2025高考生物一轮复习素养提升练习选择性必修3第10单元生物技术与工程第7讲基因工程的基本操作程序和应用及蛋白质工程

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|情境试题 规范作答|
阅读下列材料，回答下列问题：
基因的魔剪——CRISPR/Cas系统
二倍体马铃薯存在自交不亲和的现象，导致无法使用种子种植马铃薯①。二倍体马铃薯的自交不亲和是由核糖核酸酶基因(S－RNase)控制的，科研人员通过基因编辑技术敲除了马铃薯的S－RNase基因，获得自交亲和的二倍体马铃薯②，为马铃薯杂交育种提供了新的技术。如图是科研人员用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点敲除S－RNase基因的示意图。
(1)用于编辑不同基因的CRISPR/Cas9复合物中向导RNA碱基序列不同，因此首先要确定S－RNase基因中的待编辑序列，可以通过PCR技术扩增S－RNase基因③，作为编码特定向导RNA的模板。扩增时需要根据S－RNase基因的脱氧核苷酸序列设计引物，引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
(2)CRISPR/Cas9系统能精准识别相关基因，依据的原理是向导RNA与目标DNA发生碱基互补配对；Cas9蛋白可催化磷酸二酯键(填化学键名称)水解，剪切特定DNA片段。
(3)欲检测经上述基因编辑技术得到的植株是否已具有自交亲和性状，最简便的方法是让该植株自交，观察能否产生种子。
【解题策略】
真|题|再|现
1．(2023·浙江卷)紫外线引发的DNA损伤，可通过“核苷酸切除修复(NER)”方式修复，机制如图所示。着色性干皮症(XP)患者的NER酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤出现炎症等症状。患者幼年发病，20岁后开始发展成皮肤癌。下列叙述错误的是( C )
A．修复过程需要限制酶和DNA聚合酶
B．填补缺口时，新链合成以5′到3′的方向进行
C．DNA有害损伤发生后，在细胞增殖后进行修复，对细胞最有利
D．随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释
解析： 由图可知，修复过程中需要将损伤部位的序列切断，因此需要限制酶的参与；同时修复过程中，单个的脱氧核苷酸需要依次连接，要借助DNA聚合酶，A正确；填补缺口时，新链即子链的延伸方向为5′到3′的方向进行，B正确；DNA有害损伤发生后，在细胞增殖中进行修复，保证DNA复制的正确进行，对细胞最有利，C错误；癌症的发生是多个基因累积突变的结果，随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释，D正确。故选C。
2．(2023·浙江卷)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3－GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是( B )
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3－GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
解析：分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合在Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GFP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3－GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；用引物1和引物3进行PCR扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好的区分片段，D错误。故选B。
3．(2023·山东卷)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)与图甲中启动子结合的酶是_RNA聚合酶__。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还需具备的结构有_限制酶切割位点、标记基因、复制原点等__(答出2个结构即可)。
(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物_F2与R1或F1与R2__。已知J基因转录的模板链位于b链，由此可知引物F1与图甲中J基因的_a链__(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了_J－V5融合蛋白__，条带2所检出的蛋白_不是__(填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
解析：(1)基因表达载体中启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因(如抗性基因)，以便于重组DNA分子的筛选；③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等。
(2)据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2与R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3′－5′，非模板链(也就是a链)是5′－3′；考虑到DNA复制的方向是子链的5′－3′，引物延伸的方向肯定是5′－3′，所以引物结合的单链其方向是3′－5′；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′－5′的b链，故其序列应该与a链相应部分的序列相同。
(3)据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J－V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出条带2，说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
4．(2023·广东卷)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。
回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DAI基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和运载体进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。
(3)转化后，T－DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图)，用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了DAI基因和卡那霉素抗性基因。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株自交(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
答案：(3)③
解析：(1)根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DAI基因为显性基因，因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。
(2)利用PCR技术扩增DAI基因后，应该用同种限制性内切核酸酶对DAI基因和运载体进行切割，再用DNA连接酶将两者连接起来；在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，因此为确保插入的DAI基因可以正常表达，其上下游序列需具备启动子和终止子。
(3)①根据题干信息和图形分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T－DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因)液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有卡那霉素抗性基因，即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。
②T1代阳性植株都含有DAI基因，由于T－DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点，所以不确定是单一位点插入还是多位点插入，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，其自交后代应该出现3∶1的性状分离比，而题干要求选出单一位点插入的植株，因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。
③将以上获得的T2代阳性植株自交，再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150 bp，野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，结合图中的数据分析可知电泳图中，野生型只有150 bp，突变型有50 bp和100 bp，如图：
5．(2021·辽宁卷)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因)，大小为0.9 kb(1 kb＝1 000碱基对)，利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
(1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经逆转录过程得到cDNA，将其作为PCR的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入EcRⅠ和PstⅡ两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用T4_DNA连接酶(填“E.cli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。
相关限制酶的识别序列及切割位点
注：箭头表示切割位点
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。
(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落(分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒，用(2)中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2，3号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2 kb的DNA分子条带未出现在图中
解析：(1)利用RNA获得cDNA的过程称为逆转录。
(2)根据启动子和终止子的作用可知，目的基因应导入启动子和终止子之间，从图中看出，两者之间存在三种限制酶切点，但是由于KpnⅠ在质粒上不止一个酶切位点，所以应该选择EcRⅠ和PstⅡ两种不同限制酶；根据PstⅡ的酶切序列可知，其酶切产物为平末端，所以构建基因表达载体时，应该用T4 DNA连接酶连接质粒和目的基因。
(3)转化时用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于感受态的生理状态，以提高转化效率。
(4)由于这些菌落都可以生长在含有氨苄青霉素的培养基中，因此都含有质粒，重组质粒包含了目的基因和质粒，如果用EcRⅠ和PstⅡ两种酶切割重组质粒，电泳后将获得含有质粒和目的基因两条条带，由于phb2基因大小为0.9 kb，所以对应电泳图中的菌落3。
6．(2022·山东卷)某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG－P和FLAG－P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P△的功能。
(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补配对。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端(填“3′端”或“5′端”)。
(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变。修改扩增P基因时使用的带有EcRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是在EcRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数。
(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG－P、FLAG－P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG－P和FLAG－P△不能降解UBC，由①②③组结果的差异推测，药物A的作用是促进UBC与FLAG－P的结合；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的特定序列的作用是P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。
(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是药物A促进UBC与FLAG－P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。
解析：(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补。DNA聚合酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3′端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添加在引物的5′端。
(2)融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图甲可看出，在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变。可通过在EcRⅠ识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变，能够正常翻译。
(3)①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG－P，出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG－P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是促进UBC与FLAG－P的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG－P，出现杂交带；④⑤组使用FLAG－P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列。
(4)根据(3)的分析推测，药物A促进UBC与蛋白P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcRⅠ
G↓AATTC
CTTAA↑G
PstⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
PstⅠ
CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnⅠ
G↓GTACC
CCATG↑G
BamHⅠ
G↓GATCC
CCTAG↑G