专题25 基因工程-十年（2014-2023）高考生物真题分项汇编（全国通用）

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TOC \ "1-3" \h \z \u \l "_Tc14878" 〖2023年高考真题〗 PAGEREF _Tc14878 \h 1
\l "_Tc5848" 〖2022年高考真题〗 PAGEREF _Tc5848 \h 17
\l "_Tc29804" 〖2021年高考真题〗 PAGEREF _Tc29804 \h 30
\l "_Tc17559" 〖2020年高考真题〗 PAGEREF _Tc17559 \h 47
\l "_Tc3282" 〖2019年高考真题〗 PAGEREF _Tc3282 \h 54
\l "_Tc28570" 〖2018年高考真题〗 PAGEREF _Tc28570 \h 58
\l "_Tc9163" 〖2017年高考真题〗 PAGEREF _Tc9163 \h 64
\l "_Tc1223" 〖2016年高考真题〗 PAGEREF _Tc1223 \h 68
\l "_Tc28567" 〖2015年高考真题〗 PAGEREF _Tc28567 \h 73
\l "_Tc12941" 〖2014年高考真题〗 PAGEREF _Tc12941 \h 79
〖2023年高考真题〗
1．（2023·天津·统考高考真题）根据下图，正确的是（ ）

A．子代动物遗传性状和受体动物完全一致
B．过程1需要MII期去核卵母细胞
C．过程2可以大幅改良动物性状
D．过程2为过程3提供了量产方式，过程3为过程1、2提供了改良性状的方式
【答案】D
【详解】A、子代动物的遗传性状与供体基本一致，但与受体无关，A错误；B、核移植过程中需要处于MII中期的去核卵母细胞，而过程1是培育试管动物，需要培育到适宜时期（桑葚胚或囊胚等时期）进行胚胎移植，B错误；C、过程2得到的是克隆动物，是无性生殖的一种，不能大幅改良动物性状，C错误；D、过程2克隆技术可得到大量同种个体，为过程3提供了量产方式；过程3是转基因技术，转基因可导入外源优良基因，为过程1、2提供了改良性状的方式，D正确。故选D。
2．（2023·湖南·统考高考真题）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。下列叙述错误的是（ ）

A．细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的
B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害
C．敲除AT1基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力
D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径
【答案】B
【详解】A、由题图右侧的信息可知，AT1蛋白缺陷，可以促进PIP2s蛋白的磷酸化，进而促进H2O2排出膜外，A正确；B、据题图左侧的信息可知，AT1蛋白能够抑制PIP2s蛋白的磷酸化，减少了H2O2从细胞内输出到细胞外的量，导致抗氧化胁迫能力弱，不能减轻其对细胞的毒害，B错误；C、结合对A选项的分析可推测，敲除AT1基因或降低其表达，可提高禾本科农作物抗氧化胁迫的能力，进而提高其成活率，C正确；
D、从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因，可通过基因工程技术改良农作物抗逆性，D正确。故选B。
3．（2023·湖北·统考高考真题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）

A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
【答案】D
【详解】A、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确。
B、若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；C、DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；D、SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因（AmpR），因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。故选D。
4．（2023·浙江·统考高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。

下列叙述正确的是（ ）
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
【答案】B
【详解】A、分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；B、因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；C、整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3-GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；D、用引物1和引物3进行PCR扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好的区分片段，D错误。故选B。
5．（2023·山西·统考高考真题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。

下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E. cli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. cli DNA连接酶连接
【答案】C
【详解】A、酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；B、质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；C、质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；D、若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。故选C。
6．（2023·江苏·统考高考真题）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：

(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有 ，扩增程序中最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2．引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用__________________。

A．ATGGTG------CAACCA
B．TGGTTG------CACCAT
C．GACGAG------CTGCAG
D．CTGCAG------CTCGTC’
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_____________。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3．根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有 。

对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是
。
【答案】(1)模板（片段F1、片段F2）、引物 引物 (2)CD (3)限制性核酸内切酶（限制酶）
(4)ABC (5)P3、P4 (6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
【详解】（1）PCR反应进行的条件：引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时， 配制的两个反应体系中不同的有模板（片段F1、片段F2）、引物。PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合。引物设计是决定PCR反应成败的最重要因素，因此扩增程序中最主要的不同是引物的设计。（2）由图1可知，引物F2-F用于扩增F2片段，引物F1-R用于扩增F1片段，C选项中5'-GACGAG-3'能与AnBI中左侧部分碱基进行碱基互补配对，因此引物F2-F选用C。D选项中5'-CTGCAG-3'能与EGFP中的右侧部分序列进行碱基互补配对，因此引物F1-R选用D。（3）传统重组质粒构建需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在DNA连接酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制性核酸内切酶（限制酶）。（4）A、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，用稀释涂布平板法筛选时，菌落数可能低于30，A错误；B、培养基冷却后才能接种，抗性平板上未长出菌落，一般不是培养基温度太高所致，B错误；C、转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；D、稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。故选ABC。（5）EGFP为720bp，AnBI为390bp，二者的总大小为720bp+390bp=1100bp，用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增，其大小接近于P1、P2，根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。（6）琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
7．（2023·北京·统考高考真题）变胖过程中，胰岛B细胞会增加。增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ）。科学家采用胸腺嘧啶类似物标记的方法，研究了L基因缺失导致肥胖的模型小鼠IK中新增B细胞的来源。
(1)EdU和BrdU都是胸腺嘧啶类似物，能很快进入细胞并掺入正在复制的DNA中，掺入DNA的EdU和BrdU均能与 互补配对，并可以被分别检测。未掺入的EdU和BrdU短时间内即被降解。
(2)将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，再培养十几分钟后收集该组孔内全部细胞，检测双标记细胞占EdU标记细胞的百分比（如图）。图中反映DNA复制所需时长的是从 点到 点。

(3)为研究变胖过程中B细胞的增殖，需使用一批同时变胖的小鼠。为此，本实验使用诱导型基因敲除小鼠，即饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，形成小鼠IK。科学家利用以下实验材料制备小鼠IK：
①纯合小鼠Lx：小鼠L基因两侧已插入特异DNA序列（x），但L的功能正常；②Ce酶基因：源自噬菌体，其编码的酶进入细胞核后作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失；③Er基因：编码的Er蛋白位于细胞质，与Er蛋白相连的物质的定位由Er蛋白决定；④口服药T：小分子化合物，可诱导Er蛋白进入细胞核。请完善制备小鼠IK的技术路线： →连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→ →获得小鼠IK。
各种细胞DNA复制所需时间基本相同，但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上。据此，科学家先用EdU饲喂小鼠IK，t2时间后换用BrdU饲喂，再过t2时间后检测B细胞被标记的情况。研究表明，变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，与之相应的检测结果应是
。
【答案】(1)A/腺嘌呤 (2)Q R (3)将Ce酶基因和Er基因连接 饲喂口服药T (4)大多数B细胞没有被BrdU标记
【详解】（1）分析题意可知，EdU和BrdU都是胸腺嘧啶（T）类似物，根据碱基互补配对的原则可知，掺入DNA的EdU和BrdU均能与A（腺嘌呤）互补配对，并可以被分别检测。（2）DNA分子复制时会发生模板链与子链的碱基互补配对，据题可知，将处于细胞周期不同阶段的细胞混合培养于多孔培养板中，各孔同时加入EdU，则EdU会与A结合，导致子链出现放射性，随后每隔一定时间向一组培养孔加入BrdU，则BrdU也会与A结合，使放射性增强，最终实现双标记，随复制完成达到峰值，故结合题图可知，图中反映DNA复制所需时长的是从Q点到R点。（3）分析题意，要制备IK小鼠，需要用诱导型基因敲除小鼠，而饲喂诱导物后小鼠的L基因才会被敲除，结合所给实验材料及药物可知，制备小鼠IK的技术路线为：将Ce酶基因和Er基因连接（Ce酶可作用于x，导致两个x间的DNA片段丢失）→连接到表达载体→转入小鼠Lx→筛选目标小鼠→饲喂口服药T（诱导Er蛋白进入细胞核）→获得小鼠IK。（4）据题可知，变胖过程中增加的B细胞可能源于自身分裂（途径I），也可能来自胰岛中干细胞的增殖、分化（途径Ⅱ），由于但途径I的细胞周期时长（t1）是途径Ⅱ细胞周期时长（t2）的三倍以上，若先用EdU饲喂小鼠IK，各种细胞DNA复制所需时间基本相同，t2时间已经经过一个细胞周期，所有的细胞应都含有EdU标记，实验假设是变胖过程中增加的B细胞大多数来源于自身分裂，即来源于途径I，该过程已经复制的B细胞直接分裂，不会再有DNA复制过程，故t2时间后用BrdU饲喂则不起作用，即大多数B细胞没有被BrdU标记。
8．（2023·海南·高考真题）基因递送是植物遗传改良的重要技术之一，我国多个实验室合作开发了一种新型基因递送系统（切—浸—生芽Cut-Dip-Budding，简称CDB法）。图1与图2分别是利用常规转化法和CDB法在某植物中递送基因的示意图。

回答下列问题。
图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于 ；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和 ，该过程还需要光照，其作用是
。
(2)图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的 。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注 。
(3)图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，可将外源基因递送到植物细胞中的原因是
。
(4)已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B．据此分析，从毛状根中获得阳性毛状根段的方法是 ，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是 ，依据是 。
(5)与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点是
（答出2点即可）。
【答案】(1)脱分化 细胞分裂素 诱导叶绿素的形成；满足叶绿体利用光能制造有机物的需要 (2)遗传特性 转基因标识 (3)Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起 (4)荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根 观察幼苗是否表现出白化特征 PDS缺失会导致植株白化，白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除 (5)操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
【详解】（1）图1中，从外植体转变成愈伤组织的过程属于脱分化过程，该过程的本质是使细胞失去原来特定的结构和功能；从愈伤组织到幼苗的培养过程需要的激素有生长素和细胞分裂素，这两种激素的比值能调控愈伤组织的分化方向，该过程还需要光照，因为叶绿素的形成需要光；且叶绿体利用光能制造有机物，供试管苗生长发育。（2）图1中的愈伤组织，若不经过共培养环节，直接诱导培养得到的植株可以保持植株A的遗传特性。图1中，含有外源基因的转化植株A若用于生产种子，其包装需标注转基因种子，即进行转基因标识。（3）图1与图2中，农杆菌侵染植物细胞时，利用了农杆菌含有的Ti质粒的作用，Ti质粒中的T-DNA能将外源基因递送到植物细胞中，并与植物细胞的染色体DNA整合到一起。（4）已知某酶（PDS）缺失会导致植株白化。某团队构建了用于敲除PDS基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体（含有绿色荧光蛋白标记基因），利用图2中的CDB法将该重组载体导入植株B，长出毛状根，成功获得转化植株B，该过程中通过荧光检测选择带有绿色荧光标记的毛状根即为阳性毛状根段，图2中，鉴定导入幼苗中的基因编辑载体是否成功发挥作用的方法是观察幼苗是否表现出白化特征，因为PDS缺失会导致植株白化，而白化苗的出现意味着通过基因编辑技术成功实现PDS基因的敲除。（5）与常规转化法相比，采用CDB法进行基因递送的优点主要表现在操作方法简单，不需要借助植物组织培养技术进行操作，且培养周期较短。
9．（2023·天津·统考高考真题）基因工程：制备新型酵母菌
(1)已知酵母菌不能吸收淀粉，若想使新型酵母菌可以直接利用淀粉发酵，则应导入多步分解淀粉所需的多种酶，推测这些酶生效的场所应该是 （填“细胞内”和“细胞外”）。
(2)同源切割是一种代替限制酶、DNA连接酶将目的基因导入基因表达载体的方法。当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入。研究人员，运用同源切割的方式，在目的基因两端加上一组同源序列A．B，已知酵母菌体内DNA有许多A-B序列位点可以同源切割插入。构建完成的目的基因结构如图，则应选择图中的引物 对目的基因进行PCR。

(3)已知酵母菌不能合成尿嘧啶，因此尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，又知尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质。
（i）导入目的基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。由于需要导入多种酶基因，需要多次筛选，因此在导入一种目的基因后，要切除UGA基因，再重新导入。研究人员在UGA基因序列两端加上酵母菌DNA中不存在的同源C．C’序列，以便对UGA基因进行切除。C．C’的序列方向将影响切割时同源序列的配对方式，进而决定DNA片段在切割后是否可以顺利重连，如图，则应选择方式 进行连接。

（ii）切去UGA基因的酵母菌应在 的培养基上筛选培养。
(4)综上，目的基因、标记基因和同源序列在导入酵母菌的基因表达载体上的排列方式应该如图 。


【答案】(1)细胞外 (2)P1和P6 (3)缺乏尿嘧啶 方式二 含有5-氟乳清酸 (4)图3
【详解】（1）由于酵母菌不能吸收淀粉，所以导入分解淀粉的酶发挥作用的场所在细胞外。（2）根据题干信息“当目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同时，就可以发生同源切割，将目的基因直接插入”，要保证目的基因两侧的小段序列与基因表达载体上某序列相同，需要选择P1和P6这对引物进行PCR。（3）（i）选择了尿嘧啶合成基因（UGA）常用作标记基因，则应该将酵母菌放在缺乏尿嘧啶的培养基上培养，如果导入成功，则形成菌落；如果没有导入，则缺乏尿嘧啶，不能生存；方式一，C和C'方向相反，如果切割，则末端在一条链上，不能连接，所以选择方式二，连接方向相同，切割后形成末端，便于连接。（ii）由于尿嘧啶可以使5-氟乳清酸转化为对酵母菌有毒物质，所以应该在含有5-氟乳清酸的培养基上，如果切割成功，则不含尿嘧啶，形成菌落，如果切割不成功，则会产生有毒物质，不能形成菌落。（4）根据前面分析，C和C'的中间插入UGA，A和B之间插入的目的基因，所以图3正确。
10．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。

(1)与图甲中启动子结合的酶是 。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有 （答出2个结构即可）。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的 （填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了 ，条带2所检出的蛋白 （填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。
【答案】(1)RNA聚合酶 限制酶切割位点、标记基因、复制原点等 (2)F2和R1或F1与R2 a链
(3)J-V5融合蛋白 不是
【详解】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。（2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。（3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
11．（2023·全国·统考高考真题）GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库，科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指
。
构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因（均为突变基因）构建表达载体，其模式图如下所示（箭头为GFP突变基因的转录方向）。图中①为 ；②为 ，其作用是
；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是
。

目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是
（答出1点即可）。
新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因（黄色荧光蛋白基因）。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是
。
【答案】(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 (2)终止子 启动子 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来 (3)密码子具有简并性 (4)将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达
【详解】（1）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（2）一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子，终止子以及标记基因等，且基因的转录方向为从启动子到终止子，故图中①为终止子，②为启动子，启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素基因就可以作为这种基因。（3）正常情况下，GFP突变基因应该不发绿色荧光，而大肠杆菌有的发绿色荧光，从密码子特点的角度分析，原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可能由一种或多种密码子决定。（4）基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌中进行表达，如果酵母菌发出黄色荧光，说明YFP基因能在真核细胞中表达，反之则不能在真核细胞中表达。
12．（2023·全国·统考高考真题）接种疫苗是预防传染病的一项重要措施，乙肝疫苗的使用可有效阻止乙肝病毒的传播，降低乙型肝炎发病率。乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原（一种病毒蛋白）。回答下列问题。
(1)接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是
。
(2)制备重组乙肝疫苗时，需要利用重组表达载体将乙肝病毒表面抗原基因（目的基因）导入酵母细胞中表达。重组表达载体中通常含有抗生素抗性基因，抗生素抗性基因的作用是 。能识别载体中的启动子并驱动目的基因转录的酶是 。
(3)目的基因导入酵母细胞后，若要检测目的基因是否插入染色体中，需要从酵母细胞中提取
进行DNA分子杂交，DNA分子杂交时应使用的探针是 。
若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
。
【答案】(1)重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法独立在宿主体内增殖 (2)筛选 RNA聚合酶 (3) 核染色体DNA 被标记的目的基因的单链DNA片段 (4)通过使用相应抗体，利用抗原-抗体杂交技术，检测mRNA是否翻译形成蛋白质
【详解】（1）重组乙肝疫苗的成分是乙肝病毒表面的一种病毒蛋白。蛋白质注入人体后，无法完成病毒遗传物质的复制与蛋白质的合成，无法独立增殖。（2）抗生素抗性基因作为标记基因，用于转化细胞的筛选。
RNA聚合酶结合目的基因启动子并驱动转录。（3）检测的对象是目的基因是否插入染色体中，故提取酵母细胞染色体进行目的基因鉴定。基因探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列。（4）要检测出目的基因是否表达，除了需要检测目的基因是否插入染色体外，还需要检查目的基因是否转录与表达。检测是否转录，用核酸分子杂交技术，检测是否翻译用抗原-抗体杂交技术。
13．（2023·浙江·统考高考真题）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：
(1)根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备 的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的 为外植体。
(2)植物细胞壁的主要成分为 和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的
失活。对处理后的原生质体在显微镜下用 计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是 。
(3)将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于 。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？
A ．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂
B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂
C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂
D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂
(4)愈伤组织经 可形成胚状体或芽。胚状体能长出 ，直接发育形成再生植株。
(5)用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路：
Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的 。
Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系， 为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。
Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经 后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的 个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
【答案】(1)再生 叶 (2)纤维素 细胞质和细胞核 血细胞计数板 降低PEG浓度，使其失去融合作用 (3)同一个杂种融合原生质体 ABD (4)再分化 根和芽 (5)模板 M1、M2 凝胶电泳 1
【详解】（1）在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备再生的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的叶为外植体。（2）植物细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应，在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的细胞质和细胞核失活，融合后具有甲植物的细胞核基因和乙植物的细胞质基因。对处理后的原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是降低PEG浓度,使其失去融合作用。（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于同一个杂种融合的原生质体。未融合的原生质体因为细胞质或细胞核的失活，无法正常生长、分裂；同种融合的原生质体也因为甲原生质体细胞质或乙原生质体细胞核失活而不能生长、分裂；只有杂种细胞才具备有活性的细胞质和细胞核，可以生长、分裂，因此这些愈伤组织只能来自于杂种细胞。故选ABD。（4）愈伤组织经再分化可形成胚状体或芽。胚状体能长出根和芽，直接发育形成再生植株。（5）Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的模板。Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系，M1、M2为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经凝胶电泳后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的1个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。
14．（2023·广东·统考高考真题）种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥（2n=10）进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与 植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性核酸内切酶对PCR产物和 进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备 。
(3)转化后，T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株（如图），用于后续验证突变基因与表型的关系。

①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了 。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约 %的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株 （填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”）所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到 %的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性核酸内切酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。

【答案】(1)野生型 (2)载体（基因表达载体） 启动子和终止子 (3) DAI基因和卡那霉素抗性基因 75 自交 100
【详解】（1）根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。（2）利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性核酸内切酶对DAI基因和运载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。（3）①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌（T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因）液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基（含有卡那霉素）上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T-DNA（其内部基因在减数分裂时不发生交换）可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150bp，突变型有50bp和100bp，如图：
。
〖2022年高考真题〗
1．（2022·辽宁·统考高考真题）抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据，采用PCR方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B．后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C．延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D．转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
【答案】B
【详解】A、预变性是使模板DNA充分变性，A错误；B、后延伸过程后延伸是为了让引物延伸完全并让单链产物完全退火形成双链结构，可使目的基因的扩增更加充分，B正确；C、延伸过程需引物参与，C错误；
D、转基因品种不只需要检测是否含有目的基因，还要检测是否表达，还有安全性问题，D错误；故选B。
2．（2022·河北·统考高考真题·多选）人染色体DNA中存在串联重复序列，对这些序列进行体外扩增、电泳分离后可得到个体的DNA指纹图谱。该技术可用于亲子鉴定和法医学分析。下列叙述错误的是（ ）
A．DNA分子的多样性、特异性及稳定性是DNA鉴定技术的基础
B．串联重复序列在父母与子女之间的遗传不遵循孟德尔遗传定律
C．指纹图谱显示的DNA片段属于人体基础代谢功能蛋白的编码序列
D．串联重复序列突变可能会造成亲子鉴定结论出现错误
【答案】BC
【详解】A、DNA分子的多样性、特异性及稳定性是DNA鉴定技术的基础，A正确；B、串联重复序列在染色体上，属于核基因，在父母与子女之间的遗传遵循孟德尔遗传定律，B错误；C、指纹图谱由串联重复序列扩增获得，串联重复序列是广泛分布于真核生物核基因组中的简单重复非编码序列，C错误；D、串联重复序列突变后，分离得到的指纹图谱可能会发生改变，可能会造成亲子鉴定结论出现错误，D正确。故选BC。
3．（2022·天津·高考真题）研究者拟构建高效筛选系统，将改进的苯丙氨酸合成关键酶基因P1导入谷氨酸棒杆菌，以提高苯丙氨酸产量。
(1)如图是该高效筛选系统载体的构建过程。载体1中含有KanR（卡那霉素抗性基因）和SacB两个标记基因，为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物 和 ，并在引物的 （5＇∕3＇）端引入XhⅠ酶识别序列，进行PCR扩增，产物经酶切、连接后环化成载体2。
(2)PCR扩增载体3中筛选效率较高的标记基因RpsL（链霉素敏感基因）时，引物应包含 （EcRⅠ∕HindⅢ∕XhⅠ）酶识别序列，产物经单酶切后连接到载体2构建高效筛选载体4。
(3)将改进的P1基因整合到载体4构建载体5。将载体5导入链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有 的平板进行初步筛选。
(4)用一定的方法筛选出如下菌株：P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失。该菌的表型为__________。
A．卡那霉素不敏感、链霉素敏感
B．卡那霉素敏感、链霉素不敏感
C．卡那霉素和链霉素都敏感
D．卡那霉素和链霉素都不敏感
(5)可采用 技术鉴定成功整合P1基因的菌株。之后以发酵法检测苯丙氨酸产量。
【答案】(1)1 4 5＇ (2)XhⅠ (3)卡那霉素 (4)B (5)PCR
【详解】（1）据图可知，根据引物箭头方向可知，要想复制KanR（卡那霉素抗性基因），需要引物1和4，因此为去除筛选效率较低的SacB，应选择引物1和4。PCR时，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端向3'端延伸的，因此在引物的5'端引入XhⅠ酶识别序列。
（2）据图可知，载体4中RpsL（链霉素敏感基因）的两侧具有XhⅠ酶识别序列，载体3中不含XhⅠ酶识别序列，如果将载体2和载体3连接形成高效筛选载体4时，需要的引物应该含有XhⅠ酶识别序列。
（3）基因表达载体中的标记基因，有利于目的基因的初步检测，据题意可知，载体5中含有RpsL（链霉素敏感基因）和KanR（卡那霉素抗性基因），将载体5导入链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌。为获得成功导入载体5的菌株，应采用含有卡那霉素的平板进行初步筛选。（4）据题意可知，载体5导入的时链霉素不敏感（由RpsL突变造成）、卡那霉素敏感的受体菌，受体菌中P1基因脱离载体5并整合到受体菌拟核DNA，且载体5上其他DNA片段全部丢失，因此该菌的表型为卡那霉素敏感、链霉素不敏感，B正确，ACD错误。故选B。（5）通过PCR技术可以检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA中或目的基因是否转录出了mRNA，因此可采用PCR技术鉴定成功整合P1基因的菌株。
4．（2022·重庆·统考高考真题）改良水稻的株高和产量性状是实现袁隆平先生“禾下乘凉梦”的一种可能途径。研究人员克隆了可显著增高和增产的eui基因，并开展了相关探索。
步骤I：
步骤II：
花药培养能缩短育种年限，原因是
。在步骤I的花药培养过程中，可产生单倍体愈伤组织，将其培养于含 的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。I中能用于制造人工种子的材料是 。
步骤II中，eui基因克隆于cDNA文库而不是基因组文库，原因是
；在构建重组Ti质粒时使用的工具酶有 。为筛选含重组Ti质粒的菌株，需在培养基中添加 。获得的农杆菌菌株经鉴定后，应侵染I中的 ，以获得转基因再生植株。再生植株是否含有eui基因的鉴定方法是 ，移栽后若发育为更高且丰产的稻株，则可望“禾下乘凉”。
【答案】(1)单倍体经秋水仙素处理后所得植株为纯合子，后代不会发生性状分离 秋水仙素 胚状体
(2)cDNA文库是由编码蛋白质的mRNA逆转录来的基因导入受体菌而形成的，基因工程中只需要转录出编码蛋白质的部分就可以，筛选比较简单易行 限制酶和 DNA连接酶 抗生素 愈伤组织 DNA分子杂交技术
【详解】（1）单倍体育种过程中，单倍体经秋水仙素处理后所得植株为纯合子，后代不会发生性状分离，所以可以明显缩短育种年限。将水稻花粉进行脱分化处理，可产生单倍体的愈伤组织，秋水仙素能抑制纺锤体的形成，导致染色体不能移向细胞两极，从而引起细胞内染色体数目加倍，故将其培养于含秋水仙素的培养基上，可促进产生二倍体愈伤组织。胚状体可用于制造人工种子。（2）cDNA文库又叫部分基因文库，是由编码蛋白质的mRNA逆转录来的基因导入受体菌而形成的，而基因组文库包含了本物种全部基因，基因工程中只需转录出编码蛋白质的基因部分就即可，故选cDNA文库。在构建重组Ti质粒时，必须使用限制性核酸内切酶(限制酶)切割质粒使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。该重组的Ti质粒中含有抗生素抗性基因，故应在培养基中添加抗生素，以便对重组质粒进行筛选和鉴定。将目的基因导入到植物细胞常用农杆菌转化法，即用含eu基因的农杆菌侵染愈伤组织，以便将eui基因导入愈伤组织，获得转基因再生植株。检测植株是否含有eui基因，可采取DNA分子杂交技术的方法。
5．（2022·江苏·统考高考真题）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。
(1)纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是 。
某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaC1至2．0m1/L的目的是 。PCR扩增时，需在
催化下，在引物 端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒（在EcRⅤ位点插入片段）。请完成下表。
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经 形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的 倍。
【答案】(1)与有丝分裂有关（参与纺锤体的形成，是纺锤体形成中心） (2)溶解DNA 耐高温DNA聚合酶（Taq酶） 3' (3) a、b 1100 Q4 X蛋白参与中心体的形成 (4) 逆转录 32
【详解】（1）中心体与有丝分裂有关，是纺锤体的组织中心。（2）从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，DNA在2．0m1/L的NaC1溶液中的浓度最大，高于或低于这一浓度，DNA的溶解度均会下降，因此实验过程中添加NaC1至2．0m1/L的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在耐高温的DNA聚合酶（即Taq聚合酶）的催化下，在引物的3’端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。（3）PCR扩增目的DNA片段时，在引物的3’端进行DNA链的延伸，据图可知，应选择图II中的引物a和引物b，PCR目的产物约为300+800=1100bp。确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcR V的识别序列，下游含有EcR V+BamH I的识别序列，根据题干信息构建Y-M重组质粒（在EcRⅤ位点插入片段），Y-M的连接处测序后部分序列应含有EcR V+BamH I的识别序列，根据EcR V识别位点，应选择序列Q4。对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X参与中心体的组成。（4）研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经逆转录形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20（Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数），说明病人基因Z表达较弱，设健康人Z基因的cDNA数为x，病人Z基因的cDNA数为y，则有x×215=y×220，从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的25=32倍。
6．（2022·河北·统考高考真题）蛋白酶抑制剂基因转化是作物抗虫育种的新途径。某研究团队将胰蛋白酶抑制剂（NaPI）和胰凝乳蛋白酶抑制剂（StPinlA）的基因单独或共同转化棉花，获得了转基因植株。回答下列问题：
(1)蛋白酶抑制剂的抗虫机制是 。
(2) 是实施基因工程的核心。
(3)利用农杆菌转化法时，必须将目的基因插入到质粒的 上，此方法的不足之处是
。
为检测目的基因在受体细胞基因组中的整合及其转录和翻译，可采用的检测技术有
（写出两点即可）。
确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的 以鉴定其抗性程度。下图为三种不同遗传操作产生的转基因棉花抗虫实验结果，据结果分析 （填“NaPI”或“StPinlA”或“NaPI＋StPinlA”）转基因棉花的抗虫效果最佳，其原因是
。
(6)基因突变可产生新的等位基因，在自然选择的作用下，昆虫种群的基因频率会发生 。导致昆虫朝着一定的方向不断进化。提此推测，胰蛋白酶抑制剂转基因作物长期选择后，某些害虫具有了抗胰蛋白酶抑制剂的能力，其分子机制可能是
（写出两点即可）。
【答案】(1)调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的 (2)#基因表达载体的构建/表达载体的构建# (3)T-DNA 该方法不适用与单子叶植物 (4)基因--DNA分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术 (5) 效果 NaPI＋StPinlA 饲喂NaPI＋StPinlA转基因的虫体质量最小、棉铃数量最多 (6) 定向改变 由于害虫发生基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码处胰蛋白酶抑制剂
【详解】（1）蛋白酶抑制剂的抗虫机制是调节害虫胰蛋白酶活性，从而使害虫不能正常消化食物达到抗虫的目的。（2）基因工程的核心是基因表达载体的构建。（3）农杆菌转化法的原理：农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。根据农杆菌的这一特点，如果将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，通过农杆菌的转化作用，就可以把目的基因整合到植物细胞中染色体的DNA上。其不足之处是该方法不适用与单子叶植物。（4）目的基因是否整合的检测，在分子水平上可通过检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因、是否能转录处目的基因对应的mRNA、是否能合成目的基因所控制合成的蛋白质等；在个体水平可检测抗虫性、抗病性、活性等。即可利用基因--DNA分子杂交技术、mRNA--分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术等。（5）抗虫鉴定：确认抗虫基因在受体细胞中稳定表达后，还需进一步做抗虫的效果以鉴定其抗性程度。由图可知，NaPI＋StPinlA转基因棉花的抗虫效果最佳，因为饲喂NaPI＋StPinlA转基因的虫体质量最小、棉铃数量最多。（6）在自然选择的作用下，种群的基因频率会发生定向改变，导致生物朝一定方向不断进化。由于害虫发生基因突变后，在胰蛋白酶抑制剂的选择下，抗性基因频率逐渐增高，从而提升了其抗胰蛋白酶抑制剂的能力，或胰蛋白酶抑制剂基因发生突变后不能编码处胰蛋白酶抑制剂。
7．（2022·北京·统考高考真题）生态文明建设已成为我国的基本国策。水中雌激素类物质（E物质）污染会导致鱼类雌性化等异常，并通过食物链影响人体健康和生态安全。原产南亚的斑马鱼，其肌细胞、生殖细胞等存在E物质受体，且幼体透明。科学家将绿色荧光蛋白（GFP）等基因转入斑马鱼，建立了一种经济且快速的水体E物质监测方法。
(1)将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是 。
(2)为监测E物质，研究者设计了下图所示的两种方案制备转基因斑马鱼，其中ERE和酵母来源的UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质-受体复合物和酵母来源的Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。与方案1相比，方案2的主要优势是 ，因而被用于制备监测鱼（MO）。
(3)现拟制备一种不育的监测鱼SM，用于实际监测。SM需经MO和另一亲本（X）杂交获得。欲获得X，需从以下选项中选择启动子和基因，构建表达载体并转入野生型斑马鱼受精卵，经培育后进行筛选。请将选项的序号填入相应的方框中。
Ⅰ.启动子： 。
①ERE②UAS③使基因仅在生殖细胞表达的启动子（P生）④使基因仅在肌细胞表达的启动子（P肌）
Ⅱ.基因： 。
A．GFP B．Gal4 C．雌激素受体基因（ER） D．仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）
(4)SM不育的原因是：成体SM自身产生雌激素，与受体结合后
造成不育。
(5)使拟用于实际监测的SM不育的目的是 。
【答案】(1)显微注射 (2)监测灵敏度更高 (3)② D (4)激活ERE诱导Gal4表达，Gal4结合UAS诱导dg表达，生殖细胞凋亡 (5)避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题
【详解】（1）将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，所以将表达载体导入斑马鱼受精卵的最佳方式是显微注射法。（2）由图可知，方案1E物质-受体复合物激活ERE，使GFP基因表达，方案2 E物质-受体复合物先激活ERE获得Gal4蛋白，然后Gal4蛋白激活UAS启动子，使GFP基因表达，方案2GFP蛋白表达量大，更灵敏。（3）MO和另一亲本（X）杂交获得SM，MO是方案2获得，所以亲本X启动子选择UAS。要获得SM是不育个体，MO是可育的所以X必须有仅导致生殖细胞凋亡的基因（dg）。（4）成体SM自身产生雌激素，与受体结合后形成复合物，激活ERE诱导Gal4表达，Gal4与UAS启动子结合诱导dg表达，使生殖细胞凋亡。（5）监测鱼属于转基因生物，目前安全性不确定，为了避免转基因斑马鱼逃逸带来生物安全问题，需要SM不育。
8．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是 、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的 （填“3'端”或“5'端”）。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是 。修改扩增P基因时使用的带有EcRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是
。
融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是
；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是 。
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是 。
【答案】(1)能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸 5'端 (2)P基因编码链的第一个碱基与EcRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取。 在引物中的EcRⅠ识别序列3'端添加1个碱基 (3)增强FLAG-P与UBC的结合 参与P与UBC的结合
(4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解。
【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5'端。（2）融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcRⅠ识别序列3'端添加1个碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。（3）①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG-P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG-P的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。（4）根据（3）的分析推测，药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。
9．（2022·湖南·高考真题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是 ，物质b是 。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是 。
蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有
、 和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的 （填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是 。
若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路
。
【答案】(1)氨基酸序列多肽链 mRNA 密码子的简并性 (2)从基因文库中获取目的基因 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成 DNA双链复制 (3)种类 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏 (4)取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物（如家兔）血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间
【详解】（1）据分析可知，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子的简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。（2）蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA双链复制。（3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。（4）若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路为：取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物（如家兔）血液，立即将等量的血液加入1、2、3号三支试管中，静置相同时间，统计三支试管中血液凝固时间。
10．（2022·广东·高考真题）“绿水逶迤去，青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力，有研究者以某些工业废气（含CO2等一碳温室气体，多来自高污染排放企业）为原料，通过厌氧发酵生产丙酮，构建一种生产高附加值化工产品的新技术。
回答下列问题：
(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因（如图）设计一对 ，利用PCR技术，在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
(2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是
，终止子的作用是
。
培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，出现了生长迟缓的现象，推测其原因可能是
，此外丙酮的积累会伤害细胞，需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
这种生产高附加值化工产品的新技术，实现了 ，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看，该技术的优势在于
，具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
【答案】(1)引物 (2)作为标记基因，筛选含有基因表达载体的受体细胞 终止转录，使转录在需要的地方停下来 (3)二氧化碳等气体用于大量合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长 (4) 废物的资源化 不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳
【详解】（1）利用PCR技术扩增目标酶基因，首先需要根据目标酶基因两端的碱基序列设计一对引物，引物与模板链结合后，Taq酶才能从引物的3’端延伸子链。（2）基因表达载体中，抗生素抗性基因作为标记基因，可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞，终止子可终止转录，使转录在需要的地方停下来。（3）重组梭菌大量表达上述酶蛋白时，在这些酶蛋白的作用下，二氧化碳等气体大量用于合成丙酮，而不是用于重组梭菌的生长，所以会导致生长迟缓。（4）根据题意可知，这种生产高附加值化工产品的新技术,以高污染企业排放的二氧化碳等一碳温室气体为原料，实现了废物的资源化，体现了循环经济特点。从“碳中和”的角度看,该技术生产丙酮的过程不仅不排放二氧化碳，而且还可以消耗工业废气中的二氧化碳，有利于减缓温室效应，并实现较高的经济效益，所以具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
11．（2022·全国·统考高考真题）新冠疫情出现后，病毒核酸检测和疫苗接种在疫情防控中发挥了重要作用。回答下列问题。
(1)新冠病毒是一种RNA病毒，检测新冠病毒RNA（核酸检测）可以采取RT-PCR法。这种方法的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA，这一过程需要的酶是 ，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。根据检测结果判断被检测者是否感染新冠病毒。
(2)为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的
来进行。PCR过程每次循环分为3步，其中温度最低的一步是 。
(3)某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测（检测体内是否有新冠病毒抗体），若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明 （答出1种情况即可）；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明 。
(4)常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某种病毒的特异性蛋白S（具有抗原性）的编码序列（目的基因）。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是
。
【答案】(1)逆转录酶/反转录酶 (2)特异性核苷酸序列 退火/复性 (3)曾感染新冠病毒，已康复 已感染新冠病毒，是患者 (4)获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白）
【详解】（1）分析题意可知，新冠病毒的遗传物质是RNA，而RT-PCR法需要先得到cDNA，由RNA到DNA的过程属于逆转录过程，逆转录过程需要的酶是逆转录酶（反转录酶）。（2）PCR过程需要加入引物，设计引物时应有一段已知目的基因的核苷酸序列，在该过程中为了确保新冠病毒核酸检测的准确性，在设计PCR引物时必须依据新冠病毒RNA中的特异性核苷酸序列来进行；PCR过程每次循环分为3步，分别为变性（90-95℃）、复性（55-60℃）、延伸（70-75℃），故其中温度最低的一步是复性（或退火）。（3）某人同时进行了新冠病毒核酸检测和抗体检测，若核酸检测结果为阴性而抗体检测结果为阳性，说明该个体曾经感染过新冠病毒，机体发生特异性免疫反应，产生抗体，将病毒消灭，则核酸检测为阴性，但由于抗体有一定的时效性，能在体内存在一段时间，故抗体检测为阳性；若核酸检测和抗体检测结果均为阳性，说明该个体体内仍含有病毒的核酸，机体仍进行特异性免疫过程，能产生抗体，则说明该人已经感染新冠病毒，为患者。（4）基因工程的基本操作流程是：获取目的基因→基因表达载体的构建（基因工程的核心）→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定，结合题意，本基因工程的目的是获得大量的S蛋白，故具体流程为：获取S蛋白基因→构建S蛋白基因与运载体的表达载体→导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 （检测受体能否产生S蛋白）。
12．（2022·福建·统考高考真题）美西螈具有很强的再生能力。研究表明，美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制，科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体，具体方法如下。回答下列问题：
（一）基因工程抗原的制备
(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列，合成引物，利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3’—OH与加入的脱氧核苷酸的5’—P形成磷酸二酯键，则新合成链的延伸方向是 （填“ 5’→3’ ”或“ 3’→5’ ”）。

载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切 抗性基因序列如图1所示。用Xh I和Sal 1分别酶切CD14和载体后连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA．可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是
。
培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌，分离纯化目的蛋白。
（二）抗CD14单克隆抗体的制备流程如图2所示：

(3)步骤①和步骤⑤分别向小鼠注射 和 。
(4)步骤②所用的SP2/0细胞的生长特点是 。
(5)吸取③中的上清液到④的培养孔中，根据抗原—抗体杂交原理，需加入 进行专一抗体检测，检测过程发现有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14抗体，原因是
。
(6)步骤⑥从 中提取到大量的抗CD14抗体，用于检测巨噬细胞。
【答案】(1)5'→3' (2)正向连接的重组DNA有这两种酶切位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点（没有限制酶的识别序列） (3)CD14蛋白/CD14抗原 分泌抗CD14抗体的杂交瘤细胞 (4)能在体外无限增殖 (5)CD14蛋白 参与形成杂交瘤细胞的B淋巴细胞种类多，有的不能分泌抗CD14抗体 (6)小鼠腹水
【详解】（1）PCR扩增时，DNA聚合酶催化引物的3'-OH与加入的脱氧核苷酸的5'-P形成磷酸二酯键，因此新链合成的方向是从5'→3'。（2）可进一步用限制酶XhⅠ和SalⅠ对CD14的连接方向进行鉴定，是因为正向连接的重组DNA有这两种酶切位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点（没有限制酶的识别序列）。（3）步骤①是注射特定抗原，针对本实验目的可知，要获得抗CD14单克隆抗体，故应该注射CD14蛋白/CD14抗原；步骤⑤是将分泌抗CD14抗体的杂交瘤细胞注入小鼠体内培养，以获得大量单克隆抗体。（4）步骤②所用的SP2/0细胞是骨髓瘤细胞，特点是能在体外无限增殖。（5）根据抗原—抗体杂交原理，应该用CD14蛋白检测其中是否含抗CD14蛋白的抗体。因为形成杂交瘤细胞的B淋巴细胞种类很多，因此有些杂交瘤细胞不能分泌抗CD14抗体。（6）从制备单克隆抗体的流程可知，将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔后，最终要从小鼠的腹水中提取抗CD14抗体。
〖2021年高考真题〗
1．（2021·江苏·高考真题）下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是（ ）
A．分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列
B．该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上
C．若要获得除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组
D．获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异
【答案】D
【详解】A、农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，故分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列，进而成功整合到受体细胞染色体上，A正确；B、该方法需要利用农杆菌转化法，在高转化频率的基础上，将目的基因和标记基因整合到染色体上，由图可知，标记基因和目的基因位于细胞中不同的染色体上，B正确；C、通过杂交分离结果可知，经过有性繁殖阶段遗传重组后获得了三种类型细胞，其中包括只含目的基因的，只含标记基因的和既含目的基因又含标记基因的，C正确；D、获得的无筛选标记转基因植株发生了基因重组，D错误。故选D。
2．（2021·湖北·统考高考真题）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（ ）
A．增加模板DNA的量B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间D．提高复性的温度
【答案】D
【详解】A、增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；BC、延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带，BC错误；D、非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确。故选D。
3．（2021·湖北·统考高考真题）限制性内切酶EcRI识别并切割双链DNA，用EcRI完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为（ ）
A．6B．250C．4000D．24000
【答案】C
【详解】据图可知，EcRI的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4=1/4096，即4096≈4000个碱基对可能出现一个限制酶EcRI的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度（碱基对）约为4000。C符合题意。故选C。
4．（2021·山东·统考高考真题）我国考古学家利用现代人的 DNA 序列设计并合成了一种类似磁铁的“引子”，成功将极其微量的古人类 DNA 从提取自土壤沉积物中的多种生物的 DNA 中识别并分离出来，用于研究人类起源及进化。下列说法正确的是（ ）
A．“引子”的彻底水解产物有两种
B．设计“引子”的 DNA 序列信息只能来自核 DNA
C．设计“引子”前不需要知道古人类的 DNA 序列
D．土壤沉积物中的古人类双链 DNA 可直接与“引子”结合从而被识别
【答案】C
【详解】A、根据分析“引子”是一段DNA序列，彻底水解产物有磷酸、脱氧核糖和四种含氮碱基，共6种产物，A错误；B、由于线粒体中也含有DNA，因此设计“引子”的 DNA 序列信息还可以来自线粒体DNA，B错误；C、根据题干信息“利用现代人的 DNA 序列设计并合成了引子”，说明设计“引子”前不需要知道古人类的 DNA 序列，C正确；D、土壤沉积物中的古人类双链 DNA 需要经过提取，且在体外经过加热解旋后，才能与“引子”结合，而不能直接与引子结合，D错误。故选C。
5．（2021·江苏·高考真题）某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题：
(1)目的基因的扩增
①提取真菌细胞 ，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。
②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致 。
③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有
A．Taq酶最适催化温度范围为50～60℃
B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物
C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸
D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性
(2)重组质粒的构建
①将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进 ，形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及 酶等，完成质粒的环化。
②若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在
。
(3)融合蛋白的表达
①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是
。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明 ，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。
【答案】(1) mRNA 蛋白M上不含tag标签 BC (2) 黏性末端碱基配对 DNA连接 基因m的连接处或基因m的内部 (3) 受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因可以长成菌落 融合基因表达（或融合基因正确解码）
【详解】（1）①以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的mRNA。②从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若m基因的转录产物mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子多肽链就断开，则不会对tag序列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。③A、从题干信息可知，“80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增”，故Taq酶最适催化温度范围为94℃左右，A错误；B、PCR 反应的最初加热过程中，样品温度上升到70℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在Taq DNA 聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物错配形成的产物的扩增，影响反应的特异性；热启动可减少引物错配形成的产物的扩增，提高反应的特异性，B正确；C、DNA分子复制具有方向性，都是从5′端向3′端延伸，C正确；D、Taq酶没有特异性，与普通的DNA聚合酶相比，Taq酶更耐高温，D错误。故选BC。（2）①从图上看，载体A只有一个Sma I的酶切位点，故被Sma I切开后，载体由环状变为链状DNA，将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。②重组质粒中，载体A被Sma I切开的位置已经与基因m相连，原来的酶切位点已不存在，若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在基因m的连接处或基因m内部。（3）①筛选目的菌株的机理是：导入了质粒A-m的目的菌株由于含有URA3基因，能在无尿嘧啶的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则不能存活。
②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含lag标签，位于lag标签上游的基因m应该正常表达，说明融合基因表达（或融合基因正确解码）。
6．（2021·海南·高考真题）CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是 。
(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是 。
(3)过程③~⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是 。随后，Cas9蛋白可切割
序列。
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是 ，基因敲除成功的判断依据是
。
(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：
。
【答案】(1)DNA连接酶 (2)感受态细胞法/Ca2+处理法 (3)碱基互补配对 目标（目的）DNA（基因）
(4) DNA分子杂交技术 经编辑过的DNA片段（从受体细胞中提取的基因组DNA）与标记的目标（对应）基因（探针）杂交，若无杂交带，则敲除成功 (5)表达Cas9蛋白和sgRNA，两者形成复合体；sgRNA识别并结合目标DNA序列；引导Cas9蛋白切割目标DNA序列
【详解】（1）基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。（2）大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（3）根据题图可知：在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，SgRNA是根据靶基因设计的引导RNA，准确引导Cas9切割与SgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助SgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于SgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现SgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。（4）可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除是否成功，即利用经编辑过的DNA片段（从受体细胞中提取的基因组DNA）与标记的目标（对应）基因（探针）杂交，若无杂交带，则敲除成功。（5）根据图示可知：CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是SgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，引导Cas9蛋白切割目标DNA序列。
7．（2021·福建·统考高考真题）微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。回答下列问题：
(1)根据枣树的MTcDNA的核苷酸序列设计了相应的引物（图1甲），通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为 。
(2)本实验中，PCR所用的DNA聚合酶扩增出的MT基因的末端为平末端。由于载体E只有能产生黏性末端的酶切位点，需借助中间载体P将MT基因接入载体E。载体P和载体E的酶切位点及相应的酶切序列如图1乙所示。
①选用 酶将载体P切开，再用 （填“T4DNA或“E·cli81DNA”）连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。
②载体P′不具有表达MT基因的 和 。选用 酶组合对载体P′和载体E进行酶切，将切下的MT基因和载体E用DA连接酶进行连接，将得到的混合物导入到用 离子处理的大肠杆菌，筛出MT工程菌。
(3)MT基因在工程菌的表达量如图2所示。结果仍无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌，理由是 。
【答案】(1)引物1和引物4 (2)EcRV T4DNA 启动子 终止子 XhI和PstI 钙
(3)尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定
【详解】（1）密码子位于mRNA上，是决定氨基酸的三个相邻碱基，起始密码子分别控制翻译的开始和结束，故为保证基因的正常表达，一对引物应分别位于位点A和位点B的两侧，故选择引物1和引物4。（2）①MT基因的末端为平末端，故需要用EcR Ⅴ或Sma Ⅰ切割载体P，但后续需进一步将重组载体P′和载体E连接，故需将MT基因插入Xh I和Pst I两个酶切位点之间，故选EcR Ⅴ将载体P切开；由于E·cli81DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4DNA连接酶可以连接平末端，而MT基因的末端为平末端，故需要用T4DNA连接酶将MT基因与载体P相连，构成重组载体P′。②载体P′是重组质粒，故不含有有表达MT基因的启动子和终止子；为避免自身环化和反向连接，可选用两种酶切割两种载体，据图可知，载体P′和载体E均含有XhI和PstI酶，故可选用XhI和PstI酶进行酶切；将目的基因导入大肠杆菌的方法是钙离子处理法。（3）由于尚未在个体生物学水平上对MT工程菌吸附重金属的能力进行鉴定，故即使MT工程菌的MT蛋白相对含量较高，也无法说明已经成功构建能较强吸附废水中重金属的MT工程菌。
8．（2021·辽宁·统考高考真题）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
(1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经 过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入 和 两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用 （填“E．cliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。
相关限制酶的识别序列及切割位点
注：箭头表示切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于 的生理状态，以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2， 号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb的DNA分子条带未出现在图中
(5)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的 （填“G1”或“S”或“G2/M”）期。
【答案】(1)逆转录 (2)EcRI PvitⅡ T4DNA连接酶 (3)感受态 (4)3 (5)G2/M
【详解】（1）利用RNA获得cDNA的过程称为逆转录。（2）根据启动子和终止子的生理作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间．图中看出，两者之间存在于三种限制酶切点，但是由于KpnI在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcRI和PvitⅡ两种不同限制酶的识别序列；根据PvitⅡ的酶切序列，切出了平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4DNA连接酶连接质粒和目的基因。（3）转化时用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。（4）由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，如果用EcRI和PvitⅡ两种酶切割重组质粒电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于phb2基因大小为0．9kb，所以对应电泳图是菌落3。（5）比较图4中G1期和S期细胞减少，而G2期细胞数目明显增多，说明了G1期和S期细胞可以进入G2期，而G2期的细胞没有能够完成分裂进入G1期，因此PHB2蛋白应该作用于G2/M期。
9．（2021·天津·统考高考真题）乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。
(1)乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为 。
(2)获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。
为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑
和 。
②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有
，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列 （能/不能）在大肠杆菌中高效表达。
③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在 的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。
(3)以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。
A．进一步优化发酵条件B．使用乳酸菌LDH基因自身的启动子
C．敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因D．对转基因酿酒酵母进行诱变育种
【答案】(1)细胞质基质 (2)包含BamHI的识别序列 将GTG改为ATG 原核生物复制原点 不能 缺失尿嘧啶 (3)B
【详解】（1）酵母细胞厌氧发酵即无氧呼吸的场所为细胞质基质。（2）①设计引物1的5′端序列，应考虑将编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，以便目的基因在酵母细胞中更好的表达；同时能通过双酶切以正确方向插入质粒，需要包含BamHI的识别序列。②将重组质粒导入大肠杆菌，重组质粒上有原核生物复制原点，所以能在大肠杆菌中扩增。由于启动子存在物种特异性，重组质粒上带有真核酿酒酵母基因的启动子，故重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列在大肠杆菌中不能高效表达。
③在缺乏尿嘧啶的选择培养基上，不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株不能生存，导入重组质粒的酿酒酵母菌株因为获得了尿嘧啶合成酶基因而可以正常生存，从而起到筛选作用。（3）A、进一步优化发酵条件，使其更有利于乳酸菌的繁殖，可以提高其乳酸产量，A正确；B、由于启动子存在物种特异性，使用乳酸菌LDH基因自身的启动子，在酵母细胞中不表达，B错误；C、敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因，使酵母菌不能酿酒，从而提高乳酸产量，C正确；D、对转基因酿酒酵母进行诱变育种，可能会出现乳酸菌的高产菌株，D正确。故选B。
10．（2021·北京·统考高考真题）新冠病毒（SARS-CV-2）引起的疫情仍在一些国家和地区肆虐，接种疫苗是控制全球疫情的最有效手段。新冠病毒疫苗有多种，其中我国科学家已研发出的腺病毒载体重组新冠病毒疫苗（重组疫苗）是一种基因工程疫苗，其基本制备步骤是：将新冠病毒的S基因连接到位于载体上的腺病毒基因组DNA中，重组载体经扩增后转入特定动物细胞，进而获得重组腺病毒并制成疫苗。
(1)新冠病毒是RNA病毒，一般先通过 得到cDNA，经 获取S基因，酶切后再连接到载体。
(2)重组疫苗中的S基因应编码________。
A．病毒与细胞识别的蛋白B．与病毒核酸结合的蛋白
C．催化病毒核酸复制的酶D．帮助病毒组装的蛋白
(3)为保证安全性，制备重组疫苗时删除了腺病毒的某些基因，使其在人体中无法增殖，但重组疫苗仍然可以诱发人体产生针对新冠病毒的特异性免疫应答。该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗→ → →诱发特异性免疫反应。
(4)重组疫苗只需注射一针即可完成接种。数周后，接种者体内仍然能检测到重组腺病毒DNA，但其DNA不会整合到人的基因组中。请由此推测只需注射一针即可起到免疫保护作用的原因
。
【答案】(1)逆转录/反转录 PCR扩增 (2)A (3) （重组腺病毒）进入细胞 表达抗原
(4)重组腺病毒DNA在人体细胞中持续表达抗原，反复刺激机体免疫系统。
【详解】（1）新冠病毒是RNA病毒，其遗传物质是RNA，若要得到与其对应的cDNA，则要进行逆转录。用cDNA扩增出目的基因——S基因，需要利用PCR扩增技术。（2）重组疫苗作为抗原需要被人体免疫系统识别，而重组疫苗中的S基因是从新冠病毒中提取的，所以重组疫苗中的S基因应编码病毒与细胞都能识别的蛋白，A正确，BCD错误。故选A。（3）重组疫苗对人体来说属于外来异物，即抗原，故人体接种疫苗后，重组腺病毒进入人体细胞，其在人体细胞内表达出抗原，引发机体产生特异性免疫——细胞免疫和体液免疫，因此该疫苗发挥作用的过程是：接种疫苗→（重组腺病毒）进入细胞→表达抗原→诱发特异性免疫反应。（4）接种疫苗后，由于长时间内接种者体内仍能检测到重组腺病毒DNA，而DNA会不断表达出S蛋白，S蛋白作为抗原刺激机体，故机体会反复针对抗原产生特异性免疫应答。
11．（2021·山东·统考高考真题）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有 BCL11A 蛋白结合位点，该位点结合 BCL11A 蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定 BCL11A 蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。
（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在 F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是 ，在 R 末端添加的序列所对应的限制酶是 。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要 种酶。
（2）将构建的载体导入除去 BCL11A 基因的受体细胞，成功转化后，含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7与 R 扩增产物的受体细胞无荧光。含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光的原因是
。
（3）向培养液中添加适量的雌激素，含 F1～F4与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，而含 F5～F6与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应的位置不含有 BCL11A 蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于
，理由是
。
【答案】 SalI EcRI 6 F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达 引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上 根据有无荧光情况判断，F1～F4 与 R 扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于 F4 所对应调控序列的下游（右侧）；F5～F6 与 R 扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于 F5 所对应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上
【详解】（1）据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R端与荧光蛋白基因中限制酶Mun Ⅰ 识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有Mun Ⅰ 和 Xh Ⅰ 的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶Mun Ⅰ 和Xh Ⅰ 所识别，故应该选用添加限制酶EcR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限制酶Mun Ⅰ 识别并切割后的黏性末端与限制酶EcR Ⅰ 识别并切割后的黏性末端相同，故 R 末端添加的序列所对应的限制酶是EcR Ⅰ ，在 F1～F7 末端添加的序列所对应的限制酶是Sal Ⅰ ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcR Ⅰ 的识别位点，故对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xh Ⅰ 切割。综上所述，对载体使用限制酶Mun Ⅰ 和Xh Ⅰ 切割，对扩增后的产物用限制酶EcR Ⅰ 和限制酶Sal Ⅰ 识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcR Ⅰ 、限制酶Sal Ⅰ、限制酶Mun Ⅰ 、限制酶Xh Ⅰ 、DNA连接酶；（2）受体细胞中已经除去 BCL11A 基因，故扩增产物中的 BCL11A 蛋白结合位点，不会抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白基因的转录过程；含 F1～F6与 R 扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含 F7 与 R 扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白基因不表达；（3）向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生 BCL11A 蛋白， BCL11A 蛋白与BCL11A 蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含 F1～F4 与 R 扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F4与引物R之间的序列上；含 F5～F6 与 R 扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A 蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A 蛋白结合位点位于引物 F4 与 F5 在调控序列上所对应序列之间的区段上。
12．（2021·浙江·统考高考真题·节选）回答下列（一）小题：
（一）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。
（1）由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体
，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。
（2）为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用 DNA 连接酶将该基因连接到质粒载体形成 ，导入到大肠杆菌菌株 DH5α 中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的 DH5α 阳性细胞克隆，质粒载体应含有 （答出2点即可）。提取质粒后，采用 法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。
（3）为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用 分散斑马鱼囊胚的内细胞团，取分散细胞作为初始材料进行 培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为 ，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。
【答案】冷却 玻璃刮刀 较大透明圈 斜面 乙醇 耐酒精度高、耐酸高 灭菌 吸附法 富营养化 重组DNA分子 限制性核酸内切酶的识别序列、抗生素抗性基因 显微注射 胰蛋白酶 原代 饲养层细胞
【详解】（一）（1）生活污水富含N、P，未经处理就大量排放，会导致水体富营养化，导致藻类大量繁殖形成水华或赤潮。（2）具有相同黏性末端的目的基因和载体DNA（如质粒），经DNA连接酶处理后，会形成重组DNA分子。与目的基因相同的限制性核酸内切酶识别序列，可以确保限制性内切酶处理后与目的基因形成相同的黏性末端，以便于和目的基因的连接。标记基因（抗生素抗性基因）的存在，便于筛选含有目的基因的受体细胞。动物基因工程，通常采用显微注射法将重组DNA分子导入动物受精卵中。（3）使用胰蛋白酶处理囊胚的内细胞团，借助酶的专一性，可分解细胞间质的蛋白质，让细胞分散，便于培养。将分散的细胞初次在卡氏瓶中培养，称之为原代培养。提高细胞克隆形成率的措施有：选择适宜的培养基、添加血清（胎牛血清最好）、饲养层细胞（滋养细胞如经射线照射本身失去增殖力的小鼠成纤维细胞）支持生长、激素（胰岛素等）刺激、使用CO2培养箱、调节pH等。
13．（2021·河北·统考高考真题）采矿污染和不当使用化肥导致重金属镉（Cd）在土壤中过量积累。利用植物修复技术将土壤中的Cd富集到植物体内，进行后续处理（例如，收集植物组织器官异地妥善储存），可降低土壤中Cd的含量。为提高植物对Cd污染土壤的修复能力，研究者将酵母液泡Cd转运蛋白（YCF1）基因导入受试植物，并检测了相关指标。
回答下列问题：
（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体称为 。
（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需要的两种酶是 。构建的重组基因表达载体中必须含有标记基因，其作用是 。
（3）进行前期研究时，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是
。研究者进一步获得了转YCF1基因的不育杨树株系，采用不育株系作为实验材料的目的是 。
（4）将长势一致的野生型和转基因杨树苗移栽到Cd污染的土壤中，半年后测定植株干重（图1）及不同器官中Cd含量（图2）。据图1可知，与野生型比，转基因植株对Cd具有更强的 （填“耐性”或“富集能力”）；据图2可知，对转基因植株的 进行后续处理对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。
已知YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上。据此分析，转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境的原因是 。相较于草本植物，采用杨树这种乔木作为Cd污染土壤修复植物的优势在于
（写出两点即可）。
【答案】基因组文库 限制酶和DNA连接酶 便于目的基因的筛选和鉴定 农杆菌转化法 避免目的基因在自然界中的扩散 耐性 茎叶 YCF1可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水 杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用
【详解】（1）为获取YCF1基因，将酵母细胞的全部DNA提取、切割后与载体连接，导入受体菌的群体中储存，这个群体含有酵母菌的全部基因，称为基因组文库。（2）将DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，需要用限制酶切割供体DNA和质粒，以产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶进行连接。基因表达载体中的标记基因可用于目的基因的筛选和鉴定。（3）农杆菌容易侵染双子叶植物，其质粒中的T-DNA可转移并插入到受体细胞DNA中，将含有YCF1基因的重组载体导入受试双子叶植物印度芥菜，采用最多的方法是农杆菌转化法。考虑转基因技术的安全性，采用不育株系作为实验材料，可避免目的基因在自然界中的扩散。（4）根据分析可知，与野生型比，转基因植株地上部分、地下部分和整株干重均增加，说明转基因植株在Cd污染的土壤中生长较好，即对Cd具有更强的耐性；据图2分析，转基因植株的茎、叶中Cd含量高于野生型，因此对转基因植株的茎、叶进行后续处理，可使转基因植株持续发挥富集Cd的作用，对于缓解土壤Cd污染最为方便有效。（5）YCF1特异定位于转基因植物细胞的液泡膜上，可通过主动运输将Cd离子运到液泡中，提高了细胞液的浓度，有利于植株吸水，所以转基因杨树比野生型能更好地适应高Cd环境。相较于草本植物，杨树具有发达的根系和高大的树冠，更适应污染矿区等不良环境，同时可充分吸收土壤中的Cd，木材也方便运输、利用，作为Cd污染土壤修复植物更具有优势。
14．（2021·全国·统考高考真题）PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是 （用数字序号表示）。
（2）操作③中使用的酶是 。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、
三步，其中复性的结果是 。
（3）为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与 特异性结合。
（4）PCR（多聚酶链式反应）技术是指 。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
【答案】④②③① Taq酶（热稳定DNA聚合酶） 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 病原菌的两条单链DNA 一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术
【详解】（1）PCR技术可用于临床的病原菌检测，若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是④采集病人组织样本→②从病人组织样本中提取DNA→③利用PCR扩增DNA片段→①分析PCR扩增结果。（2）在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，操作③中使用的酶是Taq酶（热稳定DNA聚合酶），PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、延伸三步，其中复性的结果是引物通过碱基互补配对与单链DNA结合。（3）DNA复制需要引物，为了做出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与病原菌的两条单链DNA特异性结合。（4）据分析可知，PCR（多聚酶链式反应）技术是指一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
15．（2021·广东·统考高考真题）非细胞合成技术是一种运用合成生物学方法，在细胞外构建多酶催化体系，获得目标产物的新技术，其核心是各种酶基因的挖掘、表达等。中国科学家设计了4步酶促反应的非细胞合成路线（如图），可直接用淀粉生产肌醇（重要的医药食品原料），以期解决高温强酸水解方法造成的严重污染问题，并可以提高产率。
回答下列问题：
（1）研究人员采用PCR技术从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因。此外，获得酶基因的方法还有 。（答出两种即可）
（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，方法有 。（答出两种即可）
（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备 细胞。为了检测目的基因是否成功表达出酶蛋白，需要采用的方法有 。
（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。若这些酶最适反应条件不同，可能导致的结果是 。在分子水平上，可以通过改变 ，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
【答案】基因文库中获取、人工合成法 盐析法、酶解法或高温变性 感受态 抗原-抗体杂交技术 有的酶失活而使反应中断 基因的碱基序列
【详解】（1）分析题意，研究人员从土壤微生物基因组中扩增得到目标酶基因采用了PCR技术，此外获得酶基因的方法还有从基因文库中获取和人工合成法。（2）高质量的DNA模板是成功扩增出目的基因的前提条件之一。在制备高质量DNA模板时必须除去蛋白，可根据DNA和蛋白质的溶解性、对酶、高温和洗涤剂的耐受性去除蛋白质，方法有盐析、酶解法或高温变性法等。（3）研究人员使用大肠杆菌BL21作为受体细胞、pET20b为表达载体分别进行4种酶的表达。表达载体转化大肠杆菌时，首先应制备感受态细胞， 即利用钙离子处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，使其 易于接受外来的DNA分子。基因工程中，酶基因（目的基因）成功表达的产物酶蛋白的化学本质是蛋白质，常用抗原-抗体杂交技术进行检测。（4）依图所示流程，在一定的温度、pH等条件下，将4种酶与可溶性淀粉溶液混合组成一个反应体系。由于酶的作用条件较温和，若这些酶最适反应条件不同，则可能导致有的酶失活而使反应中断。在分子水平上，可以通过改变基因的碱基序列，从而改变蛋白质的结构，实现对酶特性的改造和优化。
16．（2021·全国·高考真题）用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E. cli DNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中 酶切割后的DNA片段可以用E. cli DNA连接酶连接。上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 ；质粒DNA分子上有 ，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指
。
【答案】 EcRI、PstI EcRI、PstI、 SmaI和EcRV 磷酸二酯键 自我复制 一至多个限制酶切位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞 位于基因首端的一段特殊DNA序列，是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
【详解】（1）限制酶EcRI和PstI切割形成的是黏性末端，限制酶SmaI和EcRV切割形成的是平末端，E. cli DNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来，而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，但连接效率较低。因此图中EcRI和PstI切割后的DNA片段（黏性末端）可以用E. cli DNA连接酶连接，除了这两种限制酶切割的DNA片段，限制酶SmaI和EcRV切割后的DNA片段（平末端）也可以用T4DNA连接酶连接。（2）DNA连接酶将两个DNA片段连接形成磷酸二酯键。（3）质粒是小型环状的DNA分子，常作为基因表达的载体，首先质粒上含有复制原点，能保证质粒在受体细胞中自我复制。质粒DNA分子上有一个至多个限制性核酸内切酶的酶切位点，便于目的基因的导入。质粒上的标记基因是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，具体做法是用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞。（4）启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得需要的蛋白质。
〖2020年高考真题〗
1．（2020·北京·统考高考真题）为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中（如图）。
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是（ ）
A．①+③B．①+②C．③+②D．③+④
【答案】B
【详解】图示中克隆的重金属转运蛋白（HMA3）基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中，若要检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因和高效启动子，需要检测是否含有高效启动子序列和HMA3基因序列，应选择的引物组合是①+②，即B正确，ACD错误。故选B。
2．（2020·浙江·高考真题）下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ）
A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
【答案】D
【详解】A、若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则该酶会对进入受体的重组质粒进行切割，不利于其保持结构稳定，A错误；B、抗除草剂基因转入抗盐植物，获得了抗除草剂抗盐品系和抗除草剂不抗盐品系，不抗盐品系的产生可能是转入的抗除草剂基因插入到抗盐基因内，影响其表达造成，B错误；C、转基因植物中均含抗除草剂基因，但存在抗除草剂和不抗除草剂两种植株，前者表达了抗性蛋白，后者可能抗除草剂基因未转录出mRNA，或转录出的mRNA未能翻译成蛋白质，C错误；D、某种限制性内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带，即3种不同分子量DNA，因此环状质粒上至少有3个酶切位点，D正确。故选D。
3.（2020·天津·统考高考真题）阅读下列材料，回答下列小题。
在应用基因工程改变生物遗传特性，进而利用种间关系进行生物防治方面，中国科学家取得了许多重要进展。
资料一：人类使用化学农药防治害虫，致使环境不断恶化。王成树等从黄肥尾蝎中克隆出一种神经毒素基因AalT，将其导入能寄生在许多害虫体内的绿僵菌中，增强绿僵菌致死害虫的效应，可有效控制虫害大规模爆发。
资料二：小麦赤霉病是世界范围内极具毁灭性的农业真菌病害。王宏伟、孔令让等从长穗偃麦草中克隆出抗赤霉病主效基因Fhb7。将Fhb7导入小麦，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，从而避免小麦赤霉病大规模爆发。
资料三：疟疾由受疟原虫感染的雌按蚊通过叮咬在人群中传播。王四宝等从几种微生物中克隆出5种不同抗疟机制的基因，将它们导入按蚊的肠道共生菌AS1中。在按蚊肠道内，AS1工程菌分泌的基因表达产物可杀灭疟原虫。因AS1可在按蚊亲代和子代种群中扩散，所以在含AS1工程菌按蚊的群落中，疟疾传播一般可被阻断。
（1）目的基因是基因工程的关键要素。关于上述资料中涉及的目的基因，下列分析正确的是（ ）
A．来源：必须从动物、植物或微生物的基因组文库中直接获取
B．作用：上述基因表达产物一定影响防治对象的生长或存活
C．转化：均可采用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞
D．应用：只有将目的基因导入防治对象才能达到生物防治目的
（2）在利用种间关系进行生物防治的措施中，下列分析错误的是（ ）
A．施用绿僵菌工程菌减少虫害，不改变绿僵菌与害虫之间存在寄生关系
B．引入Fhb7增强小麦的抗菌性，目的是调节真菌对植物的寄生能力
C．AS1工程菌分泌的多种表达产物不改变AS1与按蚊之间存在共生关系
D．使AS1工程菌分泌多种表达产物杀灭疟原虫，目的是调节按蚊对人的寄生能力
【答案】（1）B （2）D
【详解】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因——DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA——分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质——抗原—抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。2、生物的种间关系包括竞争、捕食、互利共生和寄生。互利共生是指两种生物共居一起，彼此创造有利的生活条件，较之单独生活时更为有利；相互依赖，相互依存，一旦分离，双方都不能正常地生活。寄生是指一种生物生活在另一种生物的体内或体表，并从后者摄取营养以维持生活的种间关系。前者称寄生物，后者称寄主。大都为一方受益，一方受害，甚至引起寄主患病或死亡。（1）A、目的基因可以从基因文库中获取、利用PCR技术扩增或是人工合成，A错误；B、资料一中神经毒素基因AalT导入绿僵菌中可以增强绿僵菌致死害虫的效应，资料二中Fhb7基因导入小麦，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，资料三，将5种不同抗疟机制的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中，AS1工程菌分泌的基因表达产物可杀灭疟原虫，因此上述基因表达产物一定影响防治对象的生长或存活，B正确；C、基因AalT导入绿僵菌中可用感受态细胞法，Fhb7基因导入小麦可用农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，将5种不同抗疟机制的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中可用感受态细胞法，C错误；
D、要想达到生物防治的目的不一定要将目的基因导入防治对象，如资料一，可将目的基因导入能寄生在多种害虫体内的绿僵菌中，如资料三，可将目的基因导入按蚊的肠道共生菌AS1中，这种方法同样可以达到生物防治的目的，D错误。故选B。（2）A、导入AalT基因的绿僵菌只是增强了致死害虫的效应，没有改变绿僵菌与害虫之间存在的寄生关系，A正确；B、Fhb7基因导入小麦后，其表达产物可减轻赤霉菌对小麦的感染，调节了真菌对植物的寄生能力，B正确；C、AS1工程菌分泌的基因表达产物可杀灭疟原虫，并不会改变AS1与按蚊之间存在的共生关系，C正确；D、使AS1工程菌分泌多种表达产物杀灭疟原虫，目的是阻断疟疾的传播，不会改变按蚊对人的寄生能力，D错误。故选D。
4．（2020·海南·统考高考真题）某课题组用生物技术制备转基因小鼠的过程，如图所示。
回答下列问题。
通常把目的基因转入雄原核而不是雌原核，从两者形态差异上分析，原因是
。
（2）把桑椹胚植入假孕母鼠子宫前，需要对胚胎进行性别鉴定，目前最有效的方法是SRY-PCR法。操作的基本程序是：先从被测胚胎中取出几个细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体的性别决定基因，即SRY基因的一段碱基设计 ，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，最后用SRY特异性探针检测扩增产物。出现阳性反应者，胚胎为 ；出现阴性反应者，胚胎为 。
（3）若目的基因的表达产物是某种特定的蛋白质，检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是 ，检测的基本思路是
。
【答案】 雄性原核较大，更容易容纳外源DNA 引物 雄性小鼠 雌性小鼠 抗原-抗体杂交技术 从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗体进行同位素标记）进行抗原抗体杂交，如果出现杂交带，表明目的基因已经表达成功
【详解】（1）通常来自精子的雄性原核较大，更容易容纳外源DNA，，因此外源基因能够容易整合到精子的染色体上，这是提高转化率的关键。（2）目前，对胚胎的性别进行鉴定的最有效最准确的方法是SRY -PCR法，操作的基本程序是：从被测的囊胚中取出几个滋养层细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体上的性别决定基因（即SRY基因）的一段碱基作引物，在热稳定DNA聚合酶（Taq酶）催化作用下，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，再用SRY特异性探针检测扩增产物，与SRY特异性探针出现阳性反应者，说明其含有Y染色体，胚胎为雄性；出现阴性反应者，说明其不含Y染色体，胚胎为雌性。（3）检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是利用抗原抗体杂交技术，基本步骤：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗体进行同位素标记）进行抗原抗体杂交，如果出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。
5．（2020·北京·统考高考真题）枯草芽孢杆菌可分泌纤维素酶。研究者筛选到一株降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌菌株（B菌），从中克隆得到了一种纤维素酶（C1酶）基因。将获得的C1酶基因与高效表达载体（HT质粒）连接，再导入B菌，以期获得降解纤维素能力更强的工程菌。
（1）纤维素属于 糖，因此经过一系列酶催化最终可降解成单糖，该单糖是 。
（2）对克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，但两者编码出的蛋白的氨基酸序列相同，这是因为 。
（3）C1酶基因以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'。为了使C1酶基因按照正确的方向与已被酶切的HT质粒连接，克隆C1酶基因时在其两端添加了Sma I和BamH I的酶切位点。该基因内部没有这两种酶切位点。图1中酶切位点1和2所对应的酶分别是 。
（4）将纤维素含量为20%的培养基分为三组，一组接种工程菌，对照组1不进行处理，对照组2进行相应处理。在相同条件下培养96小时，检测培养基中纤维素的含量。结果（图2）说明工程菌降解纤维素的能力最强。对照组2的处理应为 。
（5）预期该工程菌在处理废弃物以保护环境方面可能的应用
。（举一例）
【答案】多 葡萄糖 密码子具有简并性，发生碱基的改变仍然编码同一种氨基酸 BamHI、SmaI（顺序不能调换） 向培养基中接种纤维素酶（C1酶） 降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染
【详解】（1）纤维素是葡萄糖聚合形成的多糖，所以经过酶的催化作用，最终降解为葡萄糖。（2）由于密码子具有简并性，所以即使克隆到的C1酶基因测序，与数据库中的C1酶基因编码序列相比有两个碱基对不同，仍然可以编码相同的氨基酸。（3）根据题干信息“以B链为转录模板链，转录时mRNA自身的延伸方向为5'→3'”，所以B链的方向是从3'→5'，根据质粒上启动子的方向，所以B链3'应该用BamH I进行切割，而其5'端应该用SmaI进行切割。（4）本实验的目的是证明工程菌降解纤维素的能力最强，所以对照组1不作处理，组3是添加工程菌，组2的处理是用直接用纤维素酶进行分解纤维素，即向培养基中接种纤维素酶（C1酶）。（5）该工程菌可以高效降解纤维素，所以可以降解秸秆，减少秸秆燃烧带来的空气污染。
5．（2020·江苏·统考高考真题）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图（以EcR I酶切为例）：
请据图回答问题：
（1）步骤I用的EcR I是一种 酶，它通过识别特定的 切割特定位点。
（2）步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′-羟基与5′-磷酸间形成 ；PCR循环中，升温到95℃是为了获得 ；TaqDNA聚合酶的作用是催化 。
（3）若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是 （从引物①②③④中选择，填编号）。
（4）对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中（虚线处省略了部分核苷酸序列），结果正确的是 。
A． 5′- AACTATGCG-----------AGCCCTT-3′
B． 5′- AATTCCATG-----------CTGAATT-3′
C． 5′- GCAATGCGT----------TCGGGAA-3′
D． 5′- TTGATACGO----------CGAGTAC-3′
【答案】限制性核酸内切（或限制） 核苷酸序列 磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸 ②④ B
【详解】（1）EcR I是一种限制性核酸内切酶，它通过识别特定的核苷酸序列切割特定的位点。（2）DNA连接酶可催化相邻核苷酸之间的3'-羟基和5'-磷酸之间形成磷酸二酯键；PCR循环中，升温到95℃时，DNA受热变性后解旋为单链；Taq DNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，能催化以DNA链为模板的DNA链的延伸。（3）引物是一小段单链DNA，引物5'端的碱基可以与DNA两条链的3'端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5'→3'，据题图分析，结合已知序列可知，能与片段F左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。（4）对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcR I剪切的两端，它识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5'端应该是AATTC，3'端是GAATT，故选B。
6．（2020·山东·统考高考真题）水稻胚乳中含直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉所占比例越小糯性越强。科研人员将能表达出基因编辑系统的DNA序列转入水稻，实现了对直链淀粉合成酶基因（Wx基因）启动子序列的定点编辑，从而获得了3个突变品系。
将能表达出基因编辑系统的DNA序列插入Ti质粒构建重组载体时，所需的酶是
， 重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程称为 。
根据启动子的作用推测，Wx基因启动子序列的改变影响了
，从而改变了 Wx基因的转录水平。与野生型水稻相比，3个突变品系中Wx基因控制合成的直链淀粉合成酶的氨基酸序列 (填：发生或不发生)改变，原因是 。
为检测启动子变化对Wx基因表达的影响，科研人员需要检测Wx基因转录产生的mRNA （Wx mRNA）的量。检测时分别提取各品系胚乳中的总RNA，经 过程获得总 cDNA。通过PCR技术可在总cDNA中专一性的扩增出 Wx基因的cDNA，原因是
。
（4）各品系Wx mRNA量的检测结果如图所示，据图推测糯性最强的品系为 ，原因是 。
【答案】限制性核酸内切酶和DNA连接酶 转化 RNA聚合酶与启动子的识别和结合 不发生 编码直链淀粉合成酶的碱基序列中不含启动子 逆转录（或：反转录） 引物是根据Wx基因的一段已知序列设计合成的（或：引物能与Wx基因的cDNA特异性结合） 品系3 品系3的Wx mRNA最少，控制合成的直链淀粉合成酶最少，直链淀粉合成量最少，糯性最强
【详解】（1）将目的基因与Ti质粒构建基因表达载体时，需要限制酶的切割，将目的基因插入载体时需要DNA连接酶的连接，重组载体进入水稻细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程叫做转化。（2）根据以上分析可知，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点，如果启动子序列改变将会影响RNA聚合酶与之结合和识别，进而影响基因的转录水平。在真核生物中，编码蛋白质的序列是基因中编码区，编码区中不包括启动子序列，因此直链淀粉合成酶的基因碱基序列中不含有启动子，因此3个突变品系中Wx基因中控制合成直链淀粉酶的氨基酸序列不发生改变。（3）以mRNA为模板合成cDNA的过程为逆转录，利用PCR技术扩增Wx基因的cDNA，需要以Wx基因合成的引物，这样引物能够在总cDNA中与Wx基因的cDNA特异性结合，从而利用PCR扩增技术专一性扩增出Wx基因的cDNA。（4）识图分析可知，图中品系3的Wx基因的mRNA的含量最少，那么合成的直链淀粉酶最少，直链淀粉合成量最少，因此该水稻胚乳中含的直链淀粉比例最小，糯性最强。
7．（2020·天津·统考高考真题）Ⅰ型糖尿病是因免疫系统将自身胰岛素作为抗原识别而引起的自身免疫病。小肠黏膜长期少量吸收胰岛素抗原，能诱导免疫系统识别该抗原后应答减弱，从而缓解症状。科研人员利用Ⅰ型糖尿病模型小鼠进行动物实验，使乳酸菌在小鼠肠道内持续产生人胰岛素抗原，为此构建重组表达载体，技术路线如下。
据图回答：
（1）为使人胰岛素在乳酸菌中高效表达，需改造其编码序列。下图是改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列。据图分析，转录形成的mRNA中，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有 个。
（2）在人胰岛素A、B肽链编码序列间引入一段短肽编码序列，确保等比例表达A、B肽链。下列有关分析正确的是 。
A．引入短肽编码序列不能含终止子序列
B．引入短肽编码序列不能含终止密码子编码序列
C．引入短肽不能改变A链氨基酸序列
D．引入短肽不能改变原人胰岛素抗原性
（3）在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶仅有图示的酶切位点。用这两种酶充分酶切重组表达载体，可形成 种DNA片段。
（4）检测转化的乳酸菌发现，信号肽-重组人胰岛素分布在细胞壁上。由此推测，信号肽的合成和运输所经历的细胞结构依次是 。
（5）用转化的乳酸菌饲喂Ⅰ型糖尿病模型小鼠一段时间后，小鼠体内出现人胰岛素抗原，能够特异性识别它的免疫细胞有 。
A．B细胞 B．T细胞 C．吞噬细胞 D．浆细胞
【答案】6 ABCD 3 核糖体、细胞质基质、细胞膜、细胞壁 AB
【详解】（1）从图示可知，改造前后人胰岛素B链编码序列的起始30个核苷酸序列有7个核苷酸发生了替换，则其转录形成的mRNA中，也会有7个核苷酸发生改变，一个密码子由mRNA上三个连续的碱基组成，由此可知，该段序列所对应的片段内存在碱基替换的密码子数有6个。（2）要确保等比例表达A、B肽链，则需A、B肽链一起合成，即启动子和终止子在人胰岛素A、B链编码序列两端，在其中间加入一段短肽编码序列后，序列中间不能出现终止子，所转录得到的mRNA中间也不能出现终止密码子，同时不能改变肽链的氨基酸序列和它的功能，综上，答案选ABCD。（3）在重组表达载体中，SacⅠ和XbaⅠ限制酶切位点分别有2个和1个，当将重组表达载体用SacⅠ和XbaⅠ限制酶充分酶切后，会形成3个缺口，得到3种不同的DNA片段。（4）乳酸菌属于原核细胞，其细胞壁上的信号肽在核糖体上合成后，到细胞质基质中加工，再将其运输到细胞膜上，进而转移到细胞壁。（5）人胰岛素抗原能引起小鼠的特异性免疫，在特异性免疫过程中，B细胞和T细胞能特异性识别抗原，而吞噬细胞能识别抗原，但不是特异性识别，浆细胞不能识别抗原。
〖2019年高考真题〗
1．（2019·江苏·统考高考真题）下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是（ ）
A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌
B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株
C．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛
D．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗
【答案】D
【详解】将含胰岛素基因表达载体的重组质粒转入大肠杆菌获得的转基因菌，可以通过二分裂将胰岛素基因传给后代，A不符合题意；将花青素代谢基因导入植物体细胞，再经植物组织培养获得的植株所有细胞均含有花青素代谢基因，花青素代谢基因会随该植物传给后代，B不符合题意；将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛所有细胞均含有肠乳糖酶基因，可以遗传给后代，C不符合题意；该患者进行基因治疗时，只有淋巴细胞含有该腺苷酸脱氨酶基因，性原细胞不含该基因，故不能遗传给后代，D符合题意。故选D。
2．（2019·海南·统考高考真题）人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质（Y），该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
（1）若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取 作为模板，在 催化下合成cDNA，再利用 技术在体外扩增获得大量Y的基因。
（2）将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的
中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经
。
天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是
。
【答案】 mRNA 逆转录酶 PCR T-DNA 整合到叶肉细胞染色体DNA上 找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基
【详解】（1）由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术（体外扩增DNA的技术）在体外扩增获得大量Y的基因。（2）农杆菌转化法中，T-DNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的T-DNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。（3）蛋白质工程需要从预期的蛋白质的功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
3．（2019·江苏·统考高考真题）图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：
（1）EcRV酶切位点为，EcR V酶切出来的线性载体P1为 末端。
（2）用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为 的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在 酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是 （填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是 、
。

为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是 。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是
。
【答案】平 胸腺嘧啶（T） DNA连接 B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 乙丙 目的基因反向连接
【详解】（1）根据题意分析，EcRV酶识别的序列是-GATATC-，并且两条链都在中间的T与A之间进行切割，因此其切出来的线性载体P1为平末端。（2）依题意并据图分析，目的基因两侧为黏性末端，且露出的碱基为A，则在载体P1的两端需要各加一个含有碱基T的脱氧核苷酸，以便形成具有黏性末端的载体P2，再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。（3）根据以上分析已知，限制酶（EcRV酶）切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在含有四环素的培养基中应该不能生长，而在含有氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择B类菌落。根据表格分析，A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。（4）据图分析，根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙；根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物（甲、乙）从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段，说明其目的基因发生了反向连接。
4．（2019·天津·统考高考真题）B基因存在于水稻基因组中，其仅在体细胞（2n）和精子中正常表达，但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响，设计了如下实验。
据图回答：
（1）B基因在水稻卵细胞中不转录，推测其可能的原因是卵细胞中 。
A．含B基因的染色体缺失 B．DNA聚合酶失活
C．B基因发生基因突变 D．B基因的启动子无法启动转录
（2）从水稻体细胞或 中提取总RNA，构建 文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因（表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光）连接成融合基因（表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能），然后构建重组表达载体。
（3）在过程①、②转化筛选时，过程 中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上，过程 在培养基中应加入卡那霉素。
（4）获得转基因植株过程中，以下鉴定筛选方式正确的是 。
A．将随机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交
B．以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交
C．以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交
D．检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光
（5）从转基因植株未成熟种子中分离出胚，观察到细胞内仅含一个染色体组，判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明
。
【答案】D 精子 cDNA ② ① BCD B基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚
【详解】（1）通过题干信息可知，B基因可以在体细胞和精子中，说明含B基因的染色体未缺失，也没有发生基因突变，AC错误；基因表达过程中的转录需要RNA聚合酶，不是DNA聚合酶，B错误；B基因在卵细胞中不能转录，可能是B基因的启动子在卵细胞中不能启动转录，D正确；故选D。（2）通过题干信息可知，水稻的体细胞和精子中B基因可表达，故可从水稻的体细胞和精子中提取RNA。通过逆转录产生DNA，从而构建cDNA文库，进而获得B基因编码蛋白的序列。（3）图示中过程①表示筛选含有目的基因的重组质粒的农杆菌，图示中质粒有抗卡那霉素标记基因和抗潮霉素标记基因，如果选择培养基中加入的是卡那霉素，起作用的是抗卡那霉素标记基因。过程②表示用含有重组质粒的农杆菌转化水稻细胞的过程，该过程将其T-DNA整合到水稻细胞染色体DNA上。（4）获得转基因植株，鉴定筛选方式有：①DNA分子杂交技术，即以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交，故A错误；B正确；②用标记的目的基因作探针与mRNA杂交，即以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交，C正确；③检测目的基因是否翻译成蛋白质，通过（2）可知B基因与Luc基因连接形成B-Luc融合基因，即可通过Luc基因表达，检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光，D正确；故选BCD。（5）转基因植株含有促进B基因在卵细胞转录的启动子，推测转基因植株分离出的只含一个染色体组的胚是由未受精的卵细胞发育形成的，而非转基因水稻卵细胞中B基因不能转录，卵细胞在未受精时不进行发育，由此表明B基因表达能使卵细胞不经受精作用直接发育成胚。
〖2018年高考真题〗
1．（2018·北京·统考高考真题）用XhI和SalI两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（ ）
A．如图中两种酶识别的核苷酸序列不同
B．如图中酶切产物可用于构建重组DNA
C．泳道①中是用SalI处理得到的酶切产物
D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA
【答案】D
【详解】限制酶识别特定的脱氧核苷酸序列，不同的限制酶能识别不同的核苷酸序列，由电泳图可知XhI和SalI两种酶分别切割时，识别的序列不同，A正确；同种限制酶切割出的DNA片段，具有相同的黏性末端，再用DNA连接酶进行连接，可以构成重组DNA，B正确；Sal I将DNA片段切成4段，Xh I将DNA片段切成3段，根据电泳结果可知泳道①为Sal I，泳道②为Xh I，C正确；限制酶切割双链DNA，酶切后的DNA片段仍然是双链DNA，D错误，所以选D。
2．（2018·浙江·统考高考真题）将某种海鱼的抗冻基因导入西红柿细胞中，培育成耐低温的西红柿新品种，这种导入外源基因的方法属于（ ）
A．杂交育种B．转基因技术C．单倍体育种D．多倍体育种
【答案】B
【详解】将一种生物的基因导入另一种生物体内需要采用基因工程技术。因此，将某种海鱼的抗冻基因导入西红柿细胞中，培育成耐低温的西红柿新品种，需要采用转基因技术，这样可以培育出在冬天也能长期保存的西红柿。故选B。
3．（2018·上海·高考真题）阻止病人的致病基因传给子代的方法通常是将正常基因导入病人 （ ）
A．体细胞的细胞质B．生殖细胞的细胞质
C．体细胞的细胞核D．生殖细胞的细胞核
【答案】D
【详解】 亲代是靠配子把遗传物质传给子代，配子中含有致病基因，子代可能患病。要阻止病人把致病基因传给子代，必须保证配子中不含有致病基因，所以要把正常基因导入生殖细胞的细胞核中，以替代原来的致病基因。
4．（2018·上海·高考真题）以重组DNA技术为核心的基因工程正在改变着人类的生活。请回答下列问题。
(1)获得目的基因的方法通常包括 和 。
(2)切割和连接DNA分子所使用的酶分别是 。
(3)运送目的基因进入受体细胞的载体一般选用病毒或 ，后者的形状呈 。
(4)由于重组DNA分子成功导入受体细胞的频率 ，所以在转化后通常需要进行 操作。
(5)将人胰岛素基因分别导入大肠杆菌与酵母菌，从两者中生产的胰岛素在功能和 序列上是相同的。
【答案】化学合成(人工合成) 从含目的基因的生物细胞分离 限制性核酸内切酶(限制酶) DNA连接酶(连接酶) 质粒 小型环状(双链环状、环状) 低 筛选 氨基酸
【详解】(1)获得目的基因，可以从含有目的基因的细胞中分离，在基因的碱基序列已知的前提下，也可以用化学合成的方法合成目的基因。(2)切割DNA分子需要用限制性内切酶，连接DNA分子需要用DNA连接酶。(3)运送目的基因进入受体细胞的载体包括动植物病毒、λ噬菌体的衍生物或质粒，质粒是小型的环状DNA分子。(4)重组DNA分子成功导入受体细胞的频率较低，所以在转化后通常需要进行筛选操作，以选出含有重组DNA的受体细胞。(5)将人胰岛素基因分别导入大肠杆菌与酵母菌，由于不同生物共用同一套密码子，从两者中生产的胰岛素在功能和氨基酸序列上是相同的。
5．（2018·海南·统考高考真题）甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质。为了改善黄瓜的品质，科学家采用农杆菌转化法将一种甜蛋白基因成功导入黄瓜细胞，得到了转基因植株。回答下列问题：
（1）用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜 （填“受伤的”或“完好的”）叶片与含重组质粒的农杆菌共培养，选用这种叶片的理由是
。
（2）若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中 已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，发现子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1:1，则说明甜蛋白基因已经整合到 （填“核基因组”“线粒体基因组”或“叶绿体基因组”）中。
（3）假设某种转基因作物因为受到病毒感染而减产，若要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，应选用
作为外植体进行组织培养。
通常，基因工程操作主要有4个步骤，即目的基因获取、重组表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。因此，基因工程的含义可概括为
。
【答案】受伤的 叶片伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞 甜蛋白基因 核基因组 茎尖 按照人们的愿望进行设计，并通过体外重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型
【详解】（1）如果叶片受伤，伤口处的细胞释放出大量酚类物质，可吸引农杆菌移向这些细胞，故用农杆菌感染时，应优先选用黄瓜受伤的叶片与含重组质粒的农杆菌共培养。 （2）若在转基因黄瓜中检测到这种甜蛋白，则表明该重组质粒中甜蛋白基因已转移到植物细胞中且能够表达；用该转基因黄瓜的某一植株与一株非转基因植株杂交，其子代中含甜蛋白个体数与不含甜蛋白个体数之比为1:1，根据基因分离定律，得知转基因黄瓜植株为杂合子，非转基因植株为隐性个体，为测交，故说明甜蛋白基因已经整合到核基因组中。（3）要以该转基因作物为材料获得脱毒苗，由于茎尖生长点的细胞分裂生长最为活跃，且容易分化成其他器官，这是其他分生区细胞所不具备的优点，另外取材方便，故应选用茎尖作为外植体进行组织培养。（4）基因工程的含义可概括为按照人们的愿望进行设计，并通过体外重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出符合人们需要的新生物类型。
6．（2018·天津·统考高考真题）甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。
（1）改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用 技术扩增，并将其中某些基因（不包括表面抗原基因）内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的
，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。
（2）构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与（1）中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸（Uaa）。将该基因与 连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的 进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。
（3）利用转基因宿主细胞制备疫苗。将（1）中的重组质粒导入（2）中的转基因宿主细胞，并在补加
的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是 。
A．病毒的DNA聚合酶
B．宿主的DNA聚合酶
C．病毒的RNA聚合酶
D．宿主的RNA聚合酶
（4）上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起 免疫，增强免疫保护效果。
【答案】PCR 多肽（或蛋白质） 载体 总RNA 非天然氨基酸（Uaa） D 细胞
【详解】（1）PCR技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。因此以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用PCR技术扩增，由于将其中某些基因（不包括表面抗原基因）内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列，因此肽链合成提前终止，这样与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的多肽（或蛋白质），因此不能产生子代病毒。（2）基因工程的核心步骤为基因表达载体的构建，将该基因与载体连接后才能导入宿主细胞，检测目的基因是否成功表达上述tRNA时，利用核酸分子杂交技术，即用相应的DNA探针与宿主细胞的总RNA分子进行杂交鉴定，进而筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。（3）因为设计的宿主细胞具有能合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与（1）中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸（Uaa），因此可在补加非天然氨基酸（Uaa）的培养基中进行培养，筛选出宿主细胞。进而利用该宿主细胞，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。因为转录在宿主细胞内进行，且启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，因此需要使用宿主细胞的RNA聚合酶。故选D。（4）不具侵染性的流感病毒灭活疫苗，不能侵入细胞内部，只能引起体液免疫，产生相应的抗体与记忆细胞，而该疫苗能够侵入细胞，引起的免疫属于细胞免疫。
7．（2018·全国·统考高考真题）某种荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1-GFP融合基因（简称为甲），并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1~E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是 。使用这两种酶进行酶切是为了保证 ，也是为了保证
。
（2）将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了 和 过程。
（3）为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的 移入牛的 中、体外培养、胚胎移植等。
（4）为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的 （填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”）作为PCR模板。
【答案】E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接 转录 翻译 细胞核 去核卵母细胞 核DNA
【详解】（1）要保证目的基因在受体细胞中能够正确表达，目的基因的首端应有启动子，尾端应有终止子。甲是将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5ˊ末端而获得的L1-GFP融合基因，据此结合题意并分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0时，如果用E2或E3，则目的基因不完整，而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶，是E1和E4。（2）构建的真核表达载体P1中含有GFP基因，而GFP基因的表达产物“某种荧光蛋白（GFP）”在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。若在导入P1的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了表达。基因的表达过程包括转录和翻译。（3）若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。（4）PCR是多聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定DNA片断的核酸合成技术。若利用PCR方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。
8．（2018·江苏·统考高考真题）为生产具有特定性能的α-淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀粉酶基因（1656个碱基对），利用基因工程大量制备琢α-淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：
（1）利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前，需先获得细菌的 。
（2）为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的 端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是
。
（3）进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中 的设定与引物有关， 的设定与扩增片段的长度有关。（填序号）
①变性温度②退火温度③延伸温度④变性时间⑤退火时间⑥延伸时间
（4）下图表示筛选获得的工程菌中编码α-淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：
图中虚线框内mRNA片段包含 个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有 种。
（5）获得工程菌表达的α-淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：
根据上述实验结果，初步判断该α-淀粉酶活性最高的条件为
。
【答案】基因组DNA 5’ 使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连 ② ⑥ 8 13 pH为8．5，缓冲液为50mml/LTris-HCl
【详解】（1）α-淀粉酶基因来自于海洋细菌，因此为了利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因，必须先获得细菌的基因组DNA。（2）目的基因与运载体结合前需要用限制酶对两者进行切割，延伸是在引物的3’端延伸，为了保证目的基因的完整性，因此需在引物的5’端加上限制性酶切位点，且为了使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连，常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点。（3）进行扩增时，退火温度的设定与引物有关，延伸时间的设定与扩增片段的长度有关。（4）根据题意分析，虚线框内mRNA片段内含有24个碱基，每3个碱基构成一个密码子，因此包含24÷3=8个密码子；构成mRNA的碱基有4种，若虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有4×4-3=13种。（5）根据表格数据分析可知，在pH为8.5，缓冲液为50 mml/L Tris-HCl的条件下，α-淀粉酶相对活性为99.5%，活性最高。
〖2017年高考真题〗
1．（2017·北京·统考高考真题）为了增加牡丹的花色类型，研究者从某植物中克隆出花色基因C （图1），拟将其与质粒（图2）重组，
再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是（ ）
A．用限制性核酸内切酶EcRⅠ和DNA连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染牡丹的愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加青霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
【答案】C
【详解】A、用限制性核酸内切酶EcRI处理目的基因和质粒，可以使目的基因两侧和质粒产生相同的黏性末端，再用连接酶把切口连起来就能构建成重组质粒，A正确；B、农杆菌转化法适用于双子叶植物或裸子植物，菊花属于双子叶植物，故可用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞，B正确；C、质粒中只有潮霉素抗性基因，被转化的菊花细胞只对潮霉素具有抗性，在培养基中添加青霉素，不能筛选被转化的菊花细胞，C错误；D、检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体上，可采用DNA分子杂交技术，D正确。故选C。
2．（2017·上海·统考高考真题）生物工程包含多项分支技术，就其产业化应用而言，生物工程的基本原理是（ ）
A．必须改造相关生物的基因B．以糖类物质作为主要原料
C．以活细胞作为生物反应器D．以原生物体的代谢物为产品
【答案】C
【详解】从产业化利用角度分析，生物工程的基本原理是以活细胞作为生物反应器，获得人类所需的细胞产物，故选C。
3．（2017·江苏·统考高考真题）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：
（1）从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过 获得 用于PCR扩增。
（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的 位点。设计引物时需要避免引物之间形成 ，而造成引物自连。
（3）图中步骤1代表 ，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏 的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但 的引物需要设定更高的退火温度。
（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有 （填序号：①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物）。
【答案】逆转录 cDNA 限制性核酸内切酶 碱基互补配对 变性 引物与模板 GC含量高 ②③
【详解】（1）PCR扩增目的基因，首先要有目的基因作为模板，所以从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA，从而用于PCR扩增。（2）构建重组质粒，首先用限制酶切割含目的基因的DNA片段和质粒，所以位于目的基因两端的引物中需要增加适量的限制酶位点。设计的引物之间不能有碱基互补配对，否则引物自连，不能与模板相连。（3）图中步骤1、2、3分别表示变性、退火、延伸，这三个步骤组成一轮循环。（4）退火表示引物与模板链相连，若温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。由于G-C间三个氢键，A-T间两个键，所以G-C含量越高的引物，退火温度越高。（5）PCR反应得不到任何扩增产物，可能是退火温度过高，导致引物与模板不能相连，或引物间相互配对，引物自连，不能与模板相连，可通过降低退火温度或重新设计引物进行改进。
4．（2017·上海·统考高考真题）列关于遗传信息的传递与表达的问题
为了探究基因在高等动物体内不同发育阶段和不同类型的细胞中表达的持异性，通常以绿色荧光蛋白编码基因(GFP)作为目的基因构建转基因动物。
1. 得GFP基因的方法一般包括 和 。
2. 使用限制酶PstI(识别序列和切割位点如图A所示）切开GFP，其产生的末端应该为 。
3. 知图B所示质粒经EcRI和AatII联合酶切后形成1.0kb和3.2 kb (1kb = 1000对碱基）两种DNA片段，若将0.8 kb的单个基因插在质粒的PstI位点处，所形成的重组质粒用EcRI和AatII联合酶切后，能形成两种DNA片段，其大小应分别为 kb和 kb。
4. 上述重组质粒导入小鼠受精卵雄性原核中的常规方法是 。
5. 上述受精卵移植发育而成且头部发荧光的转基因小鼠中，全身各种组织或细胞均含有的物质是 。
①GFP基因 ②GFPmRNA ③GFP蛋白
A．① B．①② C．②③ D．①②③
【答案】从相关生物细胞中分离 人工化学合成 D 1.8 3.2 显微注射 A
【解析】【小题1】获得目的基因的方法有从相关生物细胞中分离和人工化学合成。【小题2】根据图20 A所给出的PstI识别序列和切割位点，使用限制酶PstI切开GFP，其产生的末端应该为与选项中D吻合，所以选D。【小题3】根据图20 B和题意“质粒经EcRI和AatII联合酶切后形成1.0kb和3.2 kb两种DNA片段”可推知，其中所得到的1.0kb的DNA片段才是包含PstI酶切位点的片段。如果把目的基因（0.8kb）插入到PstI酶切位点处，则用EcRI和AatII联合酶切质粒后形成DNA片段大小分别为1.0+0.8=1.8kb和3.2kb。【小题4】将目的基因导入动物受精卵的常用方法是显微注射法。【小题5】转基因小鼠是由含GFP基因的受精卵发育而成，所以该转基因小鼠的全身各种组织或细胞均含有GFP基因，但由该基因控制合成的GFPmRNA和GFP蛋白却只在小鼠的头部特定细胞内才表达含有。
5．（2017·全国·统考高考真题）真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子）可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
（1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是
。
（2）若用家蚕作为表达基因A的载体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。
（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有
(答出两点即可)等优点。
（4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是 (填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。
（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是
。
【答案】基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A 噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕 繁殖快、容易培养 蛋白A的抗体 DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物体
【详解】（1）基因A的编码区中有内含子，在真核生物细胞内把内含子转录来的RNA切除，而原核生物细胞内基因转录后不切除，转录后直接表达，所以翻译形成的蛋白质不是蛋白A。（2）由于噬菌体是专性寄生在细菌体内的病毒，无法侵染到真核生物家蚕细胞内，所以不能用噬菌体作为运载体。而家蚕属于昆虫，故可用昆虫病毒作为运载体。（3）大肠杆菌作为受体菌具有繁殖周期短、易培养、遗传物质较少等特点，转入的基因受大肠杆菌遗传物质影响较小，短期内容易得到较多的基因表达的产物。（4）检测目的基因是否表达通常用抗原－抗体杂交技术。（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，证明了生物的遗传物质是DNA，还为基因工程理论的建立提供了启示，这一启示是DNA可以从一种生物转移到另一种生物个体。
6．（2017·全国·统考高考真题）几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是 。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是 。
（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是
。
（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是 （答出两点即可）。
（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是 。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是 。
【答案】嫩叶组织细胞易破碎 相应mRNA多抑制RNA被水解 逆转录过程的碱基互补配对 目的基因因缺少相应的启动子和终止子，缺少复制原点 磷酸二酯键 转录和翻译过程受影响
【详解】（1）由于嫩叶组织细胞易破碎，因此在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止提取的mRNA被RNA酶分解。（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，原因是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是：质粒载体中有启动子、终止子，便于目的基因的表达；质粒中含有复制原点等。（4）DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。（5）基因表达包括转录和翻译两个步骤，若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，其可能的原因是几丁质酶基因没有转录或翻译异常。
〖2016年高考真题〗
1．（2016·全国·高考真题）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcR I、BamH I和Sau3A I三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的EcR I、Sau3A I的切点是唯一的）。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）经BamH I酶切得到的目的基因可以与上述表达载体被 酶切后的产物连接，理由是 。
（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有 ，不能表达的原因是 。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有 和 ，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是 。
【答案】Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游， 丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能转录 E·cliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
【详解】（1）由于限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割后形成的黏性末端相同，所以经BamH I酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。（2）在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达。图中甲、丙均不符合，所以不能表达目的基因的产物。（3）常见DNA连接酶的有E·cliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶。
2．（2016·全国·高考真题）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamH I酶切后，与用BamH I酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有
（答出两点即可）。
而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是
；并且 和
的细胞也是不能区分的，其原因是 。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有 的固体培养基。
（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于 。
【答案】能自我复制、具有标记基因 二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒） 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 受体细胞
【详解】（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有：能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点等。（2）依题意可知，目的基因插入后，导致四环素抗性基因（Tetr ）失活，而氨苄青霉素抗性基因（Ampr）仍能行使正常功能。如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞，因二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长，所以是不能区分的；含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞，因二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都能生长，因此也是不能区分的。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基；因目的基因插入后，导致四环素抗性基因（Tetr ）失活，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌在该培养基中不能生长，而含有质粒载体的则能正常生长。 （3）噬菌体是专门寄生在细菌细胞这的病毒，在侵染细菌时，噬菌体的DNA进入到细菌细胞中，而蛋白质外壳留在细胞外；在噬菌体的DNA指导下，利用细菌细胞中的物质来合成噬菌体的组成成分，据此可知，基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。
3．（2016·海南·统考高考真题）基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题：
（1）在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即 和从
中分离。
利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是
。
（3）在基因表达载体中，启动子是 聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是 。
（4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有 和 颗粒。
【答案】人工合成 自然界已有的物种 cDNA文库中只含有叶细胞已转录（或已表达）的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因 RNA 大肠杆菌（或答细菌） 金粉 钨粉
【详解】（1）获取目的基因主要有两大途径，即人工合成和从自然界已有的物种中分离。（2）植物的成熟叶片中基因已选择性表达，因此由所有RNA逆转录形成的cDNA文库中只含有叶细胞已转录（或已表达）的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因。（3）在基因表达载体中，启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，由于易于培养，最常用大肠杆菌（或细菌）。
（4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有金粉和钨粉颗粒。
4．（2016·江苏·统考高考真题）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用 两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过 酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于 态的大肠杆菌。
(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加 ，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中 。
(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为 ，对于该部位，这两种酶 (填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。
(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得 种大小不同的DNA片段。
【答案】（1）BclI和HindⅢ 连接 感受 （2）四环素 引物甲和引物丙 （3） 都不能 （4）7
【详解】（1）选择的限制酶在目的基因的两侧都应该有切割位点，又因为用BamHⅠ酶会将两个标记基因都破坏，所以构建基因表达载体时只能选择BclI和HindⅢ对质粒和目的基因进行切割，漏出两种不同的黏性末端，再利用DNA连接酶将两者定向连接。再将重组质粒导入感受态的大肠杆菌进行扩增。（2）由于构建重组质粒的时候，氨苄青霉素抗性基因被破坏，而四环素的抗性基因没有被破坏，所以为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素。根据图2可知对目的基因进行扩增时的引物应该是引物甲和引物丙。（3）根据表格中碱基分析，若BamH I酶切的DNA末端与Bcl I酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为，对于该部位，这两种酶都不能切开。（4）根据表格分析可知Sau3A I可以切割BclI和BamH I的切割位点，所以若用Sau3A I切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。
5．（2016·天津·统考高考真题）人血清白蛋白（HSA） 具有重要的医用价值，只能从人血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA（rHSA）的两条途径。
（1）为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取 合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。
（2）启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是 （填写字母，单选）。
A．人血细胞启动子 B．水稻胚乳细胞启动子 C．大肠杆菌启动子 D．农杆菌启动子
（3）利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是
。
（4）人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才有活性。与途径Ⅱ相比，选择途径Ⅰ获取rHSA的优势是 。
（5）为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与 的生物学功能一致。
【答案】总RNA（或mRNA） B 吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化 水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工 HSA
【详解】（1）合成总cDNA需提取细胞中所有的mRNA，然后通过逆转录过程获得。采用PCR技术扩增HSA时，母链的方向是3＇到5＇，子链的延伸方向是5＇到3＇，两条引物分别与模板链的5＇端互补配对结合，引导子链延伸，故两条引物延伸方向是相反的。（2）根据启动子通常具有物种及组织特异性，在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA，需选择水稻胚乳细胞的启动子。（3）农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引农杆菌向受伤组织集中转化。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中。水稻是单子叶植物，不能产生上述的酚类化合物，故在农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需要添加酚类化合物，吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因的转移。（4）水稻是真核生物，具有生物膜系统，能对初始rHSA多肽进行加工才能形成正确的空间结构，获得的HAS才有活性，而大肠杆菌是原核生物，细胞中不具有膜结构的细胞器，无法对初始rHSA多肽进行加工。（5）为证明rHSA具有医用价值，需确认rHSA与天然的HSA的生物学功能是否一致。
〖2015年高考真题〗
1．（2015·重庆·高考真题）下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是（ ）
A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得
B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原（起）点
C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
【答案】C
【详解】人肝细胞中胰岛素基因不表达，因而不存在胰岛素mRNA；A错误。复制原点是基因表达载体复制的起点，而胰岛素基因表达的起点是启动子；B错误。借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来；C正确。启动子与RNA聚合酶结合启动转录过程，终止密码子是翻译的终止信号；D错误。
2．（2015·全国·高考真题）已知生物体内有一种蛋白质（P），该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质（P1）不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
（1）从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的 进行改造。
（2）以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰 基因或合成 基因，所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括 的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即： 。
（3）蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过
和 ，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，在经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物 进行鉴定。
【答案】 氨基酸序列（或结构） P P1 DNA和RNA DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质（或转录、逆转录、翻译） 设计蛋白质结构 推测氨基酸序列 功能
【详解】（1）由题干信息可知改造蛋白质的功能，可通过改变蛋白质的结构实现。（2）依据蛋白质工程的定义及题中信息可知获得P1基因的途径有修饰现有（P）基因或合成新（P1）基因。中心法则的全部内容包括：DNA的复制、RNA的复制、转录、逆转录和翻译。（3）蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相应的脱氧核苷酸序列。通过蛋白质工程合成的蛋白质还需要进行生物活性的鉴定即功能鉴定，看是否达到人们的需求。
3．（2015·江苏·高考真题）胰岛素 A、B 链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。 图 1 是该方法所用的基因表达载体,图2 表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程(融合蛋白A、B 分别表示-半乳糖苷酶与胰岛素 A、B链融合的蛋白)。 请回答下列问题:
(1)图1 基因表达载体中没有标注出来的基本结构是 。
(2)图1 中启动子是 酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达；氨苄青霉素抗性基因的作用是 。
(3)构建基因表达载体时必需的工具酶有 。
(4)β-半乳糖苷酶与胰岛素A 链或B 链融合表达,可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部,其意义在于 。
(5)溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键,用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的 A 链或 B 链,且-半乳糖苷酶被切成多个肽段,这是因为
。
(6)根据图2 中胰岛素的结构,请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量。 你的推测结果是 ,理由是 。
【答案】终止子 RNA聚合 作为标记基因，将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来 限制酶和DNA连接酶 防止胰岛素的A、B链被菌体内蛋白酶降解 β-半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸，而胰岛素A、B链中不含甲硫氨酸 至少2个 两条肽链的一端各有一个游离的氨基，氨基酸的R基中可能还含有游离的氨基
【详解】（1）基因表达载体包括复制原点、启动子、终止子、标记基因和目的基因，图1基因表达载体缺少终止子。 （2）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，使目的基因转录；氨苄青霉素抗性基因是标记基因，能够将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来。 （3）构建基因表达载体需要的工具酶是限制酶和DNA连接酶。 （4）将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部，可防止胰岛素的A、B链被菌体内蛋白酶降解。（5）由于β-半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸，而胰岛素A、B链中不含甲硫氨酸，所以用溴化氰处理相应的融合蛋白，可获得完整的A链或B链，β-半乳糖苷酶被切成多个肽段。 （6）胰岛素共有两条肽链，每条肽链的一端各有一个游离的氨基，而氨基酸的R基中可能还含有游离的氨基，所以每个胰岛素分子中至少含有2个游离的氨基。
4．（2015·江苏·高考真题）荧光原位杂交可用荧光标记的特异DNA片段为探针，与染色体上对应的DNA片段结合，从而将特定的基因在染色体上定位。请回答下列问题:
(1)DNA荧光探针的制备过程如图1所示，DNA酶Ⅰ随机切开了核苷酸之间的 键从而产生切口，随后在DNA聚合酶Ⅰ作用下，以荧光标记的 为原料，合成荧光标记的D NA探针。
(2)图2表示探针与待测基因结合的原理。先将探针与染色体共同煮沸，使DNA双链中 键断裂，形成单链。随后在降温复性过程中，探针的碱基按照 原则，与染色体上的特定基因序列形成较稳定的杂交分子。图中两条姐妹染色单体中最多可有 条荧光标记的DNA片段。
(3)A、B、C分别代表不同来源的一个染色体组，已知AA和BB中各有一对同源染色体可被荧光探针标记。若植物甲(AABB)与植物乙(AACC)杂交，则其F1有丝分裂中期的细胞中可观察到 个荧光点；在减数第一次分裂形成的两个子细胞中分别可观察到 个荧光点。
【答案】磷酸二酯 脱氧核苷酸 氢 碱基互补配对 4 6 2和4
【详解】（1）根据题意和图示分析可知：DNA酶Ⅰ随机切开了核苷酸之间的磷酸二酯键从而产生切口，形成一段一段的DNA分子片段。在DNA聚合酶Ⅰ作用下，以荧光标记的四种脱氧核苷酸为原料，合成荧光标记的DNA探针。（2）DNA分子是双链结构，通过氢键连接．将探针与染色体共同煮沸，使DNA双链中氢键断裂，形成单链，随后在降温复性过程中，探针的碱基按照A-T、C-G的碱基互补配对原则，与染色体上的特定基因序列形成较稳定的杂交分子，图中两条姐妹染色单体中含有2个DNA分子共有4条链，所以最多可有4条荧光标记的DNA片段。（3）由于AA和BB中各有一对同源染色体可被荧光探针标记，若植物甲（AABB）与植物乙（AACC）杂交，则其F1，有丝分裂中期的细胞（AABC）中可观察到6个荧光点，在减数第一次分裂形成的两个子细胞中分别可观察到含A和含AB的2和4个荧光点。
5．（2015·上海·统考高考真题）回答下列有关遗传信息传递与表达的问题。
如图A所示，质粒pZHZ9上含有X抗生素抗性基因（XR）和Y抗生素抗性基因（YR）。其中XR内部含有限制酶KasI识别序列，YR内部含有限制酶FseI、HpaII、NaeI、NgMIV识别序列，五种酶的识别序列如图B（▼表示切割位点），且这些识别序列在整个质粒上均仅有一处，目的基因内部不存在这些识别序列。
若要将结构如图C所示的目的基因直接插入到YR内形成重组质粒pZHZ10，则pZHZ9需用限制酶
切开。
（2）将上述切开的质粒溶液与目的基因溶液混合，加入DNA连接酶连接后，进行大肠杆菌受体细胞导入操作。之后，受体细胞的类型（对两种抗生素表现出抗性R或敏感性S）包含 。
A．XR、YRB．XR、YSC．XS、YRD．XS、YS
（3）若用KasI和FseI联合酶切重组质粒pZHZ 10（只含单个目的基因），则可能产生的酶切片段数为 。
（4）动物基因工程通常以受精卵作为受体细胞的根本原因是 。
A．受精卵能使目的基因高效表达 B．受精卵可发育成动物个体
C．受精卵基因组更易接受DNA的插入 D．受精卵尺寸较大，便于DNA导入操作
【答案】 NgMIV ABD ABC B
【详解】（1）分析图，通过比较五种限制酶的识别位点和露出的黏性末端，可以看出只有限制酶NgMIV切割DNA分子后露出的黏性末端与目的基因的两端的黏性末端相同，进而可以把目的基因插入质粒中。（2）将图中切开的质粒溶液与目的基因溶液混合，加入DNA连接酶连接后，有的质粒可能没有导入目的基因，这种普通质粒导入受体细胞后，由于XR、YR基因都没有被破坏，因此两种抗性都存在，故A正确；目的基因插入质粒后，由于YR基因被破坏，因此重组质粒导入受体细胞后，只具有XR抗性，表现XR、YS，故B正确；若是没有导入质粒，表现为XS、YS，没有其他情况，故C错误，D正确。（3）根据题意，XR内部含有限制酶KasI识别序列，YR内部含有限制酶FseI、HpaII、NaeI、NgMIV识别序列，五种酶的识别序列在整个质粒上均仅有一处，如果插入目的基因后，NgMIV的识别序列有两处，根据题意，能够被NgMIV识别的序列都能被FseI识别，因此若用KasI和FseI联合酶切重组质粒pZHZ 10，最少可以切开一个位点，得到一种DNA片段，最多切开3个位点，得到三种DNA片段，故ABC正确，D错误。（4）受精卵和体细胞都能使目的基因高效表达，故A错误；动物体细胞的全能性受到限制，不能表现出来，受精卵的全能性最高，因此转基因动物一般用受精卵作为受体细胞，故B正确；受精卵的体积较大，便于进行目的基因的导入和操作，但这不是根本原因，故CD不合题意。
6．（2015·福建·高考真题）GDNF是一种神经营养因子．对损伤的神经细胞具有营养和保护作用．研究人员构建了含GDNF基因的表达载体（如图1所示），并导入到大鼠神经干细胞中，用于干细胞基因治疗的研究．请回答：
在分离和培养大鼠神经干细胞的过程中，使用胰蛋白酶的目的是 。
（2）构建含GDNF基因的表达载体时，需选择图1中的 限制酶进行酶切．
（3）经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、GDNF基因与载体反向连接（如图1所示）．为鉴定这3种连接方式，选择HpaI酶和BamHI酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示．图中第 泳道显示所鉴定的载体是正向连接的．
（4）将正向连接的表达载体导入神经干细胞后，为了检测GDNF基因是否成功表达，可用相应的 与提取的蛋白质杂交．当培养的神经干细胞达到一定的密度时，需进行 培养以得到更多数量的细胞，用于神经干细胞移植治疗实验．
【答案】使细胞分散开 XhⅠ ② 抗体 传代
【详解】（1）动物细胞培养时，可用胰蛋白酶或胶原蛋白酶作用，使细胞分散开；（2）质粒上有XhⅠ识别位点，而且在启动子之后，所以选用XhⅠ限制酶进行酶切；（3）泳道①仅有一种条带，属于载体自连；泳道②有两种条带，且长度分别与质粒和GDNF基因长度相同，为正向连接；泳道③有两种条带，长度与BamHⅠ酶切后结果相同，为反向连接；（4）检测基因是否表达采用抗原抗体杂交法．培养动物细胞采用动物细胞培养法，当细胞密度达到一定程度，需要进行分瓶，进行传代培养。
7．（2015·四川·高考真题）将苏云金杆菌Bt蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如下图所示（注：农杆菌Ti质粒上只有T-DNA片段能转移到植物细胞中）。
（1）过程①需用同种 酶对含Bt基因的DNA和Ti质粒进行酶切。为将过程②获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用 培养基。
（2）过程③中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让 进入棉花细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是
。
若过程④仅获得大量的根，则应在培养基中增加 以获得芽；部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是
。
（4）检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是 。种植转基因抗虫棉能减少 的使用，以减轻环境污染。
【答案】限制性核酸内切 选择 T－DNA 筛选获得T－DNA片段的植物细胞 细胞分裂素浓度 顶芽端合成的生长素向基部运输，促进根的分化 投放棉铃虫 农药
【详解】（1）过程①需用同种限制性核酸内切酶（限制酶）对含Bt基因的DNA和Ti质粒进行酶切。为将过程②获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用选择培养基。（2）过程③中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让重组质粒中的T－DNA片段进入棉花细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是筛选获得T－DNA片段的植物细胞，即含目的基因的受体细胞。（3）若过程④仅获得大量的根，则应在培养基中增加细胞分裂素以获得芽；部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是顶芽端合成的生长素向基部运输，促进根的分化。（4）检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是直接接种害虫，观察其生存情况。种植转基因抗虫棉能减少农药的使用，以减轻环境污染。
8．（2015·海南·高考真题）在体内，人胰岛素基因表达可合成出一条称为前胰岛素原的肽链，此肽链在内质网中经酶甲切割掉氨基端一段短肽后成为胰岛素原，进入高尔基体的胰岛素原经酶乙切割去除中间片段C后，产生A、B两条肽链，再经酶丙作用生成由51个氨基酸残基组成的胰岛素。目前，利用基因工程技术可大量生产胰岛素。回答下列问题：
(1)人体内合成前胰岛素原的细胞是 ，合成胰高血糖素的细胞是 。
(2)可根据胰岛素原的氨基酸序列，设计并合成编码胰岛素原的 序列，用该序列与质粒表达载体构建胰岛素原基因重组表达载体，再经过细菌转化、筛选及鉴定，即可建立能稳定合成
的基因工程菌。
(3)用胰岛素原抗体检测该工程菌的培养物时，培养液无抗原抗体反应，菌体有抗原抗体反应，则用该工程菌进行工业发酵时，应从 中分离、纯化胰岛素原。胰岛素原经酶处理便可转变为胰岛素。
【答案】（1）胰岛B细胞 胰岛A细胞 （2）DNA（序列） 胰岛素原 （3）菌体
【详解】（1）由题意可知，前胰岛素原在细胞内经加工后成为胰岛素，人体合成胰岛素的细胞是胰岛B细胞，所以合成前胰岛素原的细胞也是胰岛B细胞；合成胰高血糖素的细胞是胰岛A细胞。（2）根据胰岛素原的氨基酸序列，可设计并合成编码胰岛素原的DNA序列（即目的基因）；用该序列与质粒表达载体构建胰岛素原基因重组表达载体，再经过细菌转化、筛选及鉴定，即可建立能稳定合成人胰岛素原的基因工程菌。（3）根据题意，培养液无抗原抗体反应，菌体有抗原抗体反应，所以用该工程菌进行工业发酵时，应从菌体中分离、纯化胰岛素原，经酶处理便可转变为胰岛素。
〖2014年高考真题〗
1．（2014·重庆·高考真题）下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是（ ）
A．②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与
B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
【答案】D
【详解】构建载体需要限制酶和DNA连接酶，A错误；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T-DNA不是整合到染色体上，而是整合到DNA分子上，B错误；染色体上含有目的基因，但目的基因也可能不能转录或者不能翻译，或者表达的蛋白质不具有生物活性，C错误；植株表现出抗虫性状，说明含有目的基因，属于基因重组，为可遗传变异，D正确。
2．（2014·广东·高考真题·多选）利用基因工程技术生产羧酸酯酶（CarE）制剂的流程如图所示，下列叙述正确的是（ ）
A．过程①需使用逆转录酶
B．过程②需使用解旋酶和PCR获取目的基因
C．过程③使用的感受态细胞可用NaCl溶液制备
D．过程④可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞
【答案】AD
【详解】A、过程①是以mRNA为模板合成DNA的过程，即逆转录过程，需要逆转录酶的催化，故A正确；B、过程②表示利用PCR扩增目的基因，在PCR过程中，不需要解旋酶，是通过控制温度来达到解旋的目的，故B错；C、利用氯化钙处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞，故C错；D、检测目的基因是否成功导入受体细胞的染色体DNA中，可以采用DNA分子杂交技术，故D正确。故选AD。
3．（2014·江苏·高考真题·多选）下列关于基因工程技术的叙述,错误的是（ ）
A．切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6 个核苷酸序列
B．PCR 反应中温度的周期性改变是为了 DNA 聚合酶催化不同的反应
C．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因
D．抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达
【答案】ABC
【详解】A、切割质粒的限制性核酸内切酶可特异性识别4、5、6或8个核苷酸序列，A错误；B、PCR技术采用不同的温度是为了变性、复性和延伸，B错误；C、载体质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因，C错误；D、抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达，因此还需要进行目的基因的检测和鉴定，D正确。故选ABC。
4．（2014·海南·高考真题）下面是将某细菌的基因A导入大肠杆菌内，制备“工程菌”的示意图。
请据图回答：
⑴获得A有两条途径：一是以A的mRNA为模板，在 酶的催化下，合成互补的单链DNA，然后在 作用下合成双链DNA，从而获得所需基因；二是根据目标蛋白质的
序列，推测出相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测其DNA的
序列，再通过化学方法合成所需基因。
⑵利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有 、
、4种脱氧核苷酸三磷酸和耐热性的DNA聚合酶，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。
⑶由A和载体B拼接形成的C通常称为 。
⑷在基因工程中，常用Ca2＋处理D，其目的是
。
【答案】转录酶 DNA聚合酶 氨基酸 脱氧核苷酸 引物 目的基因模板（A基因） 基因表达载体 使其成为感受态细胞，使大肠杆菌更容易吸收重组DNA分子
【详解】⑴利用逆转录法合成目的基因的过程是：以mRNA为模板，在逆转录酶的催化作用下合成单链DNA，然后在DNA聚合酶作用下，合成双链DNA分子；蛋白质工程合成目的基因的过程是：根据目标蛋白质的氨基酸序列，推测相应的mRNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测DNA中脱氧核苷酸的排列顺序，通过化学方法合成。⑵PCR过程中需要酶、底物、模板、引物和能量等条件。⑶目的基因和运载体结合，形成基因表达载体。⑷在利用大肠杆菌做受体细胞时，需要先用Ca2＋处理，使之成为感受态细胞，有利于其吸收重组DNA分子。
5．（2014·全国·高考真题）植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关，若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。
回答下列问题：
(1)理论上，基因组文库含有生物的 基因；而cDNA文库含有生物的 基因。
(2)若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中 出所需的耐旱基因。
(3)将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物 的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的
，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的 是否得到提高。
(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3:1时，则可推测该耐旱基因整合到了 （填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”）。
【答案】(1)全部 部分 (2)筛选 (3)乙 表达产物 耐旱性 (4)同源染色体的一条上
【详解】（1）基因文库包括基因组文库和cDNA文库，其中基因组文库包含生物基因组的所全部基因，cDNA文库是由mRNA通过逆转录产生的，其中只包一种生物的一部分文库，也叫部分基因文库。（2）若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，然后根据目的基因有的关信息从基因组文库中进行筛选。（3）由题意可知，要提高植物乙的耐旱性，需要将耐旱基因导入农杆菌，再利用农杆菌转化法将耐旱基因导入植物乙的体细胞中，而后对转化的体细胞进行筛选，将带有耐旱基因的体细胞进行组织培养，从而获得目的植株，为了检测耐旱基因是否成功表达应该用抗原-抗体杂交技术检测该基因的表达产物，也可进行个体生物学鉴定，即在田间进行耐旱实验并检测待测植株的耐旱性情况。（4）如耐旱基因整合到同源染色体的两条上，则相当于是纯合子，其自交产生的子代将全部表现耐旱，如果耐旱基因整合到同源染色体的一条上，则该个体相当于是杂合子，其基因型可以用AO表示，（A表示耐旱基因，O表示另一条染色体上没有相关基因），AO产生的配子有两种A和O，所以自交子代为AA∶AO∶OO＝1∶2∶1，即耐旱∶不耐旱=3∶1。
6．（2014·天津·高考真题）嗜热土壤芽孢杆菌产生的β—葡萄糖苷酶（BglB）是一种耐热纤维素酶，为使其在工业生产中更好地应用，开展了以下试验：
Ⅰ.利用大肠杆菌表达BglB酶
⑴PCR扩增bglB基因时，选用 基因组DNA作模板。
⑵下图为质粒限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒，扩增的bglB基因两端需分别引入 和 不同限制酶的识别序列。
⑶大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述构建好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为
。
Ⅱ．温度对BglB酶活性的影响
⑷据图1、2可知，80℃保温30分钟后，BglB酶会 ；为高效利用BglB酶降解纤维素，反应温度最好控制在 。
A．50℃ B．60℃ C．70℃ D．80℃
Ⅲ．利用分子育种技术提高BglB酶的热稳定性
在PCR扩增bglB基因的过程中，加入诱变剂可提高bglB基因的突变率，经过筛选，可获得能表达热稳定性高的BglB酶的基因。
⑸与用诱变剂直接处理嗜热土壤芽孢杆菌相比，上述育种技术获取热稳定性高的BglB酶基因的效率更高，其原因是在PCR过程中
A．仅针对bglB基因进行诱变
B．bglB基因产生了定向突变
C．bglB基因可快速积累突变
D．bglB基因突变不会导致酶的氨基酸数目改变
【答案】热土壤芽孢杆菌 Ndel BamHⅠ 转基因的大肠杆菌分泌出有活性的BglB酶 失活 B A、C
【详解】（1）由“嗜热土壤芽孢杆菌产生的β—葡萄糖苷酶（BglB）是一种耐热纤维素酶”可知bglB基因存在于嗜热土壤芽孢杆菌，因此可从嗜热土壤芽孢杆菌基因组文库中获取目的基因，然后采用PCR技术扩增bglB基因。（2）在基因表达载体的构建中，目的基因插入到启动子和终止子之间，启动子和终止子之间有Ndel、XbaⅠ、BamHⅠ三种限制酶识别和切割位点。据图可知，终止子的两端有XbaⅠ限制酶切割位点，因此不能使用XbaⅠ限制酶切割质粒，故只能用Ndel和BamHⅠ限制酶切割质粒。目的基因与质粒具有相同的黏性末端才可以连接形成重组质粒，所以目的基因两端需分别引入Ndel和BamHⅠ的识别序列。（3）转基因大肠杆菌能降解纤维素，说明转基因大肠杆菌中能分泌出有降解纤维素作用的BglB酶。（4）据图可知，在温度为80℃，酶失活；根据图1可知，温度在60℃和70℃时，酶活性基本相等；根据图2可知，温度为60℃时酶的相对活性比70℃时的高；因此为高效利用BglB酶降解纤维素，可控制反应温度在60℃。（5）基因突变具有随机性、不定向性等特点，故B错；bglB基因突变可能会导致氨基酸的数目发生改变，故B错；而利用分子育种技术可仅针对bglB基因进行诱变，同时利用PCR技术能大量获得bglB基因的突变基因；A、C正确。
7．（2014·上海·高考真题）回答下列有关遗传信息传递与表达的问题。
pIJ702是一种常用质粒（下图），其中tsr为刘链丝菌素（一种抗生素）抗性基因；mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落；而限制酶ClaI、BglⅡ、PstⅠ、SacⅠ、SphⅠ在PIJ702上分别只有一处识别序列。
（1）质粒DNA分子中的两条链靠 键维系成双链结构。
（2）以SacI和SphI切取的目的基因置换PIJ702上0.4kb（1kb=1000对碱基）的SacI/SphI片段，构成重组质粒pZHZ8.上述两种质粒的限制酶酶切片段长度列在上表中。因此判断目的基因内部是否含有BglⅡ切割位点，并说明判断依据
。
（3）已知PIJ702上含mel基因的ClaⅠ/PstⅠ区域长度为2.5kb，若用ClaⅠ和PstⅠ联合酶切pZHZ8，则参照表数据可断定酶切产物中最小片段的长度为 kb。
（4）不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素固体培养基上的生长状况如下表所示。若要筛选接纳了PIJ702或pZHZ8 的链霉菌细胞，所需的硫链丝菌素最小浓度应为 μg/mL （填写表格中给定浓度）；含有重组粒pZHZ8的菌落呈 色。
上述目的基因来源于原核生物，其蛋白编码序列（即编码从起始密码子到终止密码子之间的序列）经测定为1265对碱基，试判断对这段序列的测定是否存在错误： ，并说明依据
。
【答案】 氢 含有，据表4和题意，pIJ702上原有的一个BglⅡ位点被目的基因置换后，pZHZ8仍被BglⅡ切为线状，故目的基因中必然含有一个BglⅡ位点。 0.3 5 白 错误 因为原核生物决定每个氨基酸的碱基序列为三联密码，所以基因的编码碱基序列应为3的整数倍
【详解】（1）质粒中的DNA分子的两条链之间的化学键是碱基对之间的氢键。（2）据表4和题意，pIJ702上原有的一个BglⅡ位点被目的基因置换后，pZHZ8仍被BglⅡ切为线状，故目的基因中必然含有一个BglⅡ位点。（3）根据表格中数据可以判断重组质粒pZHZ8中含有两个ClaⅠ和PstⅠ的酶切位点，因为PIJ702上含mel基因的ClaⅠ/PstⅠ区域长度为2.5kb，而只用ClaⅠ切割后片段为2.2kb和4.5kb，而只用PstⅠ切割后片段长度为1.6kb和5.1kb，因此两种限制酶都用时，得到的最短片段为（2.5－2.2）=0.3（kb）。（4）从不含质粒的链霉菌在含硫链丝菌素固体培养基上的生长状况表格可以看出，硫链丝菌素浓度低于5μg/mL时，链霉菌能够生长，因此所需的硫链丝菌素最小浓度应为5μg/mL；mel是黑色素合成基因，其表达能使白色的链霉菌菌落变成黑色菌落，由于mel基因被替换后，链霉菌菌落不能变黑，而成为白色。（5）原核生物的编码区是连续的，由于决定每个氨基酸的碱基序列为三个相连的碱基，所以基因的编码碱基序列应为3的整数倍，而基因中1265对碱基转录成的mRNA含有从起始密码到终止密码有1265个碱基，不能被3整除，故测序肯定错误。
分步实验目标
简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y-M（图Ⅱ中融合片段M中有白色的箭头，代表方向）
①选择图Ⅱ引物 ；
②PCR目的产物约为 bp。
确保M及连接处序列正确，Y-M的连接处上游含有Hind III+EcR V的识别序列，下游含有EcR V+BamH I的识别序列
③质粒测序，图Ⅲ中正确的是 （选填序列编号）
检测融合蛋白定位
④对照质粒Y-GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y-M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光，而实验组荧光集中在纤毛基部，说明 。
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcRI
G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
PstI
CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnI
G↓GTACC
CCATG↑G
BamHI
G↓GATCC
CCTAG↑G
DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）
已知序列
PCR引物
①5′- AACTATGCGCTCATGA-3′
②5′- GCAATGCGTAGCCTCT-3′
③5′- AGAGGCTACGCATTGC-3′
④5′- TCATGAGCGCATAGTT-3′
缓冲液
50mml/LNa2HPO4-KH2PO4
50mml/LTris-HCl
50mml/LGly-NaOH
pH
6．0
6．5
7．0
7．5
7．5
8．0
8．5
9．0
9．0
9．5
10．0
10．5
酶相对活性%
25．4
40．2
49．8
63．2
70．1
95．5
99．5
85．3
68．1
63．7
41．5
20．8
限制酶
BamHⅠ
BclⅠ
Sau3AⅠ
HindⅢ
识别序
列及切
割位点