备战2025届新高考生物一轮总复习第10单元生物技术与工程专题精研课13PCR技术中引物的拓展应用课件

这是一份备战2025届新高考生物一轮总复习第10单元生物技术与工程专题精研课13PCR技术中引物的拓展应用课件，共26页。PPT课件主要包含了逆转录酶等内容，欢迎下载使用。

应用1:(实时)荧光定量PCR(RT-PCR)——以“新冠病毒核酸检测”为例(1)RT-PCRRT-PCR是将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术。首先经逆转录酶的作用,由RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,在DNA聚合酶的作用下扩增合成目的片段。
(2)实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累,实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
先从样本中提取RNA,RNA中可能有新冠病毒的RNA,同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生物的RNA。通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA,并进行PCR扩增,在PCR反应体系中,包含一对特异性引物以及一个Taqman探针,该探针为一段特异性寡核苷酸序列,两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;若反应体系存在靶序列,PCR反应时探针与模板结合,DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解,报告基团与淬灭基团分离,发出荧光。每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸浓度有关,病毒核酸浓度越高,Ct值越小(如图)。
(3)实时荧光定量PCR方法检测新冠病毒核酸从样本中提取病毒RNA,经逆转录酶作用形成cDNA。然后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增,测定样品中病毒核酸量。
在通过实时荧光定量PCR检测新冠病毒感染时,检测到的荧光强度变化如图所示。与指数增长期相比,线性增长期目的基因数量的增长率下降,可能原因有底物浓度下降、酶活性下降等。Ct值的含义是指在PCR扩增过程中,每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。当样本中初始模板越多时,Ct值就越小。Ct值≤37判定为阳性,Ct值>40或无Ct值判定为阴性。上图所示新冠病毒核酸检测结果应判定为阳性。
应用2:PCR定点突变技术该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点,而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此,分别利用引物1和2,引物3和4进行PCR后,得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起,再在DNA聚合酶的作用下延伸,就能成为一条完整的DNA片段。最后,用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。
1. (2023·江苏扬州质检)实时荧光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测,其原理是:在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合,探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发出的淬灭基团,新链延伸过程中,DNA聚合酶会破坏探针,导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光。利用RT-PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。
下列说法错误的是(　　)A.做RT-PCR之前,需要先根据cDNA的核苷酸序列合成引物和探针B.RNA不能作为PCR扩增的模板,故需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增C.若检测结果有强烈荧光信号发出,说明被检测者没有感染病毒D.病毒的检测还可以检测病毒表面的物质或病毒引发产生的抗体,其原理都是抗原—抗体杂交
解析 PCR扩增必须以DNA为模板,RNA不能作为PCR扩增的模板,所以需要将样本中的RNA逆转录为DNA后再进行扩增,B项正确;若检测结果有强烈荧光信号发出,说明被检测者极有可能感染了病毒,C项错误。
2.(2023·山东烟台联考)荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量。其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某模板链互补的荧光探针,荧光探针两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团,探针完整时,发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,荧光监测系统接收不到荧光信号。当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处,会水解探针,使荧光监测系统接收到荧光信号。即每扩增一次,就有一个荧光分子生成(如图所示)。
下列相关叙述正确的是(　　)A.扩增过程中引物先于探针结合到模板DNA上B.在PCR系统中需加入解旋酶C.荧光信号积累越多,说明PCR循环次数越多D.若扩增n次,则其需要消耗2n-1个探针
解析 基因扩增过程中需要特定的引物,该引物的作用是定位基因的位置,与模板链结合并为子链的延伸提供起点,扩增过程中引物和探针应同时结合到模板DNA上,A项错误;在PCR反应系统中无需加入解旋酶,可通过高温解旋DNA,B项错误;据题干信息“即每扩增一次,就有一个荧光分子生成”可知,荧光信号积累越多,说明PCR循环次数越多,C项正确;据题干信息“在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某模板链互补的荧光探针”,即每个DNA分子需要1个探针,扩增n次,可得到2n个DNA分子,则共需要消耗2n-1个探针,D项错误。
3.(2023·江苏百校联考)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,经过多次PCR 扩增,获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA 片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景,下图表示利用重叠延伸PCR 技术扩增某目的基因的过程。
下列叙述正确的是(　　)A.引物中C+G 的含量越低,引物与模板DNA 结合的稳定性越高B.在第一阶段由于引物2和引物3发生碱基互补配对,因此两者置于不同反应系统中C.引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制后,共产生4种双链DNA 分子D.在引物1、2组成的反应系统中,经第一阶段要形成图示双链DNA,至少要经过3次复制
解析 C 与G之间有3个氢键,A 与T 之间有2个氢键,因此引物中G+C的含量越高,引物与模板DNA 结合的稳定性越高,A项错误;由图可知,引物2和引物3分别作用于同一段DNA 的两条链,二者会发生碱基互补配对,因此需将它们置于不同反应系统中,B项正确;引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制后,各产生2种双链DNA分子,由于引物1和引物4合成的DNA属于同一种DNA ,因此共产生了3种双链DNA 分子,C项错误;在引物1、2组成的反应系统中,经第一阶段要形成题图所示双链DNA ,至少要经过2次复制,D项错误。
1.(2023·河北石家庄模拟)如图是快速RT-PCR过程示意图,①和②为逆转录酶催化的逆转录过程,③是PCR过程。据图分析,下列叙述错误的是(　　)A.逆转录酶具有DNA聚合酶的能力B.③PCR过程只需要引物bC.RT-PCR可检测基因表达水平D.RT-PCR可检测新冠病毒等RNA病毒
解析 ③PCR过程需要引物a、b,因为后续的模板链序列既有与靶RNA一致的,也有与cDNA一致的,B项错误。
2.利用重叠延伸PCR技术进行定点突变,可以实现对纤维素酶基因的合理性改造,其过程如图所示。下列说法错误的是(　　)A.产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果B.引物c和引物b上均含有突变的碱基序列C.①过程需要先加热至90 ℃以上后再冷却至50 ℃左右D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变产物AD
解析 PCR技术中DNA单链延伸的方向是沿着引物的5'端向3'端延伸的,据此可分析,PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引物b扩增的结果,引物c和引物b分别与DNA的两条链互补,若引物c和引物b完全与模板互补,则引物c和引物b会发生互补,导致引物失效,故引物c和引物b上均含有与模板链不能互补的碱基,均应含有突变的碱基序列,A、B两项正确;①过程是双链DNA解聚为单链的过程,需加热至90 ℃以上完成变性,而后将温度下降到50 ℃左右复性,为子链的延伸做准备,②过程是子链延伸的过程,该过程需要利用AB上链和CD下链之间的互补配对来获得突变产物AD,C项正确,D项错误。
3.(2023·湖南雅礼中学调研)新冠病毒是一种单链RNA病毒,常用“荧光RT-PCR技术”进行检测,方法是取受检者的mRNA逆转录出cDNA,并大量扩增,用荧光标记的新冠病毒核酸探针来检测样品中新冠病毒的核酸含量。请回答下列问题。(1)“荧光RT-PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有　　　　　、　　　　 　、荧光标记的核酸探针、引物、dNTP、缓冲体系。 
耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)
(2)如果要同时扩增两种基因,则试剂盒中的引物应该有　　　　　种。图1为新冠病毒的ORFlab基因对应的cDNA片段结构示意图,则与之对应的引物结合的部位应该是图中的　　　(子链延伸方向为其自身的5'→3',用图中数字作答)。若已知该基因的一条引物,　　　　(填“能”或“不能”)依据其碱基序列设计出另一条引物,理由是　  　。
两种引物的碱基序列没有相关性
(3)在检测过程中,随着PCR的进行,反应产物不断积累,荧光信号的强度也随之增加。根据荧光强度的变化监测产物量的变化,得到一条荧光扩增曲线(如图2)。
①出现“平台期”最可能的原因是   　。 试剂盒中的原料、引物和探针数量一定,超出一定的循环数后,荧光分子不再增加②理论上,在检测过程中,有荧光信号出现,则说明检测结果呈　　　　(填“阴”或“阳”)性,但为了保证检测结果的准确性,一般要达到或超过阈值时才确诊。现有两个待检样本,检测时都出现了如图2所示的曲线,但甲的A点比乙的A点明显左移。请给这种结果作出科学合理的解释(试剂盒合格且正常,操作过程规范且准确):　   　。 
甲样本中的新冠病毒核酸含量更高,达到阈值所需的循环数更少
解析 (1)根据题目信息可知,荧光RT-PCR技术的基本原理是将新冠病毒RNA逆转录为cDNA,因此荧光RT-PCR技术所用的试剂盒中通常都应该含有逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶、引物、四种脱氧核苷酸、缓冲体系。(2)根据PCR的原理,在扩增DNA分子时每一条链均需与相应的引物结合才能进行扩增,因此如果要将两种基因分别扩增出来,则在试剂盒中的引物应该有4种;在利用PCR扩增DNA分子过程中,DNA聚合酶只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,又由于DNA的两条链是反向平行的,所以引物与DNA分子单链的3'端相结合即图示中的1和4所示部位。由于两段引物的碱基序列没有相关性,既不相同,也不互补,因此不能根据该基因一条引物的碱基序列设计出另一条引物。
(3)分析荧光扩增曲线图,图中曲线通过荧光强度变化反映产物量的变化,因此曲线中出现“平台期”最可能的原因是试剂盒中的原料和探针数量一定,超出一定的循环数后,荧光强度不再增加。理论上,在检测过程中,有荧光信号出现,则说明检测结果呈阳性,但为了保证检测结果的准确性,一般要达到或超过阈值时才确诊。检测结果甲的A点比乙的A点明显左移,说明甲样本中的新冠病毒核酸含量更高,达到阈值所需的循环数更少。