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2024春高中生物第3章基因工程章末总结课件（人教版选择性必修3）
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第3章 基因工程章末总结构建·知识网络基因工程基因工程归纳·专题小结1．三辨分辨限制酶的种类、识别序列和切割位点。选择限制酶时，不能破坏目的基因的结构。在切割目的基因和载体时，为了便于目的基因和载体连接，一般用同一种限制酶进行切割。但是为了防止目的基因与载体的自连接和随意连接，也可用不同的限制酶进行切割。2．三找找出标记基因、目的基因及目的基因插入位点。一般来说，质粒中至少要有一个标记基因，如抗生素抗性基因。明确目的基因的插入位点是在标记基因内部还是在标记基因之外。基因工程基本操作类试题解题技巧3．一析分析目的基因插入质粒后是否会破坏标记基因。如果质粒中仅有一个标记基因，则目的基因插入后不能破坏标记基因；如果质粒中有两个至多个标记基因，则至少应保留一个完整的标记基因。4．判断目的基因是否导入受体细胞的方法对细菌来说，一般用含有某种抗生素的培养基培养受体菌，如果质粒上有两种抗生素抗性基因，还需判断用哪一种抗生素来检测。 某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如下图所示，请回答下列问题。(1)将抗盐基因导入烟草细胞内，使烟草植株产生抗盐性状，这种新性状(变异性状)的来源属于__________。(2)如果将抗盐基因直接导入烟草细胞，一般情况下，烟草不会具有抗盐特性，原因是抗盐基因在烟草细胞中不能 __________，也不能____________。(3)在构建重组质粒时，应选用________和________两种酶对________和____________________进行切割，以保证重组 DNA 序列的唯一性。(4)基因工程中的检测筛选是一个重要的步骤。为筛选出导入了重组质粒的农杆菌，下图表示运用影印培养法(使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法)检测基因表达载体是否导入了农杆菌。除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基 A 和培养基 B 分别还含有__________、________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是________菌落中的细菌。为了确定抗盐烟草是否培育成功，既要用______技术作探针进行分子杂交检测，又要用_____________________ _______的方法从个体水平鉴定烟草植株的耐盐性。(5)将转入抗盐基因的烟草细胞培育成完整的植株需要用__________技术， 愈伤组织经__________进而形成完整植株，此过程除营养物质外还必须向培养基中添加________。【答案】(1)基因重组(2)复制 表达(合成抗盐基因的 mRNA)(3)SalⅠ HindⅢ 质粒 含抗盐基因的 DNA(4)氨苄青霉素 四环素 4和6 PCR 一定浓度的盐水浇灌烟草植株(将烟草植株移栽到盐碱地中)(5)植物组织培养 细胞增殖和分化(再分化) 植物激素(生长素和细胞分裂素)【解析】(1)基因工程的原理是基因重组。(2)将抗盐基因直接导入烟草细胞，一般情况下，烟草不会具有抗盐特性，原因是抗盐基因在烟草细胞中不能复制，也不能表达，即不能转录和翻译成相应的蛋白质。(3)用SalⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶对质粒和抗盐基因进行切割时，可保证重组DNA序列的唯一性，并且不会破坏抗盐基因。(4)用SalⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶对质粒进行切割时，会破坏抗四环素基因，但不会破坏抗氨苄青霉素基因，因此导入重组质粒的农杆菌能在含有氨苄青霉素的培养基上能生存，但不能在含有四环素的培养基上生存，所以培养基A和培养基B分别还含有氨苄青霉素、四环素，含目的基因的是4和6菌落中的细菌。可以用PCR技术检测目的基因是否插入了烟草细胞染色体的DNA上。除了从分子水平上进行检测，还可以从个体水平上进行检测，即用一定浓度的盐水浇灌烟草植株来检测烟草的耐盐性。(5)将转入抗盐基因的烟草细胞培育成完整的植株需要用植物组织培养技术，愈伤组织经再分化进而形成完整植株，此过程除营养物质外还必须向培养基中添加相应的植物激素。1．构建基因表达载体不可缺少的工具酶是限制酶和DNA连接酶。2．选择何种限制酶取决于目的基因内部是否含有限制酶的识别序列，以及目的基因两端和载体上的限制酶的识别序列和切割位点。解决此类问题时要遵循以下原则：①目的基因内部含有某种限制酶的识别序列，不能选用此种限制酶；②要在目的基因的两端和载体上切出相同的黏性末端或平末端，以保证目的基因与载体的连接；③至少保证载体上有一个标记基因不被破坏，以便筛选；④要确保目的基因能插入载体的启动子与终止子之间。基因表达载体的构建与限制酶切割片段的判断3．E.coli DNA连接酶只能连接双链DNA的黏性末端，而T4 DNA 连接酶既可连接双链DNA的黏性末端，又可连接平末端。因此，在构建基因表达载体时要根据限制酶切割的结果来加以选择。4．限制酶切割DNA或载体后产生的片段数或片段长度：解答此类问题，首先要认真、仔细审题，明确每一种限制酶的切割位点，确定不同限制酶切割位点间的距离，然后再得出结论。 2015年，屠呦呦因发现青蒿素而获得诺贝尔生理学或医学奖。工业上一般从黄花蒿植株中提取青蒿素，产量低，价格高。基因工程及细胞工程等为培育出高青蒿素含量的黄花蒿提供了思路。科学家用紫外线处理大量黄花蒿幼苗后，偶然发现一株高产植株。通过基因测序发现与该高产植株控制青蒿素合成的一种关键酶的基因发生了突变。(1)提取了高产植株的全部DNA后，要想快速大量获得该突变基因可以采用PCR技术，该技术的原理是____________________。(2)将获得的突变基因导入普通黄花蒿之前，先构建基因表达载体，图1、2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题。用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ限制酶切割，原因是_____________________________________，为了便于目的基因与载体的连接，可以选用_____________限制酶进行切割；为了防止目的基因与载体的自连接和随意连接，可以选用_____________________________________两种限制酶进行切割。构建好的重组质粒在其目的基因前要加上特殊的启动子，启动子是____________识别并结合的位点。(3)检测目的基因是否表达出相应蛋白质，应采取__________技术。【答案】(1)DNA半保留复制(2)SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因及外源DNA中的目的基因 EcoRⅠ EcoRⅠ限制酶和BamHⅠ限制酶(或EcoRⅠ限制酶和HindⅢ限制酶，BamHⅠ限制酶和HindⅢ限制酶) RNA聚合酶(3)抗原－抗体杂交【解析】(1)PCR技术扩增目的基因的原理为DNA半保留复制，是一项体外扩增DNA的技术。(2)分析图2可知，目的基因和抗生素抗性基因中含有SmaⅠ限制酶的切割位点，因此若用SmaⅠ切割图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因及外源DNA中的目的基因。目的基因的两端和载体上都有EcoRⅠ限制酶的识别序列，为了便于目的基因和载体的连接，可以用EcoRⅠ限制酶进行切割；目的基因两端和载体上还有BamHⅠ限制酶和Hind Ⅲ限制酶的识别序列，为了防止目的基因和载体的自连接和随意连接，可以用EcoRⅠ限制酶和BamHⅠ限制酶，或EcoRⅠ限制酶和Hind Ⅲ限制酶，或BamHⅠ限制酶和Hind Ⅲ限制酶任一组合进行切割。构建好的重组质粒在其目的基因前要加上特殊的启动子，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点。(3)根据抗原与抗体能特异性并结合的特点，检测目的基因是否表达出相应蛋白质，应采取抗原—抗体杂交技术。与DNA有关的几种酶 为有效地控制疟疾的传播，研究人员对一种特异性地感染蚊子的真菌——平沙绿僵菌进行基因改造，让它产生一种更快地杀死携带疟原虫的蚊子的毒素。基因改造过程如图1。回答下列有关问题。(1)下列对于图1中基因工程操作有关的工具及目的对应正确的是________(多选)。(2)图2为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化。 图2中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是______________。其中有磷酸二酯键形成的过程是______________。(均填序号)图2 (3)在实验室内大量繁殖绿僵菌的过程中，保证培养条件无菌的操作有______(多选)。A．按营养所需配制培养基B．将配制好的培养基置于121 ℃、高压下15 minC．在超净工作台上接种D．使用灼烧后的接种环挑取绿僵菌的孢子(4)该基因工程中使用的平沙绿僵菌，天然具有灭蚊效果。图3为对照组、野生绿僵菌和转基因绿僵菌环境下蚊子的存活情况。研究者在导入毒素基因的同时，也转入了控制该基因表达的“开关”，使毒素基因只有在蚊子体内才能被激活。请从防治效果和安全性两方面对该控蚊策略进行评价： _____________________________________。【答案】(1)BCD (2)①④②③ ②④(3)BCD (4)防治效果：①转基因绿僵菌环境下，蚊子的存活率下降迅速，防治效果良好；②尽管转基因绿僵菌环境下蚊子的存活率下降迅速，但后期趋于平缓，接近于野生绿僵菌环境，防治效果不持久。安全性：①该毒素基因仅在蚊子体内表达，避免了对自然界中其他生物产生毒害，提高了安全性；②蚊子的数量大幅下降，可能对其他生物的生存造成影响【解析】(1)①表示用同一种限制酶切割毒素基因和质粒，除了获取毒素基因外，还用来获取与毒素基因具有相同黏性末端的质粒，A错误；①表示用限制酶切割毒素基因和质粒，再用DNA连接酶连接毒素基因和质粒，构建重组质粒，B正确；②表示利用农杆菌转化法将重组质粒导入受体细胞，C正确；③表示通过荧光检测，筛选出含有毒素基因的绿僵菌，D正确。故选BCD。(2)限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端，因此作用于①；DNA聚合酶用于DNA分子的复制，能在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来，因此作用于④；DNA连接酶能在具有相同碱基末端的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，因此作用于②；解旋酶能够将DNA分子的双螺旋解开，故作用于③；其中DNA连接酶和DNA聚合酶催化形成磷酸二酯键，而限制酶催化磷酸二酯键断裂，解旋酶作用于氢键。(3)配制好的培养基需要高压蒸汽灭菌，因此按营养所需配制培养基时，不需要无菌条件，A错误；配制好的培养基置于121 ℃、高压下15 min，必须保证无菌操作，B正确；在超净工作台上接种，必须保证无菌操作，C正确；使用灼烧后的接种环挑取绿僵菌的孢子，必须保证无菌操作，D正确。故选BCD。(4)在导入毒素基因的同时，也转入了控制该基因表达的“开关”，使毒素基因只有在蚊子体内才能被激活。结合图3的曲线图分析可知，从防治效果评价：①转基因绿僵菌环境下，蚊子的存活率下降迅速，防治效果良好；②尽管转基因绿僵菌环境下蚊子的存活率下降迅速，但后期趋于平缓，接近于野生绿僵菌环境，防治效果不持久。从安全性评价：①该毒素基因仅在蚊子体内表达，避免了对自然界中其他生物产生毒害，提高了安全性；②蚊子的数量大幅下降，可能对其他生物的生存造成影响。电泳图谱1．原理电泳是利用带电分子或离子所带电荷或分子量不同，在电场中移动距离(或速度)不同来达到分离分子或离子的方法，如等位基因A与 a，经限制酶切开后，由于相关片段分子量等差异，在电场中移动距离不同，从而使两种基因得以分离。2．实例对下面图1中1～4号个体进行基因检测，将含有该遗传病基因或正常基因的相关DNA片段各自用电泳法分离。正常基因显示一个条带，致病基因显示为另一个不同的条带，结果如下图2。请据图1、图2分析图1中5号及7号个体基因电泳条带应为何类？图1 图2 分析如下：(1)先据图1推得1～4号个体基因型，4号为aa，则1、2号均为Aa，3号为AA或Aa。(2)将1～4号个体基因型与图2的电泳图谱做对照发现只有c编号的个体基因电泳带特别，只有条带2，无条带1，则c所代表的个体中基因型为“纯合子”，即只含一种基因，由此推测c为图1中1～4号中的4号个体。进一步结合图1与图2可推知a、b、d所代表的个体既含A又含a(由此确定3号不可能为AA)。(3)由5、6号均正常，所生女儿7号为患者可推知，5号基因型为Aa，应含条带1、条带2；7号个体基因型为aa，其电泳条带应与c吻合。 (2021·河北卷)我国科学家利用栽培稻(H)与野生稻(D)为亲本，通过杂交育种方法并辅以分子检测技术，选育出了L12和L7两个水稻新品系。L12的12号染色体上带有D的染色体片段(含有耐缺氮基因TD)，L7的7号染色体上带有D的染色体片段(含有基因SD)，两个品系的其他染色体均来自H(图1)。H的12号和7号染色体相应片段上分别含有基因TH和SH。现将两个品系分别与H杂交，利用分子检测技术对实验一亲本及部分F2的TD/TH基因进行检测，对实验二亲本及部分F2的SD/SH基因进行检测，检测结果以带型表示(图2)。回答下列问题：(1)为建立水稻基因组数据库，科学家完成了水稻________条染色体的DNA测序。(2)实验一F2中基因型TDTD对应的是带型__________。理论上，F2中产生带型Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的个体数量比为____________。(3)实验二F2中产生带型α、β和γ的个体数量分别为12、120和108，表明F2群体的基因型比例偏离__________定律。进一步研究发现，F1的雌配子均正常，但部分花粉无活性。已知只有一种基因型的花粉异常，推测无活性的花粉带有__________(填“SD”或“SH”)基因。(4)以L7和L12为材料，选育同时带有来自D的7号和12号染色体片段的纯合品系X(图3)。主要实验步骤包括：①__________________；②对最终获得的所有植株进行分子检测，同时具有带型________的植株即为目的植株。(5)利用X和H杂交得到F1，若F1产生的无活性花粉所占比例与实验二结果相同，雌配子均有活性，则F2中与X基因型相同的个体所占比例为____________。【答案】(1)12 (2)Ⅲ 1∶2∶1 (3)基因分离 SD (4)①将L7和L12杂交，获得F1后自交 ②α和Ⅲ (5)1/80【解析】分析题意和条带可知，L12的12号染色体上含有耐缺氮基因TD，其基因型为TDTD；L7的7号染色体上含有基因SD，基因型为SDSD；H的12号染色体上的基因为TH，7号染色体上的基因为SH，基因型为SHSHTHTH；TD与TH，SD与SH的遗传遵循基因分离和自由组合定律。(1)水稻为雌雄同株的植物，没有性染色体和常染色体之分，分析题图可知，水稻含有12对同源染色体，即有24条染色体，故对水稻基因组测序，需要完成12条染色体的DNA测序。(2)实验一是将L12(基因型为TDTD)与H(基因型为THTH)杂交，F1的基因型为TDTH，F2的基因型分别为TDTD∶TDTH∶THTH＝1∶2∶1，其中TDTD对应的带型与亲本L12对应的条带相同，即条带Ⅲ，理论上，F2中产生带型Ⅰ∶Ⅱ∶Ⅲ的个体数量比为1∶2∶1。(3)实验二是将L7(基因型为SDSD)与H(基因型为SHSH)杂交，F1的基因型为SDSH，理论上F2的基因型分别为SDSD∶SDSH∶SHSH＝1∶2∶1，其中SDSD对应的是带型与亲本L7对应的条带相同，即条带α，SDSH对应条带为β，SHSH对应条带为γ，理论上，F2中产生带型Ⅰ∶Ⅱ∶Ⅲ的个体数量比为1∶2∶1。实际上F2中产生带型α、β、γ的个体数量分别为12、120和108，表明F2群体的基因型比例偏离分离定律；进一步研究发现，F1的雌配子均正常，但部分花粉无活性；已知只有一种基因型的花粉异常，而带型α，即SDSD的个体数量很少，可推测无活性的花粉带有SD基因。(4)已知TD与TH，SD与SH两对基因分别位于7号和12号染色体上，两对等位基因遵循自由组合定律，以L7和L12为材料，选育同时带有来自D的7号和12号染色体片段的纯合品系X，基因型为SDSDTDTD；同时考虑两对等位基因，可知L7的基因型为SDSDTHTH，L12的基因型为SHSHTDTD，①将L7和L12杂交，获得F1(SDSHTDTH)后自交，②对最终获得的所有植株进行分子检测，同时具有带型α和Ⅲ的植株即为目的植株。(5)实验二中SDSD∶SDSH∶SHSH＝12∶120∶108＝1∶10∶9，可知花粉中SD∶SH＝1∶9，利用X(基因型为SDSDTDTD)和H(基因型为SHSHTHTH)杂交得到F1，基因型为SDSHTDTH，若F1产生的SD花粉无活性，所占比例与实验二结果相同，即雄配子类型及比例为SDTD∶SDTH∶SHTD∶SHTH＝1∶1∶9∶9，雌配子均有活性，类型及比例为SDTD∶SDTH∶SHTD∶SHTH＝1∶1∶1∶1，则F2中基因型为SDSDTDTD的个体所占比例为1/4×1/20＝1/80。典练·素养提升素养解读：本章主要内容是基因工程，通过学习基因工程，认识重组DNA技术的各种基本工具的特点，探究基因工程的基本操作程序，了解基因工程在农牧业、食品和医药卫生方面的应用和蛋白质工程的作用原理。常涉及的核心素养有生命观念(通过阐述DNA重组技术所需的三种工具的作用，建立结构与功能观)、科学思维和科学探究(能结合转基因抗虫棉的培育概述基因工程操作的基本操作程序，尝试设计探究某一转基因生物的研制过程；阐述蛋白质工程的原理和过程等)、社会责任(关注基因工程在农牧业、食品和医药卫生等行业的应用改善了人类生活品质等问题，关注蛋白质工程的应用，倡导理性客观的科学态度，做科学文化知识的传播者和践行者)。1．(生命观念)下列有关基因工程的叙述，正确的是 ( )A．E.coli DNA连接酶既能连接平末端，又能连接黏性末端B．限制性内切核酸酶既能识别、切割DNA，又能识别、切割RNAC．载体上的标记基因有利于筛选含重组DNA的细胞D．细菌的质粒、棉花的核DNA、动植物病毒都可作为基因工程中的载体【答案】C【解析】E.coli DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，A错误；限制性内切核酸酶不能识别、切割RNA，B错误；载体上的标记基因有利于筛选含重组DNA的细胞，C正确；棉花的核DNA位于细胞核内的染色体上，不能作为基因工程的载体，D错误。2．(科学思维、科学探究)下图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图(ampr为抗氨苄青霉素基因)，其中①④表示相关的操作步骤，甲、乙表示相关结构或细胞。请据图作答(题中四种限制酶切割产生的末端不相同)：(1)在构建基因表达载体时，可用一种或多种限制酶进行切割，为了避免目的基因和载体在酶切后发生任意连接，在此实验中应该选用__________分别对含鱼抗冻蛋白基因的DNA片段和质粒进行切割，含目的基因的DNA片段和质粒被切割后产生的DNA片段分别有________、________个。(2)基因工程的核心步骤是________(填序号)，该步骤的目的是_____________________________________。为了使目的基因正常表达，其首端必须有启动子，它是________识别和结合的部位。若限制酶切出了平末端，要选择__________(填“E．coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)进行连接。(3)图中将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞的方法一般为__________。该方法用到的Ti质粒中含有________，可以将目的基因转移到受体细胞并整合到受体细胞的染色体上。(4)检测番茄植株细胞中鱼抗冻蛋白基因是否成功表达，分子水平上常采用的方法是____________________。【答案】(1)PstⅠ、SmaⅠ 4 2(2)① 使目的基因稳定存在并能遗传下去，使目的基因能够表达及发挥作用 RNA聚合酶 T4 DNA连接酶(3)农杆菌转化法 T－DNA (4)抗原－抗体杂交【解析】在构建基因表达载体时，如果目的基因和载体用同一种限制酶切割，获得的末端相同，可能会发生自连现象。为避免目的基因和载体在酶切后发生任意连接，应选用两种不同的限制酶切割，分析图中4种酶的切割位点可知，应选用PstⅠ和SmaⅠ对含鱼抗冻蛋白基因的DNA片段、质粒进行切割，含目的基因的DNA片段被切割后产生4个DNA片段，质粒被切割后产生2个DNA片段。(2)基因工程的核心步骤是①(基因表达载体的构建)，该步骤的目的是使目的基因稳定存在并能遗传下去，使目的基因能够表达及发挥作用。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。若限制酶切出了平末端，应选择T4 DNA连接酶进行连接。(3)图中将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞的方法一般为农杆菌转化法。该方法用到的Ti质粒中含有T－DNA，可以将目的基因转移到受体细胞并整合到受体细胞的染色体上。(4)检测番茄植株细胞中鱼抗冻蛋白基因是否成功表达，分子水平上常采用的方法是抗原－抗体杂交。3．(科学探究)人体内的t-PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，但给心梗患者注射大剂量基因工程t-PA蛋白会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低其出血副作用。对天然t-PA基因进行改造，并使其在大肠杆菌细胞内表达，可制造出改良t-PA蛋白。如图表示相关的目的基因、载体及限制酶。pCLY 11为质粒，新霉素为抗生素。(1)制造出性能优异的改良t-PA蛋白的过程属于__________工程，是通过__________基因来实现的。(2)据图分析，应选择__________酶切开pCLY 11，才能使其与t-PA改良基因高效连接；neor基因的作用是________________________。(3)将重组质粒导入大肠杆菌时，一般先用________处理大肠杆菌，目的是________________。(4)筛选和鉴定含有重组质粒的受体细胞，需要在培养液中添加__________，选择有新霉素抗性的大肠杆菌，同时还可以根据mlacZ基因的表达情况，选择______色的大肠杆菌。【答案】(1)蛋白质 改造或合成相关(2)XmaⅠ和BglⅡ 筛选成功导入重组pCLY11的细菌 (3)Ca2+ 使大肠杆菌处于容易吸收外源DNA的状态 (4)新霉素 白【解析】(1) 对天然t-PA基因进行改造，并使其在大肠杆菌细胞内表达，可制造出改良t-PA蛋白， 要达到上述目的，需要先对天然的t-PA基因进行改造，再采取传统的基因工程方法表达该突变基因，可制造出性能优异的t-PA突变蛋白，这属于蛋白质工程技术。(2)由于目的基因的两端的碱基序列分别是CCGG、CTAG, 所以应用XmaⅠ和Bgl Ⅱ两种限制酶切开质粒pCLY 11，才能实现目的基因和质粒的高效连接，重组质粒中neor基因的作用是作为标记基因，根据标记基因的作用实现对成功导入重组pCLY11的细菌进行筛选。(3)将重组质粒导入大肠杆菌时，一般先用Ca2+处理大肠杆菌，其目的是使大肠杆菌处于容易吸收外源DNA的状态，提高转化效率。(4)筛选和鉴定含有重组质粒的受体细胞，需要在培养液中添加新霉素，因为pCLY 11质粒中含有新霉素抗性基因，能在其上生长的是具有新霉素抗性的大肠杆菌，对于有新霉素抗性的大肠杆菌，同时还可以根据mlacZ基因的表达情况，选择白色菌落的大肠杆菌，这是因为在构建基因表达载体时破坏了mlacZ，导致表达产物使细胞呈白色，即在加入新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞并非都是目的菌株，需选择呈白色的菌落，进一步培养、 检测和鉴定。4．(科学探究、社会责任)糖尿病是危害人类健康的严重疾病之一，注射胰岛素是目前治疗糖尿病最为有效的途径和手段，如何生产优质而不昂贵的人胰岛素，是当下医疗界和制药界急需攻克的科学难题。下图为利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请回答：(1)在基因表达载体中，__________的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，并驱动基因转录出mRNA。(2)图中细胞1是________细胞。过程②必需的酶是__________。过程③④⑤为______________技术扩增目的基因，此过程必需的酶是______________。在体外进行PCR操作时，实现过程③的处理方法是______________。能否利用人的皮肤细胞来完成过程①？为什么？_____________________________________。(3)图中B的基本组成单位有____种；为便于重组DNA的鉴定和选择，图中C的组成必须有________；将体外重组DNA导入大肠杆菌体内，并使其在细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。为使过程⑧更易进行，可用______________处理大肠杆菌，目的是使大肠杆菌细胞处于能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态(即感受态)。由于重组DNA分子成功导入受体细胞的效率低，所以在转化后通常需要进行________操作。(4)若过程⑨发生了变异，则此变异为________________。过程⑩得到的人胰岛素需要经体外加工才具有生物活性，原因是大肠杆菌____________________________。(5)目的基因在受体细胞中是否能转录出mRNA，可用____________等技术来检测。【答案】(1)启动子(2)胰岛B 逆转录酶 PCR 耐高温的DNA聚合酶 加热变性 不能，皮肤细胞中的胰岛素基因未表达，不能形成胰岛素mRNA(3)4 标记基因 Ca2+(或CaCl2) 筛选(4)基因突变 没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行加工(5)PCR【解析】(1)基因表达载体中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。(2)图中细胞1产生了胰岛素mRNA，为胰岛B细胞；②为逆转录过程，需要逆转录酶的催化；③④⑤表示利用PCR技术扩增目的基因的过程，需要耐高温的DNA聚合酶的参与，其中过程③表示解旋，该过程的处理方法是加热变性。皮肤细胞中的胰岛素基因未表达，不能形成胰岛素mRNA，因此不能利用人的皮肤细胞来完成过程①。(3)图中B表示质粒，化学本质是DNA，是由4种脱氧核苷酸组成的；C是重组质粒，其含有的标记基因可以用于重组DNA的鉴定和选择；过程⑧表示将目的基因导入受体细胞的过程，一般要用钙离子处理大肠杆菌，使大肠杆菌处于感受态，便于重组质粒的导入；由于重组DNA分子成功导入受体细胞的效率低，所以在转化后通常需要进行筛选操作。(4)过程⑨表示目的基因在原核生物体内扩增的过程，只能发生基因突变；由于大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行加工，因此过程⑩得到的人胰岛素需要经过体外加工才具有生物活性。(5)目的基因在受体细胞中是否能转录形成mRNA，可用PCR等技术来检测。
第3章 基因工程章末总结构建·知识网络基因工程基因工程归纳·专题小结1．三辨分辨限制酶的种类、识别序列和切割位点。选择限制酶时，不能破坏目的基因的结构。在切割目的基因和载体时，为了便于目的基因和载体连接，一般用同一种限制酶进行切割。但是为了防止目的基因与载体的自连接和随意连接，也可用不同的限制酶进行切割。2．三找找出标记基因、目的基因及目的基因插入位点。一般来说，质粒中至少要有一个标记基因，如抗生素抗性基因。明确目的基因的插入位点是在标记基因内部还是在标记基因之外。基因工程基本操作类试题解题技巧3．一析分析目的基因插入质粒后是否会破坏标记基因。如果质粒中仅有一个标记基因，则目的基因插入后不能破坏标记基因；如果质粒中有两个至多个标记基因，则至少应保留一个完整的标记基因。4．判断目的基因是否导入受体细胞的方法对细菌来说，一般用含有某种抗生素的培养基培养受体菌，如果质粒上有两种抗生素抗性基因，还需判断用哪一种抗生素来检测。 某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如下图所示，请回答下列问题。(1)将抗盐基因导入烟草细胞内，使烟草植株产生抗盐性状，这种新性状(变异性状)的来源属于__________。(2)如果将抗盐基因直接导入烟草细胞，一般情况下，烟草不会具有抗盐特性，原因是抗盐基因在烟草细胞中不能 __________，也不能____________。(3)在构建重组质粒时，应选用________和________两种酶对________和____________________进行切割，以保证重组 DNA 序列的唯一性。(4)基因工程中的检测筛选是一个重要的步骤。为筛选出导入了重组质粒的农杆菌，下图表示运用影印培养法(使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法)检测基因表达载体是否导入了农杆菌。除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，培养基 A 和培养基 B 分别还含有__________、________。从检测筛选的结果分析，含有目的基因的是________菌落中的细菌。为了确定抗盐烟草是否培育成功，既要用______技术作探针进行分子杂交检测，又要用_____________________ _______的方法从个体水平鉴定烟草植株的耐盐性。(5)将转入抗盐基因的烟草细胞培育成完整的植株需要用__________技术， 愈伤组织经__________进而形成完整植株，此过程除营养物质外还必须向培养基中添加________。【答案】(1)基因重组(2)复制 表达(合成抗盐基因的 mRNA)(3)SalⅠ HindⅢ 质粒 含抗盐基因的 DNA(4)氨苄青霉素 四环素 4和6 PCR 一定浓度的盐水浇灌烟草植株(将烟草植株移栽到盐碱地中)(5)植物组织培养 细胞增殖和分化(再分化) 植物激素(生长素和细胞分裂素)【解析】(1)基因工程的原理是基因重组。(2)将抗盐基因直接导入烟草细胞，一般情况下，烟草不会具有抗盐特性，原因是抗盐基因在烟草细胞中不能复制，也不能表达，即不能转录和翻译成相应的蛋白质。(3)用SalⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶对质粒和抗盐基因进行切割时，可保证重组DNA序列的唯一性，并且不会破坏抗盐基因。(4)用SalⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶对质粒进行切割时，会破坏抗四环素基因，但不会破坏抗氨苄青霉素基因，因此导入重组质粒的农杆菌能在含有氨苄青霉素的培养基上能生存，但不能在含有四环素的培养基上生存，所以培养基A和培养基B分别还含有氨苄青霉素、四环素，含目的基因的是4和6菌落中的细菌。可以用PCR技术检测目的基因是否插入了烟草细胞染色体的DNA上。除了从分子水平上进行检测，还可以从个体水平上进行检测，即用一定浓度的盐水浇灌烟草植株来检测烟草的耐盐性。(5)将转入抗盐基因的烟草细胞培育成完整的植株需要用植物组织培养技术，愈伤组织经再分化进而形成完整植株，此过程除营养物质外还必须向培养基中添加相应的植物激素。1．构建基因表达载体不可缺少的工具酶是限制酶和DNA连接酶。2．选择何种限制酶取决于目的基因内部是否含有限制酶的识别序列，以及目的基因两端和载体上的限制酶的识别序列和切割位点。解决此类问题时要遵循以下原则：①目的基因内部含有某种限制酶的识别序列，不能选用此种限制酶；②要在目的基因的两端和载体上切出相同的黏性末端或平末端，以保证目的基因与载体的连接；③至少保证载体上有一个标记基因不被破坏，以便筛选；④要确保目的基因能插入载体的启动子与终止子之间。基因表达载体的构建与限制酶切割片段的判断3．E.coli DNA连接酶只能连接双链DNA的黏性末端，而T4 DNA 连接酶既可连接双链DNA的黏性末端，又可连接平末端。因此，在构建基因表达载体时要根据限制酶切割的结果来加以选择。4．限制酶切割DNA或载体后产生的片段数或片段长度：解答此类问题，首先要认真、仔细审题，明确每一种限制酶的切割位点，确定不同限制酶切割位点间的距离，然后再得出结论。 2015年，屠呦呦因发现青蒿素而获得诺贝尔生理学或医学奖。工业上一般从黄花蒿植株中提取青蒿素，产量低，价格高。基因工程及细胞工程等为培育出高青蒿素含量的黄花蒿提供了思路。科学家用紫外线处理大量黄花蒿幼苗后，偶然发现一株高产植株。通过基因测序发现与该高产植株控制青蒿素合成的一种关键酶的基因发生了突变。(1)提取了高产植株的全部DNA后，要想快速大量获得该突变基因可以采用PCR技术，该技术的原理是____________________。(2)将获得的突变基因导入普通黄花蒿之前，先构建基因表达载体，图1、2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题。用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ限制酶切割，原因是_____________________________________，为了便于目的基因与载体的连接，可以选用_____________限制酶进行切割；为了防止目的基因与载体的自连接和随意连接，可以选用_____________________________________两种限制酶进行切割。构建好的重组质粒在其目的基因前要加上特殊的启动子，启动子是____________识别并结合的位点。(3)检测目的基因是否表达出相应蛋白质，应采取__________技术。【答案】(1)DNA半保留复制(2)SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因及外源DNA中的目的基因 EcoRⅠ EcoRⅠ限制酶和BamHⅠ限制酶(或EcoRⅠ限制酶和HindⅢ限制酶，BamHⅠ限制酶和HindⅢ限制酶) RNA聚合酶(3)抗原－抗体杂交【解析】(1)PCR技术扩增目的基因的原理为DNA半保留复制，是一项体外扩增DNA的技术。(2)分析图2可知，目的基因和抗生素抗性基因中含有SmaⅠ限制酶的切割位点，因此若用SmaⅠ切割图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因及外源DNA中的目的基因。目的基因的两端和载体上都有EcoRⅠ限制酶的识别序列，为了便于目的基因和载体的连接，可以用EcoRⅠ限制酶进行切割；目的基因两端和载体上还有BamHⅠ限制酶和Hind Ⅲ限制酶的识别序列，为了防止目的基因和载体的自连接和随意连接，可以用EcoRⅠ限制酶和BamHⅠ限制酶，或EcoRⅠ限制酶和Hind Ⅲ限制酶，或BamHⅠ限制酶和Hind Ⅲ限制酶任一组合进行切割。构建好的重组质粒在其目的基因前要加上特殊的启动子，启动子是RNA聚合酶识别并结合的位点。(3)根据抗原与抗体能特异性并结合的特点，检测目的基因是否表达出相应蛋白质，应采取抗原—抗体杂交技术。与DNA有关的几种酶 为有效地控制疟疾的传播，研究人员对一种特异性地感染蚊子的真菌——平沙绿僵菌进行基因改造，让它产生一种更快地杀死携带疟原虫的蚊子的毒素。基因改造过程如图1。回答下列有关问题。(1)下列对于图1中基因工程操作有关的工具及目的对应正确的是________(多选)。(2)图2为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化。 图2中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是______________。其中有磷酸二酯键形成的过程是______________。(均填序号)图2 (3)在实验室内大量繁殖绿僵菌的过程中，保证培养条件无菌的操作有______(多选)。A．按营养所需配制培养基B．将配制好的培养基置于121 ℃、高压下15 minC．在超净工作台上接种D．使用灼烧后的接种环挑取绿僵菌的孢子(4)该基因工程中使用的平沙绿僵菌，天然具有灭蚊效果。图3为对照组、野生绿僵菌和转基因绿僵菌环境下蚊子的存活情况。研究者在导入毒素基因的同时，也转入了控制该基因表达的“开关”，使毒素基因只有在蚊子体内才能被激活。请从防治效果和安全性两方面对该控蚊策略进行评价： _____________________________________。【答案】(1)BCD (2)①④②③ ②④(3)BCD (4)防治效果：①转基因绿僵菌环境下，蚊子的存活率下降迅速，防治效果良好；②尽管转基因绿僵菌环境下蚊子的存活率下降迅速，但后期趋于平缓，接近于野生绿僵菌环境，防治效果不持久。安全性：①该毒素基因仅在蚊子体内表达，避免了对自然界中其他生物产生毒害，提高了安全性；②蚊子的数量大幅下降，可能对其他生物的生存造成影响【解析】(1)①表示用同一种限制酶切割毒素基因和质粒，除了获取毒素基因外，还用来获取与毒素基因具有相同黏性末端的质粒，A错误；①表示用限制酶切割毒素基因和质粒，再用DNA连接酶连接毒素基因和质粒，构建重组质粒，B正确；②表示利用农杆菌转化法将重组质粒导入受体细胞，C正确；③表示通过荧光检测，筛选出含有毒素基因的绿僵菌，D正确。故选BCD。(2)限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端，因此作用于①；DNA聚合酶用于DNA分子的复制，能在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来，因此作用于④；DNA连接酶能在具有相同碱基末端的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，因此作用于②；解旋酶能够将DNA分子的双螺旋解开，故作用于③；其中DNA连接酶和DNA聚合酶催化形成磷酸二酯键，而限制酶催化磷酸二酯键断裂，解旋酶作用于氢键。(3)配制好的培养基需要高压蒸汽灭菌，因此按营养所需配制培养基时，不需要无菌条件，A错误；配制好的培养基置于121 ℃、高压下15 min，必须保证无菌操作，B正确；在超净工作台上接种，必须保证无菌操作，C正确；使用灼烧后的接种环挑取绿僵菌的孢子，必须保证无菌操作，D正确。故选BCD。(4)在导入毒素基因的同时，也转入了控制该基因表达的“开关”，使毒素基因只有在蚊子体内才能被激活。结合图3的曲线图分析可知，从防治效果评价：①转基因绿僵菌环境下，蚊子的存活率下降迅速，防治效果良好；②尽管转基因绿僵菌环境下蚊子的存活率下降迅速，但后期趋于平缓，接近于野生绿僵菌环境，防治效果不持久。从安全性评价：①该毒素基因仅在蚊子体内表达，避免了对自然界中其他生物产生毒害，提高了安全性；②蚊子的数量大幅下降，可能对其他生物的生存造成影响。电泳图谱1．原理电泳是利用带电分子或离子所带电荷或分子量不同，在电场中移动距离(或速度)不同来达到分离分子或离子的方法，如等位基因A与 a，经限制酶切开后，由于相关片段分子量等差异，在电场中移动距离不同，从而使两种基因得以分离。2．实例对下面图1中1～4号个体进行基因检测，将含有该遗传病基因或正常基因的相关DNA片段各自用电泳法分离。正常基因显示一个条带，致病基因显示为另一个不同的条带，结果如下图2。请据图1、图2分析图1中5号及7号个体基因电泳条带应为何类？图1 图2 分析如下：(1)先据图1推得1～4号个体基因型，4号为aa，则1、2号均为Aa，3号为AA或Aa。(2)将1～4号个体基因型与图2的电泳图谱做对照发现只有c编号的个体基因电泳带特别，只有条带2，无条带1，则c所代表的个体中基因型为“纯合子”，即只含一种基因，由此推测c为图1中1～4号中的4号个体。进一步结合图1与图2可推知a、b、d所代表的个体既含A又含a(由此确定3号不可能为AA)。(3)由5、6号均正常，所生女儿7号为患者可推知，5号基因型为Aa，应含条带1、条带2；7号个体基因型为aa，其电泳条带应与c吻合。 (2021·河北卷)我国科学家利用栽培稻(H)与野生稻(D)为亲本，通过杂交育种方法并辅以分子检测技术，选育出了L12和L7两个水稻新品系。L12的12号染色体上带有D的染色体片段(含有耐缺氮基因TD)，L7的7号染色体上带有D的染色体片段(含有基因SD)，两个品系的其他染色体均来自H(图1)。H的12号和7号染色体相应片段上分别含有基因TH和SH。现将两个品系分别与H杂交，利用分子检测技术对实验一亲本及部分F2的TD/TH基因进行检测，对实验二亲本及部分F2的SD/SH基因进行检测，检测结果以带型表示(图2)。回答下列问题：(1)为建立水稻基因组数据库，科学家完成了水稻________条染色体的DNA测序。(2)实验一F2中基因型TDTD对应的是带型__________。理论上，F2中产生带型Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的个体数量比为____________。(3)实验二F2中产生带型α、β和γ的个体数量分别为12、120和108，表明F2群体的基因型比例偏离__________定律。进一步研究发现，F1的雌配子均正常，但部分花粉无活性。已知只有一种基因型的花粉异常，推测无活性的花粉带有__________(填“SD”或“SH”)基因。(4)以L7和L12为材料，选育同时带有来自D的7号和12号染色体片段的纯合品系X(图3)。主要实验步骤包括：①__________________；②对最终获得的所有植株进行分子检测，同时具有带型________的植株即为目的植株。(5)利用X和H杂交得到F1，若F1产生的无活性花粉所占比例与实验二结果相同，雌配子均有活性，则F2中与X基因型相同的个体所占比例为____________。【答案】(1)12 (2)Ⅲ 1∶2∶1 (3)基因分离 SD (4)①将L7和L12杂交，获得F1后自交 ②α和Ⅲ (5)1/80【解析】分析题意和条带可知，L12的12号染色体上含有耐缺氮基因TD，其基因型为TDTD；L7的7号染色体上含有基因SD，基因型为SDSD；H的12号染色体上的基因为TH，7号染色体上的基因为SH，基因型为SHSHTHTH；TD与TH，SD与SH的遗传遵循基因分离和自由组合定律。(1)水稻为雌雄同株的植物，没有性染色体和常染色体之分，分析题图可知，水稻含有12对同源染色体，即有24条染色体，故对水稻基因组测序，需要完成12条染色体的DNA测序。(2)实验一是将L12(基因型为TDTD)与H(基因型为THTH)杂交，F1的基因型为TDTH，F2的基因型分别为TDTD∶TDTH∶THTH＝1∶2∶1，其中TDTD对应的带型与亲本L12对应的条带相同，即条带Ⅲ，理论上，F2中产生带型Ⅰ∶Ⅱ∶Ⅲ的个体数量比为1∶2∶1。(3)实验二是将L7(基因型为SDSD)与H(基因型为SHSH)杂交，F1的基因型为SDSH，理论上F2的基因型分别为SDSD∶SDSH∶SHSH＝1∶2∶1，其中SDSD对应的是带型与亲本L7对应的条带相同，即条带α，SDSH对应条带为β，SHSH对应条带为γ，理论上，F2中产生带型Ⅰ∶Ⅱ∶Ⅲ的个体数量比为1∶2∶1。实际上F2中产生带型α、β、γ的个体数量分别为12、120和108，表明F2群体的基因型比例偏离分离定律；进一步研究发现，F1的雌配子均正常，但部分花粉无活性；已知只有一种基因型的花粉异常，而带型α，即SDSD的个体数量很少，可推测无活性的花粉带有SD基因。(4)已知TD与TH，SD与SH两对基因分别位于7号和12号染色体上，两对等位基因遵循自由组合定律，以L7和L12为材料，选育同时带有来自D的7号和12号染色体片段的纯合品系X，基因型为SDSDTDTD；同时考虑两对等位基因，可知L7的基因型为SDSDTHTH，L12的基因型为SHSHTDTD，①将L7和L12杂交，获得F1(SDSHTDTH)后自交，②对最终获得的所有植株进行分子检测，同时具有带型α和Ⅲ的植株即为目的植株。(5)实验二中SDSD∶SDSH∶SHSH＝12∶120∶108＝1∶10∶9，可知花粉中SD∶SH＝1∶9，利用X(基因型为SDSDTDTD)和H(基因型为SHSHTHTH)杂交得到F1，基因型为SDSHTDTH，若F1产生的SD花粉无活性，所占比例与实验二结果相同，即雄配子类型及比例为SDTD∶SDTH∶SHTD∶SHTH＝1∶1∶9∶9，雌配子均有活性，类型及比例为SDTD∶SDTH∶SHTD∶SHTH＝1∶1∶1∶1，则F2中基因型为SDSDTDTD的个体所占比例为1/4×1/20＝1/80。典练·素养提升素养解读：本章主要内容是基因工程，通过学习基因工程，认识重组DNA技术的各种基本工具的特点，探究基因工程的基本操作程序，了解基因工程在农牧业、食品和医药卫生方面的应用和蛋白质工程的作用原理。常涉及的核心素养有生命观念(通过阐述DNA重组技术所需的三种工具的作用，建立结构与功能观)、科学思维和科学探究(能结合转基因抗虫棉的培育概述基因工程操作的基本操作程序，尝试设计探究某一转基因生物的研制过程；阐述蛋白质工程的原理和过程等)、社会责任(关注基因工程在农牧业、食品和医药卫生等行业的应用改善了人类生活品质等问题，关注蛋白质工程的应用，倡导理性客观的科学态度，做科学文化知识的传播者和践行者)。1．(生命观念)下列有关基因工程的叙述，正确的是 ( )A．E.coli DNA连接酶既能连接平末端，又能连接黏性末端B．限制性内切核酸酶既能识别、切割DNA，又能识别、切割RNAC．载体上的标记基因有利于筛选含重组DNA的细胞D．细菌的质粒、棉花的核DNA、动植物病毒都可作为基因工程中的载体【答案】C【解析】E.coli DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，A错误；限制性内切核酸酶不能识别、切割RNA，B错误；载体上的标记基因有利于筛选含重组DNA的细胞，C正确；棉花的核DNA位于细胞核内的染色体上，不能作为基因工程的载体，D错误。2．(科学思维、科学探究)下图是转基因抗冻番茄培育过程的示意图(ampr为抗氨苄青霉素基因)，其中①④表示相关的操作步骤，甲、乙表示相关结构或细胞。请据图作答(题中四种限制酶切割产生的末端不相同)：(1)在构建基因表达载体时，可用一种或多种限制酶进行切割，为了避免目的基因和载体在酶切后发生任意连接，在此实验中应该选用__________分别对含鱼抗冻蛋白基因的DNA片段和质粒进行切割，含目的基因的DNA片段和质粒被切割后产生的DNA片段分别有________、________个。(2)基因工程的核心步骤是________(填序号)，该步骤的目的是_____________________________________。为了使目的基因正常表达，其首端必须有启动子，它是________识别和结合的部位。若限制酶切出了平末端，要选择__________(填“E．coli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)进行连接。(3)图中将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞的方法一般为__________。该方法用到的Ti质粒中含有________，可以将目的基因转移到受体细胞并整合到受体细胞的染色体上。(4)检测番茄植株细胞中鱼抗冻蛋白基因是否成功表达，分子水平上常采用的方法是____________________。【答案】(1)PstⅠ、SmaⅠ 4 2(2)① 使目的基因稳定存在并能遗传下去，使目的基因能够表达及发挥作用 RNA聚合酶 T4 DNA连接酶(3)农杆菌转化法 T－DNA (4)抗原－抗体杂交【解析】在构建基因表达载体时，如果目的基因和载体用同一种限制酶切割，获得的末端相同，可能会发生自连现象。为避免目的基因和载体在酶切后发生任意连接，应选用两种不同的限制酶切割，分析图中4种酶的切割位点可知，应选用PstⅠ和SmaⅠ对含鱼抗冻蛋白基因的DNA片段、质粒进行切割，含目的基因的DNA片段被切割后产生4个DNA片段，质粒被切割后产生2个DNA片段。(2)基因工程的核心步骤是①(基因表达载体的构建)，该步骤的目的是使目的基因稳定存在并能遗传下去，使目的基因能够表达及发挥作用。启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。若限制酶切出了平末端，应选择T4 DNA连接酶进行连接。(3)图中将鱼抗冻蛋白基因导入番茄细胞的方法一般为农杆菌转化法。该方法用到的Ti质粒中含有T－DNA，可以将目的基因转移到受体细胞并整合到受体细胞的染色体上。(4)检测番茄植株细胞中鱼抗冻蛋白基因是否成功表达，分子水平上常采用的方法是抗原－抗体杂交。3．(科学探究)人体内的t-PA蛋白能高效降解由纤维蛋白凝聚而成的血栓，但给心梗患者注射大剂量基因工程t-PA蛋白会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA蛋白第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低其出血副作用。对天然t-PA基因进行改造，并使其在大肠杆菌细胞内表达，可制造出改良t-PA蛋白。如图表示相关的目的基因、载体及限制酶。pCLY 11为质粒，新霉素为抗生素。(1)制造出性能优异的改良t-PA蛋白的过程属于__________工程，是通过__________基因来实现的。(2)据图分析，应选择__________酶切开pCLY 11，才能使其与t-PA改良基因高效连接；neor基因的作用是________________________。(3)将重组质粒导入大肠杆菌时，一般先用________处理大肠杆菌，目的是________________。(4)筛选和鉴定含有重组质粒的受体细胞，需要在培养液中添加__________，选择有新霉素抗性的大肠杆菌，同时还可以根据mlacZ基因的表达情况，选择______色的大肠杆菌。【答案】(1)蛋白质 改造或合成相关(2)XmaⅠ和BglⅡ 筛选成功导入重组pCLY11的细菌 (3)Ca2+ 使大肠杆菌处于容易吸收外源DNA的状态 (4)新霉素 白【解析】(1) 对天然t-PA基因进行改造，并使其在大肠杆菌细胞内表达，可制造出改良t-PA蛋白， 要达到上述目的，需要先对天然的t-PA基因进行改造，再采取传统的基因工程方法表达该突变基因，可制造出性能优异的t-PA突变蛋白，这属于蛋白质工程技术。(2)由于目的基因的两端的碱基序列分别是CCGG、CTAG, 所以应用XmaⅠ和Bgl Ⅱ两种限制酶切开质粒pCLY 11，才能实现目的基因和质粒的高效连接，重组质粒中neor基因的作用是作为标记基因，根据标记基因的作用实现对成功导入重组pCLY11的细菌进行筛选。(3)将重组质粒导入大肠杆菌时，一般先用Ca2+处理大肠杆菌，其目的是使大肠杆菌处于容易吸收外源DNA的状态，提高转化效率。(4)筛选和鉴定含有重组质粒的受体细胞，需要在培养液中添加新霉素，因为pCLY 11质粒中含有新霉素抗性基因，能在其上生长的是具有新霉素抗性的大肠杆菌，对于有新霉素抗性的大肠杆菌，同时还可以根据mlacZ基因的表达情况，选择白色菌落的大肠杆菌，这是因为在构建基因表达载体时破坏了mlacZ，导致表达产物使细胞呈白色，即在加入新霉素的培养基中形成菌落的受体细胞并非都是目的菌株，需选择呈白色的菌落，进一步培养、 检测和鉴定。4．(科学探究、社会责任)糖尿病是危害人类健康的严重疾病之一，注射胰岛素是目前治疗糖尿病最为有效的途径和手段，如何生产优质而不昂贵的人胰岛素，是当下医疗界和制药界急需攻克的科学难题。下图为利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请回答：(1)在基因表达载体中，__________的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，并驱动基因转录出mRNA。(2)图中细胞1是________细胞。过程②必需的酶是__________。过程③④⑤为______________技术扩增目的基因，此过程必需的酶是______________。在体外进行PCR操作时，实现过程③的处理方法是______________。能否利用人的皮肤细胞来完成过程①？为什么？_____________________________________。(3)图中B的基本组成单位有____种；为便于重组DNA的鉴定和选择，图中C的组成必须有________；将体外重组DNA导入大肠杆菌体内，并使其在细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。为使过程⑧更易进行，可用______________处理大肠杆菌，目的是使大肠杆菌细胞处于能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态(即感受态)。由于重组DNA分子成功导入受体细胞的效率低，所以在转化后通常需要进行________操作。(4)若过程⑨发生了变异，则此变异为________________。过程⑩得到的人胰岛素需要经体外加工才具有生物活性，原因是大肠杆菌____________________________。(5)目的基因在受体细胞中是否能转录出mRNA，可用____________等技术来检测。【答案】(1)启动子(2)胰岛B 逆转录酶 PCR 耐高温的DNA聚合酶 加热变性 不能，皮肤细胞中的胰岛素基因未表达，不能形成胰岛素mRNA(3)4 标记基因 Ca2+(或CaCl2) 筛选(4)基因突变 没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行加工(5)PCR【解析】(1)基因表达载体中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。(2)图中细胞1产生了胰岛素mRNA，为胰岛B细胞；②为逆转录过程，需要逆转录酶的催化；③④⑤表示利用PCR技术扩增目的基因的过程，需要耐高温的DNA聚合酶的参与，其中过程③表示解旋，该过程的处理方法是加热变性。皮肤细胞中的胰岛素基因未表达，不能形成胰岛素mRNA，因此不能利用人的皮肤细胞来完成过程①。(3)图中B表示质粒，化学本质是DNA，是由4种脱氧核苷酸组成的；C是重组质粒，其含有的标记基因可以用于重组DNA的鉴定和选择；过程⑧表示将目的基因导入受体细胞的过程，一般要用钙离子处理大肠杆菌，使大肠杆菌处于感受态，便于重组质粒的导入；由于重组DNA分子成功导入受体细胞的效率低，所以在转化后通常需要进行筛选操作。(4)过程⑨表示目的基因在原核生物体内扩增的过程，只能发生基因突变；由于大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行加工，因此过程⑩得到的人胰岛素需要经过体外加工才具有生物活性。(5)目的基因在受体细胞中是否能转录形成mRNA，可用PCR等技术来检测。
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