变化的原因是什么？
在葡萄酒的制作过程中，发酵液中会产生气泡，这是因为酵母菌发酵产生CO2；如果是用紫色葡萄制作葡萄酒，随着发酵时间的延长，由果皮进入发酵液的花青素会越来越多，因而发酵液的颜色会逐渐加深变成深红色。葡萄醋发酵过程中一般不会出现气泡，发酵完成时，在发酵液的表面上会出现一层菌膜，这是醋酸菌膜。
7、在制作果酒的过程中，除了酵母菌，是否还有其他微生物生长？它们会对果酒发酵产生影响吗？如果有，如何避免这种影响？
制作果酒的过程中，除酵母菌之外，还会有其他杂菌生长，它们会在酒精发酵中污染发酵液，而避免发酵液污染需要从发酵制作的过程全面考虑。例如，榨汁机、发酵瓶要清洗干净，装入葡萄汁后，封闭充气口；每次排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等。
8、有3位同学分别采用了3种不同的发酵装置来制作果醋。A同学用的是带盖的塑料瓶；B同学用了没有盖的塑料瓶，在发酵过程中无盖的瓶口一直由捆绑在瓶口的8层纱布覆盖；C同学则设计了如下图所示的发酵装置。结合果醋的制作原理，你认为哪一种发酵装置更适合制作果醋？你还能继续改进这种装置吗？
9、当把少量制作转化为大规模生产时，需要解决哪些实际问题？
10、请判断对错。 ①微生物发酵产生了不同的代谢物使得臭豆腐具有特殊的味道。(√) ②乳酸菌是厌氧细菌，无氧呼吸产物是乳酸与CO2。(×) ③亚硝酸盐会危害人体健康，一定要禁止食用。(×) ④葡萄酒的自然发酵中，起主要作用的是突变型酵母菌。(×) ⑤只要O2充足醋酸菌发酵的产物是一样的。(×) ⑥在配制泡菜水时，应将清水煮沸冷却后再配制质量分数为5%～20%的盐水。(×) ⑦葡萄酒的制作离不开酵母菌，制作过程中随着发酵的进行发酵液中糖含量增加。(×) ⑧用白萝卜制作泡菜的过程中，向容器中通入无菌空气可缩短腌制时间。(×) ⑨随着发酵时间的延长，泡菜中乳酸含量逐渐增加，所以泡菜腌制时间越长越好。(×) ⑩在制作果酒过程中，只有酵母菌进行发酵，没有其他微生物生长。(×) ⑪在制作果醋的过程中，需将瓶盖打开为醋酸菌提供氧气，盖上纱布以减少空气中杂质的污染。(√) ⑫在果酒、果醋的发酵装置中，充气口的作用是在酒精发酵时连接充气泵进行充气，排气口的作用是在酒精发酵时排出二氧化碳。(×)
11、（2021·辽宁卷）利用菠萝蜜制作果醋的大致流程为：先在灭菌的果肉匀浆中接种酵母菌，发酵6天后，再接入活化的醋酸菌，发酵5天。下列有关叙述错误的是（ ） A. 乙醇既是乙酸发酵的底物，又可以抑制杂菌繁殖 B. 酵母菌和醋酸菌均以有丝分裂的方式进行增殖 C. 酵母菌和醋酸菌发酵过程中控制通气的情况不同 D. 接入醋酸杆菌后，应适当升高发酵温度 12、（2021·湖北卷）中国的许多传统美食制作过程蕴含了生物发酵技术。下列叙述正确的是（ ） A. 泡菜制作过程中，酵母菌将葡萄糖分解成乳酸 B. 制作过程中，酵母菌进行呼吸作用产生CO2 C. 米酒制作过程中，将容器密封可以促进酵母菌生长 D. 酸奶制作过程中，后期低温处理可产生大量乳酸菌
13、(2020·江苏卷)某同学在线提交了在家用带盖玻璃瓶制作果酒和果醋的实验报告，他的做法错误的是( ) A. 选择新鲜的葡萄略加冲洗，除去枝梗后榨汁 B. 将玻璃瓶用酒精消毒后，装满葡萄汁 C. 酒精发酵期间，根据发酵进程适时拧松瓶盖放气 D. 酒精发酵后去除瓶盖，盖一层纱布，再进行醋酸发酵 14、(2021·山东卷)葡萄酒的制作离不开酵母菌。下列说法错误的是( ) A．无氧条件下酵母菌能存活但不能大量繁殖 B．自然发酵制作葡萄酒时起主要作用的菌是野生型酵母菌 C．葡萄酒颜色是葡萄皮中的色素进入发酵液形成的 D．制作过程中随着发酵的进行发酵液中糖含量增加
15、[2022·枣庄模拟]泡菜(乳酸发酵过的蔬菜)是许多亚洲国家的传统食品，在发酵液中通常发现的微生物包括乳酸菌、酵母菌和丝状真菌。如图表示这3种不同微生物群中活细胞数和卷心菜乳酸发酵过程中pH的变化。发酵液中的溶解氧随时间下降，在第22天被完全耗尽。下列说法错误的是( ) A. pH从第1天到第3天的下降主要由乳酸菌产生的乳酸引起 B．酵母菌从第10天到第22天的生长与发酵液中的氧气有关 C．酵母菌在第26天后开始产生酒精 D．一些丝状真菌在低pH下表现出较高的耐受性
二、微生物的培养技术及应用
1、微生物的基本培养技术
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
水、无机盐、碳源、氮源等营养物质，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求
原理：生物与环境相适应概念：允许特定种类的微生物生长，同时抑制 或阻止其他种类微生物生长的培养基用途：富集、分离特定微生物
注意：有些碳源也是能源物质；有机氮源也能作为碳源，有些无机氮源也可作为能源；
氮元素是微生物合成蛋白质、核酸所必需的物质
①避免杂菌的污染，以获得纯净的微生物培养物；②避免操作者被微生物感染。
使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。
煮沸消毒、巴氏消毒、化学药物消毒、紫外线消毒等
使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
湿热灭菌、干热灭菌和灼烧灭菌等
对操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。为避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触，之后的许多操作都应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。
煮沸消毒（100℃，5～6min）常用
巴氏消毒不破坏营养成分
化学药物消毒可擦拭的表面、液体
水蒸气为介，100kPa，121℃，15~30min
热空气为介质，160~170℃，2~3h
接种用具如涂布器、接种环、接种针或其它金属用具
在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
微生物的纯培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。
③实例——酵母菌的纯培养
分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。
配制培养基(包括调整PH)、灭菌、倒平板
将接种后的平板和一个未接种的平板(对照)倒置培养
④实例——酵母菌的纯培养
3、操作时，接种环通过灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是什么？
将聚集的菌体逐步稀释以便获得不连续的单个菌落。
2、倒平板操作中，平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是什么？
1、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
不能。因为空气中的微生物可能在皿盖和皿底之间的培养基上滋生，可能会造成污染。
防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上(污染培养基和破坏菌落)； 防止培养基水分过快蒸发。
4、某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？
最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌； 采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。
5、请判断对错。 ①在培养细菌时，要将培养基调至中性或弱酸性。 (×) ②消毒能杀死材料表面的所有微生物。 (×) ③配制培养基时应先灭菌再调pH（×） ④无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料（如培养基、接种环等）都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌（×） ⑤微生物的纯培养步骤为配制培养基→接种→灭菌→分离和培养等。 (×) ⑥需要将一个不接种的培养基放在相同的条件下培养，以检验培养基的灭菌是否合格。(√) ⑦倒平板就是等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。(×) ⑧倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。 (×) ⑨为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。 (×) ⑩若无菌操作合格，在接种酵母菌的培养基上应观察到不同形态、不同颜色的酵母菌菌落。(×) ⑪平板划线时要注意将最后一次的划线与第一次的划线相连。 (×)
6、养殖池中存在的有毒物质主要是氨和亚硝酸，这两种物质可由硝化细菌吸收利用。研究人员从养殖池池泥中分离出硝化细菌并进行了计数。下列有关叙述正确的是（ ） A. 需配制一定浓度含氨盐的牛肉膏蛋白胨培养基以分离硝化细菌 B. 配制的培养基经高压蒸汽灭菌后通常还需要调节pH才能使用 C. 涂布时，用涂布器蘸取少量菌液并均匀地涂布在培养基的表面 D. 使用稀释涂布平板法统计得到的菌落数目往往比活菌的实际数目少 7、(2020·江苏高考)为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素分解菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是( ) A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整 B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落 C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的 D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
8、[2021·湖南卷]大熊猫是我国特有的珍稀野生动物，每只成年大熊猫每日进食竹子量可达12～38kg。大熊猫可利用竹子中8%的纤维素和27%的半纤维素。研究人员从大熊猫粪便和土壤中筛选纤维素分解菌。回答下列问题：（1）为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以________为唯一碳源的固体培养基上进行培养，该培养基从功能上分类属于_____培养基。（2）配制的培养基必须进行灭菌处理，目的是 。 。检测固体培养基灭菌效果的常用方法是______________________。（3）简要写出测定大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数的实验思路。
为了杀死培养基中的所有微生物(微生物和
不接种培养(或空白培养)
将大熊猫新鲜粪便样液稀释适当倍数后，取0.1 mL涂布到若干个平板(每个稀释度至少涂布三个平板)，对菌落数在30～300的平板进行计数，则可根据公式推测大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数。
（4）为高效降解农业秸秆废弃物，研究人员利用从土壤中筛选获得的3株纤维素分解菌，在37 ℃条件下进行玉米秸秆降解实验，结果如表所示。在该条件下纤维素酶活力最高的是菌株_____，理由是 。
接种C菌株后秸秆失重最多，纤维素降解率最大
9、[2020·全国卷Ⅰ]某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用____________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是_____。甲、乙培养基均属于______培养基。(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释____倍。(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是_________________________________________(答出1点即可)。
S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤：_______________________________________________________。(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即________________________。
取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数
水、碳源、氮源和无机盐
10、[全国卷Ⅱ]物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解W的细菌(目标菌)。回答下列问题。(1)要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是___。 (2)在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌落(如图所示)。如果要得到目标菌，应该选择____菌落进一步纯化，选择的依据是_____________________________________。(3)土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即_______。
乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解W
将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源
(4)该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶(酶E)。为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酶E的缓冲液，B处滴加含有相同浓度天然酶的缓冲液，C处滴加_______，三处滴加量相同。②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明__________________；若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明___________________________。
酶E与天然酶降解W的能力相近
2、微生物的选择培养和计数
（1）选择培养基配方的设计(以分离土壤中尿素分解菌为例)
②设计培养基的配方
只以尿素作为唯一氮源，培养基的其他营养成分与普通培养基相同
（2）微生物的选择培养(以土壤中尿素分解菌为例)
利用稀释涂布平板法和选择培养基对微生物进行选择培养。
将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
①取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
②将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
③将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
④用涂布器将菌液均匀地涂布在选择培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被选择培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37℃培养1～2d。
在适宜稀释度的平板上可以分离得到单菌落。
（3）微生物的数量测定
①利用稀释涂布平板法计数
a、为了保证结果准确，一般选择菌落数在30〜300的平板计数，并且在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，并求出平均值。
若105倍稀释下三个平板上的菌落数依次为26、30、31。此时可以设置新的稀释倍数5×104，以使平板上的菌落计数结果更加准确。
若105倍稀释下三个平板上的菌落数依次为38、42、195。由于数据偏差过大，此时应考虑重新实验。
b、统计结果往往比实际值少。
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
②利用显微镜进行直接计数
利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和。
（4）土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
①原理：绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
②计数方法：稀释涂布平板法。
若土样稀释105倍，取0.1mL涂布在三个平板上，培养后三个平板上的菌落数依次为46、47、54。求每克土样中有多少分解尿素的细菌。
解：三个平板上的菌落数平均值=（46＋47＋54）个/3=49个；105倍稀释后菌液的种群密度=49个÷0.1mL=490/mL；高倍稀释后1mL≈1g，因此可记作490个/g；未稀释前菌液的种群密度=490个/g×105=4.9×107个 /g
问题：如何确定培养基是否有杂菌污染以及选择培养基是否有选择作用？
结果结论：若未接种的培养基上没有菌落生长，说明培养基没有被污染。
选择培养基是否具有筛选作用？
自变量：接种不同培养基(选择培养基和完全培养基)
结果结论：若接种后的完全培养基上的菌落明显多于选择培养基，说明选择培养基具有筛选作用。
未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板
未接种的选择培养基平板
接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板
提醒：本实验中有两组对照，一组是未接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板和选择培养基平板，另一组是已接种的牛肉膏蛋白胨培养基平板。前一组的平板上如果没有菌落生长，可以说明培养基在使用前未被杂菌污染；后一组使用的牛肉膏蛋白胨培养基适合几乎所有土壤生物的生长和繁殖，如果该组平板上的菌落数显著多于同一稀释度的选择培养基平板上的，可以说明选择培养基具有选择作用。
2、利用稀释涂布平板法纯化分解尿素的细菌时，经培养后发现培养基上出现多种菌落，可能的原因有哪些？
出现杂菌污染的可能原因有： ①培养基制备过程中被杂菌污染； ②接种过程中，无菌操作不符合要求； ③系列稀释时，无菌操作不符合要求等。
1、为什么测定活菌的数量不能用平板划线法？
由于在所划的线中，一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个细菌形成的菌落，而其他一些菌落往往由两个细菌或多个细菌繁殖而成，而在计数时一个菌落对应着一个细菌，这样在划线所得的平板中，菌落数目远低于活菌的实际数值，所以不能用平板划线法测定活菌数量。
3、请判断对错。 ①选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。(× ) ②培养分解尿素的细菌，培养基的pH会增大。 ( √ ) ③在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应环境中去寻找。( √ ) ④统计的分解尿素的细菌菌落数目就是样品中分解尿素的活菌数目。( × ) ⑤稀释涂布平板法和平板划线法均能得到单菌落，都可用于细胞计数。( × ) ⑥稀释涂布平板法计数时，平板上的一个菌落就是一个细菌（×） ⑦刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌（×） ⑧利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量。( × ) ⑨利用稀释涂布平板法统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数。( × ) ⑩统计菌落数目时为保证结果准确，一般选择菌落数目最多的平板进行计数。 ( × )⑪对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法。( × )
4、下列关于测定土壤中微生物数量的叙述，错误的是( ) A．显微镜直接计数计算的结果比实际值偏大 B．当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落 C．采用稀释涂布平板法获得的菌落数往往少于实际的活菌数 D．统计菌落数目时，只要菌落数目在30～300的平板都可以计数，并以它们的平均值作为统计结果 5、下列关于“检测土壤中某种微生物总数”实验操作的叙述，错误的是( ) A．一般选择距地表约3～8 cm的土壤层进行取样 B．不同微生物均可取104、105、106倍的土壤稀释液进行接种操作 C．将实验组和对照组平板倒置，一般在适宜且恒温条件下培养1～2 d D．确定对照组无菌后，选择菌落数在30～300之间的实验组平板进行计数
6、如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是 ( )
A．3号试管中的菌落稀释倍数为103倍 B．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数可能是5号试管的10倍 C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×107个 D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高
7．下表是某同学配制的一种培养基的配方。下列有关叙述正确的是( )A. 若根据用途划分，该培养基属于选择培养基B．若用该培养基筛选土壤中的尿素分解菌，应将蛋白胨改成尿素C．在该培养基上生长的大肠杆菌，其菌落颜色呈红色D．该培养基中含有维生素，若培养霉菌需将pH调至碱性
8、饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，若在饲料中添加植酸酶，则能催化其水解为可以吸收利用的磷酸盐等。如图是从作物根部土壤中分离产植酸酶的菌株的过程，图中①～⑤表示操作过程。下列说法错误的是( )
A．通过图中①～④逐渐稀释，目的是获得单个菌落 B．图中培养基从功能上讲属于选择培养基 C．高压蒸汽灭菌锅灭菌的要求是100 ℃ D．实验结果显示产植酸酶的理想菌株是E菌株
9、(2019·北京高考)筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后，若细菌能分解淀粉，培养平板经稀碘液处理，会出现以菌落为中心的透明圈(如图)，实验结果见下表。
有关本实验的叙述，错误的是( ) A．培养基除淀粉外还含有氮源等其他营养物质 B．筛选分解淀粉的细菌时，菌液应稀释后涂布 C．以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外 D．H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
10、(2021·山东)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将不能直接吸收脂肪的甲、乙两种菌分别等量接种在醇溶青琼脂平板上培养。甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法错误的是（ ） A. 甲菌属于解脂菌 B. 实验中所用培养基以脂肪为唯一碳源 C. 可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比 D. 该平板可用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
11、(2018·全国卷Ⅰ)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制______的生长，加入了链霉素的培养基属于______培养基。(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有________________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有______________(答出两点即可)。(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是______，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是_______________________________。(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是__________________________________________________________________________。
淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈
乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差
12、(2020·全国Ⅰ)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、水和S，乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题：(1)实验时，盛有水或培养基的摇瓶通常采用 的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是 。甲、乙培养基均属于_____培养基。(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107个/mL，若要在每个平板上涂布100 μL稀释后的菌液，且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个，则至少应将摇瓶M中的菌液稀释 倍。
高压蒸汽灭菌(湿热灭菌)
(3)在步骤⑤的筛选过程中，发现当培养基中的S超过某一浓度时，某菌株对S的降解量反而下降，其原因可能是 (答出1点即可)。(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数，请写出主要实验步骤。
取淤泥加入无菌水中，涂布(或稀释涂布)到乙培养基上，培养后计数
(5)上述实验中，甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同，但都能为细菌的生长提供4类营养物质，即 。
1、发酵工程的概念 发酵工程是指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。它涉及菌种的选育和培养、产物的分离和提纯等方面。
2、发酵工程的基本环节
2、发酵工程的基本环节
发酵罐内发酵(中心环节)
3、啤酒发酵的工业化生产流程及操作目的
大麦种子发芽，释放淀粉酶
酵母菌将糖转化为酒精和二氧化碳
4、啤酒发酵的工业化生产流程及操作目的
（1）在食品工业上的应用 生产传统的发酵产品、食品添加剂、酶制剂等。
（2）在医药工业上的应用 ①获得具有某种药物生产能力的微生物。 ②直接对菌种进行改造，再通过发酵技术大量生产所需要的产品。 ③利用基因工程，将病原体的某个或某几个抗原基因转入适当的微生物细胞，获得的表达产物可以作为疫苗使用。
（3）在农牧业上的应用：生产微生物肥料、农药和饲料。（4）其他方面的应用 ①利用纤维废料发酵生产酒精、乙烯等能源物质。 ②极端微生物的应用：嗜热菌、嗜盐菌可以用来生产洗涤剂，嗜低温菌有助于提高热敏性产品的产量。
1、发酵罐中设计搅拌叶轮进行搅拌的意义是什么？
使菌种与发酵底物更能充分接触，提高发酵效率； 有利于微生物发酵过程中产生的热量传递给冷却介质； 能使发酵液充分混合，发酵罐的发酵液中的固型物质保持悬浮状态。
2、生产啤酒时，需进行后发酵的原因是 。
主发酵结束后，发酵液不能适合饮用，要在低温、密闭的环境下储存一段时间后进行后发酵，这样才能形成澄清、成熟的啤酒
3、请判断对错。(1)在发酵工程中，可通过诱变育种、基因工程育种获得菌种( )(2)分离、提纯酵母菌发酵生产的单细胞蛋白，可采用过滤、沉淀等方法( )(3)在连续培养过程中补充的同种培养液和空气须先灭菌( )(4)乳酸菌可以代替酵母菌用于乙醇的生产( )(5)发酵罐中微生物的生长繁殖、代谢物的形成速度都与搅拌速度有关( )(6)单细胞蛋白是从微生物细胞中提取出来的( )(7)发酵工程中所用的菌种大多是单一菌种 ( )(8)谷氨酸发酵生产时，在酸性条件下积累较多的谷氨酰胺( )(9)发酵工程的废弃物对环境污染小并且容易处理( )(10)发酵工程的产品主要包括微生物的代谢物、酶及菌体本身( )
4、(2018·江苏)某高校采用如图所示的发酵罐进行葡萄酒主发酵过程的研究，下列叙述错误的是( ) A. 夏季生产果酒时，常需对罐体进行降温处理 B. 乙醇为挥发性物质，故发酵过程中空气的进气量不宜太大 C. 正常发酵过程中罐内的压力不会低于大气压 D. 可以通过监测发酵过程中残余糖的浓度来决定何时终止发酵
（1）为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为 ，并不断提高其浓度，经多次传代培养（指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养）以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用 的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有________________等（答出两种方法即可）。
5、（2021·广东卷）中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜（甘蔗榨糖后的废弃液，含较多蔗糖）为原料，在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图。回答下列问题：
诱变育种、基因工程育种
稀释涂布平板法（血细胞计数法）
（2）基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60 g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60 d以上。该系统不需要灭菌的原因是_____________________________________________（答出两点即可）。
培养基是高盐浓度的液体环境，杂菌会由于渗透失水而死亡；培养基的液体环境是碱性的，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制
（3）研究人员在工厂进行扩大培养，在适宜的营养物浓度、温度、pH条件下发酵，结果发现发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中 可能是高密度培养的限制因素。（4）菌株H还能通过分解餐厨垃圾（主要含蛋白质、淀粉、油脂等）来生产PHA，说明其能分泌_____________________________________________________。
蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和PHA合成相关的酶
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