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2025届高考 一轮复习 人教版 传统发酵技术的应用和发酵工程 课件(多选版) (2)
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这是一份2025届高考 一轮复习 人教版 传统发酵技术的应用和发酵工程 课件(多选版) (2)，共60页。PPT课件主要包含了理论基础，DNA连接酶，切割外源，DNA以保证自身安全，能确保目的，Sau3AⅠ，实验步骤，溶解DNA，改变受体细胞性状，预期表达产物等内容，欢迎下载使用。
考点一 基因工程的基本工具
【精梳·攻教材】一、基因工程概述1.基因工程概念:
二、重组DNA技术的基本工具1.限制性内切核酸酶(也称“限制酶”):
【名师点睛】 限制酶的切割结果将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处,同时产生四个黏性末端或平末端。
【辨·清易错】1.切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。( )分析:不同种类限制酶识别序列不同。 DNA连接酶既可连接平末端,又可连接黏性末端。( )分析:E.cli DNA连接酶只能连接黏性末端。3.DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来。( )分析:DNA连接酶形成磷酸二酯键。4.载体的作用是携带目的基因导入受体细胞,使之稳定存在并表达。( )
【写·练表达】1.(选择性必修3P71“旁栏思考”拓展)原核生物中存在限制酶的意义是:_____________________________。 2.(选择性必修3P74拓展应用)限制酶不切割细菌自身DNA的原因是:(1)限制酶识别的DNA序列主要出现在________________________。(2)______________________________________________,这使得限制酶无法识别和切割自身基因组。
外源核酸上而不是自身上
细菌自身的核酸中相应的可以被识别的序列被修饰
【精研·破疑难】【命题研究】【典例】图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点,AmpR表示氨苄青霉素抗性基因,ne表示新霉素抗性基因。(1)在构建重组质粒时,若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段,会导致_______________________________________________________。 (2)在构建重组质粒时,限制酶应该选___________________,原因是 ______________________________________________________________________________。 聚焦考查点:限制酶的选择。
目的基因和质粒的自身环化,或目的基因和质粒的反向连接
PstⅠ和HindⅢ
基因和质粒的正向连接,并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因
【解析】切割目的基因时,用BamHⅠ切割会破坏目的基因,只用PstⅠ切割目的基因和质粒载体,会出现目的基因和质粒的自身环化,或目的基因和质粒的反向连接,而用PstⅠ和HindⅢ进行酶切,能确保目的基因和质粒的正向连接,并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因。
【破解策略】限制酶的选择四要求1.位置要求:限制酶的酶切位点不能位于启动子、终止子、复制原点、标记基因当中,所选酶切位点应位于启动子和终止子之间,若载体有多个标记基因,并非都不能破坏,要至少保留一个,用于重组DNA的鉴定和筛选。另外,目的基因上如果有该酶的酶切位点,不能选择。
2.酶切要求:(1)单酶切:为使目的基因与载体形成的DNA片段末端能够连接,通常使用同一种限制酶将两者切割(如下图,选用XhⅠ),但单酶切会出现目的基因与质粒的自身环化和随意连接,还可造成目的基因的多拷贝插入。
(2)双酶切:双酶切可以确保目的基因的正确插入,要求两个酶切位点位于目的基因的两侧,如下图可选择PstⅠ和BamHⅠ,但也要注意酶切位点个数和相对位置,如:不能选择XhⅠ和BamHⅠ进行双酶切。另外,不同的限制酶所产生的末端相同,两端也可连接,因MunⅠ和EcRⅠ酶切后产生的末端相同,可选择XhⅠ和MunⅠ酶切目的基因,用XhⅠ和EcRⅠ酶切质粒。
3.数量要求:如果所选限制酶的切割位点不止一个,如选择SmaⅠ进行酶切,则切割重组后会丢失复制原点,那么载体进入受体细胞后不能自主复制,所选限制酶在载体上最好只有一个酶切位点。4.特殊要求:例如根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶,假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ,则甲、乙、丁质粒均不宜选取,丙质粒宜选取。
【方法规律】DNA分子切割片段分析(1)对于链状DNA分子,如果用限制酶切割后形成2个片段,则其上有1个酶切割位点;如果形成3个片段,则其上有2个酶切割位点,以此类推。(2)对于环状DNA分子,如果用限制酶切割后形成1个片段,则其上有1个酶切割位点;如果形成2个DNA片段,则其上有2个酶切割位点,以此类推。
【精练·提能力】(多选)(2023·石家庄统考)图1为某种质粒简图,图2表示某外源DNA上的目的基因,小箭头所指位置分别为限制性内切核酸酶EcR Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位点。下列有关叙述正确的是( )A.在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割,则可选EcRⅠB.如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcRⅠ酶切后,再用DNA连接酶连接,形成一个含有目的基因的重组DNA,此重组DNA中的EcRⅠ酶切位点有1个C.为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化,酶切时可使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理D.一个图1所示的质粒分子经EcRⅠ切割后,含有2个游离的磷酸基团
【解析】选A、C、D。目的基因两侧都有,且质粒也有的限制酶是EcRⅠ,所以在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割,可选EcRⅠ,A正确;如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcRⅠ酶切后,再用DNA连接酶连接,形成一个含有目的基因的重组DNA,此重组DNA中EcRⅠ酶切位点有2个,B错误;为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化,酶切时可使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理,C正确;一个图1所示的质粒分子经EcRⅠ切割后,产生两个黏性末端,含有2个游离的磷酸基团,D正确。
【加固训练】图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制酶的识别序列与切割位点,图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcRⅠ、Sau 3AⅠ的切点是唯一的)。根据基因工程的有关知识,回答下列问题:(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_____________酶切后的产物连接,理由是 ____________________________________________。 【解析】(1)由于限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同,所以经BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以与被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。
两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,如图(c)所示,这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有______________,不能表达的原因是______________________________________________________________________________________________。
【解析】(2)在基因表达载体中,启动子应位于目的基因的首端,终止子应位于目的基因的尾端,这样目的基因才能表达。图中甲、丙均不符合,所以不能表达目的基因产物。
甲中目的基因插在启动子的上游,丙中目的
基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶,常见的有______________________ 和__________________________,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是___________________________。 【解析】(3)常见的DNA连接酶有E.cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4 DNA连接酶。
E.cli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
T4 DNA连接酶
【知识纵横】四种酶比较
考点二 DNA的粗提取与鉴定
【精梳·攻教材】一、DNA的粗提取与鉴定1.实验原理:
【名师点睛】 搅拌注意事项加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,且要向同一个方向搅拌,以免DNA分子断裂,导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
二、DNA片段的扩增及电泳鉴定1.实验基础:
2.PCR实验操作步骤:
3.DNA的电泳鉴定:凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为________的紫外灯下被检测出来。
【名师点睛】 DNA提取过程中避免污染的两种措施(1)高压灭菌:为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。(2)更换枪头:在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换,避免试剂的污染。
【辨·清易错】1.进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份,并在20 ℃条件下储存。( )分析:缓冲液和酶应在-20 ℃条件下储存。2.在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关。( )分析:在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等有关。3.为了节约资源,移液器上的枪头在实验过程中不必更换。( )分析:移液器上的枪头在实验过程中必须更换,避免试剂的污染。
4.用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物。( )5.凝胶电泳时,电泳缓冲液不要没过凝胶。( )分析:电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜。
【写·练表达】1.(选择性必修3 P74“探究·实践”拓展)DNA粗提取实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料,原因是:_____________________________________。2.(选择性必修3 P74“探究·实践”改编)提取植物细胞的DNA时,加入的洗涤剂目的是____________________________;加入研磨液的目的是____________________;加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是__________。
哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)
溶解细胞膜,有利于DNA的释放
防止DNA酶降解DNA
【精练·提能力】1.(多选)(2024·沧州模拟)从目标生物体内提取分离出DNA是进行基因工程操作的基础。下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是( )A.猪血可以作为“DNA的粗提取和鉴定”的实验材料B.若以新鲜洋葱为实验材料,则研磨液过滤后保留滤液C.实验过程中加入预冷酒精溶液的作用是纯化DNAD.DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热,冷却后呈紫色
【解析】选A、D。哺乳动物成熟红细胞中不含DNA,猪属于哺乳动物,猪血不适合选作“DNA的粗提取和鉴定”的实验材料,A错误;若以新鲜洋葱为实验材料,则研磨液过滤后保留滤液,B正确;DNA不溶于酒精溶液,实验过程中加入预冷酒精溶液的作用是纯化DNA,C正确;DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热,冷却后呈蓝色,D错误。
2.下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图,相关叙述正确的是( )A.图1中溶液a是去掉上清液的研磨液B.图2所示实验操作中有一处明显错误,可能导致试管2中蓝色变化不明显C.图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精,而蛋白质等杂质不溶D.图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
【解析】选B。图1中溶液a是研磨液静置几分钟后取的上清液,A错误;图2所示实验的试管中溶液的液面高于烧杯中的液面,可能导致加热不充分,试管2中蓝色变化不明显,B正确;图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精,而蛋白质等杂质能溶于酒精,C错误;图2试管1起对照作用,目的是证明沸水浴下物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色,而DNA遇二苯胺出现蓝色,D错误。
3.下列有关电泳的叙述,错误的是( )A.电泳是指带电分子在电场的作用下发生迁移的过程B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA的迁移速率C.进行电泳时,带电分子会向着与它所带电荷相同的电极移动D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
【解析】选C。DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基因可以带上正电荷或负电荷,在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程是电泳,即带电分子在电场的作用下发生迁移的过程,A正确,C错误;待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA分子在电泳中的迁移速率,B正确;PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定,D正确。
考点三 基因工程的操作程序
【精梳·攻教材】一、目的基因的筛选与获取1.目的基因:用于__________________或获得______________等的基因。2.目的基因筛选方法:
3.利用PCR获取和扩增目的基因:
【名师点睛】PCR过程中的温度控制(1)变性温度:90 ℃以上使得DNA热变性,打开双链间的氢键,而体内DNA复制靠的是解旋酶。(2)复性温度:复性温度在50 ℃左右,温度过高,则引物难以与模板链结合,温度过低则易使两条母链配对结合,均无法获得PCR产物。(3)延伸温度:温度在72 ℃左右,在DNA聚合酶和引物的作用下形成子链,方向为5 '到3 '。
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1.构建目的:使目的基因__________________________________________,同时,使目的基因能够表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成及作用:
在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代
三、将目的基因导入受体细胞
【名师点睛】农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入(1)第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。(2)第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
四、目的基因的检测与鉴定
【辨·清易错】1.用PCR方法扩增目的基因时必须知道基因的全部序列。( )分析:PCR方法扩增目的基因时不需要知道基因的全部序列。2.外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。( )分析:外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行表达。3.将目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法。( )
4.抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。( )5.应用DNA探针技术,可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。( )分析:应用DNA探针技术可以检测目的基因是否存在。
【写·练表达】1.(选择性必修3 P77“相关信息”)引物是一小段_________________________________________________;引物在PCR中发挥的作用是:作为新子链的合成起点,只能结合在母链的_____,使_____________________________________________。2.(选择性必修3 P81“资料卡”延伸)导入的目的基因,可能存在于细胞的哪些部位?可能存在于__________,也可能____________________。
能与DNA母链的一段碱基序列互
DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
【精研·破疑难】【命题研究】【典例】某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点,同时还含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程,如图所示。请回答下列问题:(1)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖,农杆菌中是否已含有目的基因?________(填“是”或“否”)。为什么?____________________________________________________________________________。 【解析】(1)含有目的基因的质粒中四环素抗性基因被破坏,在四环素培养基中不能生存。
含有目的基因的质粒中四环素抗性基因被破坏,
在四环素培养基中不能生存
(2)将已经转化的农杆菌进行如下操作,筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A(含氨苄青霉素)培养基中培养,长出菌落后,用无菌牙签挑取A培养基上的单个菌落,分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上,一段时间后,菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C培养基上的哪些菌落中?请在图中相应的位置上圈出来。聚焦考查点:标记基因作用。
【解析】(2)含有目的基因的菌落能在氨苄青霉素培养基中生长,不能在四环素培养基中生存。
【破解策略】标记基因的分类和应用分类:标记基因可分为选择基因和报告基因,它们都起着标记目的基因是否成功转化的作用,但是又有着各自的特点。
1.选择基因:(1)直接选择:载体上的选择基因一般是一些抗生素的抗性基因,当含有抗生素基因的载体进入受体细胞后,抗性基因在受体细胞内表达,使受体细胞能够抵抗相应抗生素,所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素,就可以只保留转入载体的受体细胞,原理如图所示:
(2)间接选择:将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时,如果插入某种抗生素抗性基因内部,则会导致该抗生素抗性基因失活。常用方法——“影印法”筛选含有重组质粒的受体细胞①将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌,如图1、2、3、4、5菌落。②再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上,如图能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落,如图1、5菌落。③最后,可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
2.报告基因:报告基因是指其编码产物能够被快速测定,且实验材料原本不会产生的性状的基因。常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因、荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)等。常用方法——“蓝白斑”筛选含重组质粒的受体细胞大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质,在经人工插入外源基因后,大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断,无法形成完整的β-半乳糖苷酶基因,故不能对无色化合物X-gal进行切割,菌落呈白色。
【精练·提能力】1.(2023·邢台模拟)PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键碱基,5'端无严格限制,可用于添加限制酶切割位点等序列。下列叙述正确的是( )A.PCR第五次循环,消耗了16对引物B.脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到5'端C.PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、Ca2+等D.图中引物扩增至少四次循环后才能获得两端均能添加限制酶切点的目的产物
【解析】选A。该DNA是双链,第一次循环要1对引物,第二次要2对,第三次4对,第四次要8对,第五次要16对,即PCR第五次循环,消耗了16对引物,A正确;进行PCR时,扩增是从引物的3'端开始延伸,因此脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到3'端,B错误;PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和扩增缓冲液(含Mg2+)等物质,不需要加入Ca2+,C错误;在第三轮循环产物中才开始出现完整的X基因(目的基因),D错误。
【知识纵横】(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。(2)引物既可以为DNA单链,也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时,也需要引物,一般为RNA片段。
【从教材走向高考】2.(选择性必修3 P83练习与应用T1改编)我国科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果(番茄品种)细胞中,成功培育出抗冻千禧果。如图为培育过程使用的Ti质粒示意图,Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移。(1)利用PCR从海鱼基因组中扩增抗冻基因需要添加一对特异性引物,目的是_______________________________________________________;利用抗冻基因的mRNA逆转录后PCR也可获得抗冻基因。通过琼脂糖凝胶电泳,____________(填“能”或“不能”)区分两种方法获得的抗冻基因,理由是____________________________________________________________________________________________________________________________。
使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核
利用抗冻基因的mRNA
逆转录后PCR获得的抗冻基因中不含启动子、终止子和内含子等序列,DNA分子较小,
在凝胶中的迁移速率较大
【解析】(1)PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA的技术,引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,合成子链DNA。利用抗冻基因的mRNA逆转录后PCR获得的抗冻基因中不含启动子、终止子和内含子等序列,DNA分子较小,在凝胶中的迁移速率较大;而利用PCR从海鱼基因组中获得的抗冻基因含启动子、终止子和内含子等序列,DNA分子相对较大,在凝胶中的迁移速率较小。因此,可以通过琼脂糖凝胶电泳,区分两种方法获得的抗冻基因。
2.(选择性必修3 P83练习与应用T1改编)我国科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果(番茄品种)细胞中,成功培育出抗冻千禧果。如图为培育过程使用的Ti质粒示意图,Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移。(2)选择图示Ti质粒构建基因表达载体,应选择限制酶________ (填“Ⅰ”“Ⅱ”或“Ⅲ”),理由是__________________________________________________________________________________________________________________。 【解析】(2)选择图示Ti质粒构建基因表达载体时,限制酶Ⅰ会破坏四环素抗性基因影响后续的筛选,限制酶Ⅱ会破坏Vir区基因影响目的基因的转移,因此选择限制酶Ⅲ。
限制酶Ⅰ会破坏四环素抗
性基因,不利于含目的基因的受体细胞的筛选;限制酶Ⅱ会
破坏Vir区基因,影响目的基因的转移
2.(选择性必修3 P83练习与应用T1改编)我国科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果(番茄品种)细胞中,成功培育出抗冻千禧果。如图为培育过程使用的Ti质粒示意图,Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移。(3)为筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞,要在培养基中添加______________。成功转化的千禧果细胞经脱分化形成愈伤组织后,再使用________________________诱导培育成植株,最后在_________________条件下筛选出具有抗冻性状的千禧果植株。
【解析】(3)在培养基中添加四环素,可以筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞;将千禧果细胞经脱分化形成愈伤组织后,再通过再分化过程培育成植株,再分化过程通过调节生长素和细胞分裂素的比值诱导愈伤组织分化出根或芽。新形成的植株含有抗冻基因,在低温/寒冷条件下筛选出具有抗冻性状的千禧果植株。
【加固训练】1.烟草是我国重要的经济作物,其栽培容易受到气候、土壤等诸多生态因子的制约,因而烟草的栽培区域受到限制。土壤中的盐分是制约烟草生长的重要因素,它的含量过高不仅造成烟草产量和品质降低,同时还使土壤板结。某科研团队为获得抗逆性强的耐盐烟草品种,将抗盐基因H与质粒重组,再借助农杆菌导入烟草细胞中。请回答: (1)质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件有 ______________________________________________________________(答出2点即可)。而作为目的基因的表达载体,除满足上述基本条件外,还需要有启动子和终止子,其中启动子的作用是____________________________________________。
能自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制
RNA聚合酶识别和结合的位点,驱动转录
【解析】(1)质粒作为基因工程的工具,应具备的基本条件有能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点等;启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点,用以驱动基因的转录。
1.烟草是我国重要的经济作物,其栽培容易受到气候、土壤等诸多生态因子的制约,因而烟草的栽培区域受到限制。土壤中的盐分是制约烟草生长的重要因素,它的含量过高不仅造成烟草产量和品质降低,同时还使土壤板结。某科研团队为获得抗逆性强的耐盐烟草品种,将抗盐基因H与质粒重组,再借助农杆菌导入烟草细胞中。请回答:(2)对图中的质粒和外源DNA进行切割时,所用的限制酶是________________________________________。图中的质粒A还应含有T-DNA,T-DNA的作用是_____________________________________________________________。
BamHⅠ和HindⅢ或EcRⅠ和HindⅢ
携带目的基因进入烟草细胞并整合到烟草细胞的染色体DNA上
【解析】(2)据图分析可知,因SmaⅠ会破坏目的基因,故不能选用该限制酶进行切割,故构建基因表达载体时需要限制酶HindⅢ和BamHⅠ或HindⅢ和EcRⅠ;Ti质粒上含有T-DNA,T-DNA的作用是携带目的基因进入烟草细胞并整合到烟草细胞的染色体DNA上。
1.烟草是我国重要的经济作物,其栽培容易受到气候、土壤等诸多生态因子的制约,因而烟草的栽培区域受到限制。土壤中的盐分是制约烟草生长的重要因素,它的含量过高不仅造成烟草产量和品质降低,同时还使土壤板结。某科研团队为获得抗逆性强的耐盐烟草品种,将抗盐基因H与质粒重组,再借助农杆菌导入烟草细胞中。请回答:(3)将抗盐基因H插入T-DNA上,导入用_________处理过的农杆菌。筛选转基因成功的烟草细胞,经过⑤和⑥过程得到转基因抗盐的烟草幼苗,该过程所应用的原理是__________________________。
植物细胞具有全能性
【解析】(3)农杆菌为微生物细胞,作为受体细胞时,应让其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,通常用Ca2+进行处理;经过⑤脱分化和⑥再分化过程得到转基因抗盐的烟草幼苗,该过程所应用的原理是植物细胞具有全能性。
1.烟草是我国重要的经济作物,其栽培容易受到气候、土壤等诸多生态因子的制约,因而烟草的栽培区域受到限制。土壤中的盐分是制约烟草生长的重要因素,它的含量过高不仅造成烟草产量和品质降低,同时还使土壤板结。某科研团队为获得抗逆性强的耐盐烟草品种,将抗盐基因H与质粒重组,再借助农杆菌导入烟草细胞中。请回答:(4)若要获得抗盐能力更强的抗盐基因,可以对基因H进行改造,最终得到相应的蛋白质,该过程可以通过蛋白质工程完成,该过程的基本思路是__________________________________________________________________________________________________________________________。
①预期耐盐蛋白质的功能,②设计耐盐蛋白质的结构,
③推测应有的氨基酸序列,④找到并改变对应的基因序列,
【解析】(4)若要获得抗盐能力更强的抗盐基因,可以对基因H进行改造,最终得到相应的蛋白质,该过程可以通过蛋白质工程完成,基本思路是:①预期耐盐蛋白质的功能;②设计耐盐蛋白质的结构;③推测应有的氨基酸序列;④找到并改变对应的基因序列;⑤获得所需要的蛋白质。
【易错警示】启动子、终止子、起始密码子、终止密码子比较
2.玉米是世界上的第三大粮食作物,广泛种植于世界各地。研究表明,转基因抗虫玉米中的抗虫基因是从细菌中分离出的Bt毒蛋白基因,这种基因编码的蛋白质会进入害虫的肠道,能有效杀死玉米螟(一种农业害虫)。结合上述资料请回答下列问题:(1)Bt毒蛋白基因在基因工程中称为________________,其除这种编码蛋白质的基因外,还可以是____________________________;在构建基因表达载体的过程中,除要有Bt毒蛋白基因外,还必须有启动子、终止子和________________。 【解析】(1)Bt毒蛋白基因在基因工程中被称为目的基因;基因工程中的目的基因除这种编码蛋白质的基因外,还可以是具有调控作用的因子,构建目的基因表达载体,需要目的基因、启动子、终止子以及标记基因,标记基因的作用是为了筛选成功导入目的基因的受体细胞。
具有调控作用的因子
2.玉米是世界上的第三大粮食作物,广泛种植于世界各地。研究表明,转基因抗虫玉米中的抗虫基因是从细菌中分离出的Bt毒蛋白基因,这种基因编码的蛋白质会进入害虫的肠道,能有效杀死玉米螟(一种农业害虫)。结合上述资料请回答下列问题:(2)在利用PCR技术扩增Bt毒蛋白基因时,需要提供模板、原料、引物、________________________________________等条件,缓冲液中Mg2+的作用是_____________________。 【解析】(2)在利用PCR技术扩增Bt毒蛋白基因时,需要提供模板、原料、引物和耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)等条件,DNA聚合酶需要Mg2+激活。
耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)
激活DNA聚合酶
2.玉米是世界上的第三大粮食作物,广泛种植于世界各地。研究表明,转基因抗虫玉米中的抗虫基因是从细菌中分离出的Bt毒蛋白基因,这种基因编码的蛋白质会进入害虫的肠道,能有效杀死玉米螟(一种农业害虫)。结合上述资料请回答下列问题:(3)Bt毒蛋白基因与载体结合过程中需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶。若某限制酶的识别序列和切割位点是 ,请写出Bt毒蛋白基因被限制酶切割后所形成的黏性末端:__________________,DNA连接酶对所连接的两端碱基序列__________ (填“有”或“没有”)专一性要求。
2.玉米是世界上的第三大粮食作物,广泛种植于世界各地。研究表明,转基因抗虫玉米中的抗虫基因是从细菌中分离出的Bt毒蛋白基因,这种基因编码的蛋白质会进入害虫的肠道,能有效杀死玉米螟(一种农业害虫)。结合上述资料请回答下列问题:(4)为了防止抗虫玉米通过花粉传播带来的生态学问题,科研小组考虑将抗虫基因导入玉米根尖细胞的____________中以防止基因污染,同时在大规模种植的抗虫玉米田中设置一个或多个区域来种植普通玉米,目的是__________________________________________________________________。
延缓抗毒蛋白的玉米螟出
现(或减缓害虫抗性基因频率增加的速度)
【解析】(4)为了防止抗虫玉米通过花粉传播带来的生态学问题,科研小组考虑将抗虫基因导入玉米根尖细胞的线粒体中以防止基因污染,这样可以避免目的基因随着花粉传播到近源物种中,同时在大规模种植的抗虫玉米田中设置一个或多个种植普通玉米的区域,这样可以给玉米螟提供普通玉米食物,目的是延缓抗毒蛋白的玉米螟出现(或减缓害虫抗性基因频率增加的速度)。
【感悟高考】1.(2023·湖北选择考)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同B.若用PυuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
【解析】选D。本题考查基因工程相关知识。若用HindⅢ酶切,目的基因的插入方向可正可反,所以转录的产物可能不同,A正确;若用PυuⅠ酶切,重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR),所以在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因,B正确;DNA凝胶电泳技术可以分离大小不同的DNA片段,重组质粒的大小与质粒不同,能够鉴定重组质粒构建成功与否,C正确;SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中,若用SphⅠ酶切,重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR),因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落,在含Tet的培养基中不能形成菌落,D错误。
2.(2023·广东选择考)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是( )A.裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质B.分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度D.鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
【解析】选D。裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破,释放出DNA等物质,A正确;DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,能溶于2 ml/L的NaCl溶液,将溶液过滤,即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离,B正确;DNA不溶于酒精,而某些蛋白质溶于酒精,可以反复多次用酒精沉淀出DNA,提高DNA纯度,C正确;将DNA溶解于NaCl溶液,加入二苯胺试剂,沸水浴5 min,待冷却后,能呈现蓝色,D错误。
3.(2021·山东等级考)粗提取 DNA 时,向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤,在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是( )A.加入适量的木瓜蛋白酶B.在37～40 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟C.加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精D.加入 NaCl 调节浓度至 2 ml/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0.14 ml/L
【解析】选A。木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质,由于酶具有专一性,不能水解DNA,过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物,A正确;在37～40 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质,应该放在60～75 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟,使蛋白质变性析出,B错误;向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精,此时DNA析出,不会进入滤液中,C错误;加入 NaCl 调节浓度至 2 ml/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0.14 ml/L, DNA在此溶液中溶解度小而析出,不会进入滤液中,D错误。
【加固训练】(2023·广东选择考)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。回答下列问题:(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与______________植株的种子大小相近。 【解析】(1)根据题干信息可知,突变后的基因为隐性基因,则野生型DAI基因为显性基因,因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。
(2023·广东选择考)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。回答下列问题:(2)用PCR反应扩增DAI基因,用限制性内切核酸酶对PCR产物和__________进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达,其上下游序列需具备______________________。 【解析】(2)利用PCR技术扩增DAI基因后,应该用同种限制性内切核酸酶对DAI基因和载体进行切割,再用DNA连接酶将两者连接起来。在基因表达载体中,启动子位于目的基因的首端,终止子位于目的基因的尾端,因此为确保插入的DAI基因可以正常表达,其上下游序列需具备启动子和终止子。
(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图),用于后续验证突变基因与表型的关系。①农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_______________________________。 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约________%的培养基中幼苗继续培养。
DAI基因和卡那霉素抗性基因
③将②中选出的T2代阳性植株__________(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性内切核酸酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息如下,在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
【解析】(3)①根据题中信息和图形分析,将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因)菌液中转化,再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上,若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体,则说明含有卡那霉素抗性基因,即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DAI基因,由于T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点,所以不确定是单一位点插入还是多位点插入,若是单一位点插入,相当于一对等位基因的杂合子,其自交后代应该出现3∶1的性状分离比,而题目要求选出单一位点插入的植株,因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。
③将以上获得的T2代阳性植株自交,再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上,若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株,即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析,野生型和突变型基因片段的长度都是150 bp,野生型的基因没有限制酶X的切割位点,而突变型的基因有限制酶X的切割位点,结合图中的数据分析可知,电泳图中野生型只有150 bp,突变型有50 bp和100 bp,如图:
【预测高考】锁定新情境:靶向基因操作技术 TALEN是一种靶向基因操作技术,该技术利用了TAL靶向识别单元对靶向基因的识别作用和Fk1蛋白对靶向基因的切割作用实现了对特定靶向基因的敲除。相关操作如下:TAL靶向识别单元的构建。TAL靶向识别单元为间隔32个氨基酸的双连氨基酸(即两个相连的氨基酸)序列。不同的双连氨基酸分别与靶向基因中的A、T、C、G有恒定的对应关系,根据靶向基因的碱基序列可以设计出双连氨基酸序列。
基于核心素养的新考向:1.(结构与功能观)目的基因的获取与扩增。根据TAL靶向识别单元中双连氨基酸序列和Fk1蛋白的氨基酸序列,可按照 _________________________________________________________________________________________, 最终合成目的基因(写出具体步骤)。再通过PCR技术进行扩增。扩增前,需根据目的基因的核苷酸序列设计出___________种引物;扩增时,需先加热至90～95 ℃,再冷却至50～60 ℃,再加热至70～75 ℃,此操作的目的是_____________________________________________________________________________________________________________。
先推测出mRNA序列,再推测出目的基因
的脱氧核苷酸序列,利用化学法以单个脱氧核苷酸为原料
加热使DNA变性后解聚为
单链,冷却使引物结合到互补DNA链上,再加热促进DNA聚合酶发挥作用,开始互
【解析】1.已知TAL靶向识别单元中双连氨基酸序列和Fk1蛋白的氨基酸序列,可先推测出mRNA序列,再推测出目的基因的脱氧核苷酸序列,然后利用化学法以单个脱氧核苷酸为原料,最终合成目的基因,再通过PCR技术进行扩增。PCR扩增前,需根据目的基因的核苷酸序列设计出2种引物;扩增时,需先加热至90～95 ℃使DNA变性后解聚为单链,再冷却至50～60 ℃使引物结合到互补DNA链上,再加热至70～75 ℃促进DNA聚合酶发挥作用,开始互补链的合成。
2.(归纳与概括)利用质粒和目的基因构建基因表达载体。在构建的基因表达载体中,启动子应位于基因的上游,它是_____________________________的部位;标记基因的作用是___________________________。 【解析】2.在构建的基因表达载体中,启动子位于基因的首端,它是RNA聚合酶识别和结合的部位;标记基因的作用是便于重组DNA分子的筛选。
RNA聚合酶识别和结合
便于重组DNA分子的筛选
3.(分析与比较)目的基因的表达与检测。目的基因进入受体细胞后,在受体细胞中维持稳定和表达的过程,称为__________。从分子水平上,通过_____________________________________方法可检测基因工程操作是否成功。 【解析】3.目的基因进入受体细胞后,在受体细胞中维持稳定和表达的过程,称为转化。分子水平上的检测:①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入目的基因用PCR技术;②检测目的基因是否转录出了mRNA用PCR技术;③检测目的基因是否翻译成蛋白质用抗原—抗体杂交技术。
杂交(或PCR技术)
考点一 基因工程的基本工具
【精梳·攻教材】一、基因工程概述1.基因工程概念:
二、重组DNA技术的基本工具1.限制性内切核酸酶(也称“限制酶”):
【名师点睛】 限制酶的切割结果将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处,同时产生四个黏性末端或平末端。
【辨·清易错】1.切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。( )分析:不同种类限制酶识别序列不同。 DNA连接酶既可连接平末端,又可连接黏性末端。( )分析:E.cli DNA连接酶只能连接黏性末端。3.DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来。( )分析:DNA连接酶形成磷酸二酯键。4.载体的作用是携带目的基因导入受体细胞,使之稳定存在并表达。( )
【写·练表达】1.(选择性必修3P71“旁栏思考”拓展)原核生物中存在限制酶的意义是:_____________________________。 2.(选择性必修3P74拓展应用)限制酶不切割细菌自身DNA的原因是:(1)限制酶识别的DNA序列主要出现在________________________。(2)______________________________________________,这使得限制酶无法识别和切割自身基因组。
外源核酸上而不是自身上
细菌自身的核酸中相应的可以被识别的序列被修饰
【精研·破疑难】【命题研究】【典例】图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点,AmpR表示氨苄青霉素抗性基因,ne表示新霉素抗性基因。(1)在构建重组质粒时,若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段,会导致_______________________________________________________。 (2)在构建重组质粒时,限制酶应该选___________________,原因是 ______________________________________________________________________________。 聚焦考查点:限制酶的选择。
目的基因和质粒的自身环化,或目的基因和质粒的反向连接
PstⅠ和HindⅢ
基因和质粒的正向连接,并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因
【解析】切割目的基因时,用BamHⅠ切割会破坏目的基因,只用PstⅠ切割目的基因和质粒载体,会出现目的基因和质粒的自身环化,或目的基因和质粒的反向连接,而用PstⅠ和HindⅢ进行酶切,能确保目的基因和质粒的正向连接,并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因。
【破解策略】限制酶的选择四要求1.位置要求:限制酶的酶切位点不能位于启动子、终止子、复制原点、标记基因当中,所选酶切位点应位于启动子和终止子之间,若载体有多个标记基因,并非都不能破坏,要至少保留一个,用于重组DNA的鉴定和筛选。另外,目的基因上如果有该酶的酶切位点,不能选择。
2.酶切要求:(1)单酶切:为使目的基因与载体形成的DNA片段末端能够连接,通常使用同一种限制酶将两者切割(如下图,选用XhⅠ),但单酶切会出现目的基因与质粒的自身环化和随意连接,还可造成目的基因的多拷贝插入。
(2)双酶切:双酶切可以确保目的基因的正确插入,要求两个酶切位点位于目的基因的两侧,如下图可选择PstⅠ和BamHⅠ,但也要注意酶切位点个数和相对位置,如:不能选择XhⅠ和BamHⅠ进行双酶切。另外,不同的限制酶所产生的末端相同,两端也可连接,因MunⅠ和EcRⅠ酶切后产生的末端相同,可选择XhⅠ和MunⅠ酶切目的基因,用XhⅠ和EcRⅠ酶切质粒。
3.数量要求:如果所选限制酶的切割位点不止一个,如选择SmaⅠ进行酶切,则切割重组后会丢失复制原点,那么载体进入受体细胞后不能自主复制,所选限制酶在载体上最好只有一个酶切位点。4.特殊要求:例如根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶,假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ,则甲、乙、丁质粒均不宜选取,丙质粒宜选取。
【方法规律】DNA分子切割片段分析(1)对于链状DNA分子,如果用限制酶切割后形成2个片段,则其上有1个酶切割位点;如果形成3个片段,则其上有2个酶切割位点,以此类推。(2)对于环状DNA分子,如果用限制酶切割后形成1个片段,则其上有1个酶切割位点;如果形成2个DNA片段,则其上有2个酶切割位点,以此类推。
【精练·提能力】(多选)(2023·石家庄统考)图1为某种质粒简图,图2表示某外源DNA上的目的基因,小箭头所指位置分别为限制性内切核酸酶EcR Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位点。下列有关叙述正确的是( )A.在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割,则可选EcRⅠB.如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcRⅠ酶切后,再用DNA连接酶连接,形成一个含有目的基因的重组DNA,此重组DNA中的EcRⅠ酶切位点有1个C.为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化,酶切时可使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理D.一个图1所示的质粒分子经EcRⅠ切割后,含有2个游离的磷酸基团
【解析】选A、C、D。目的基因两侧都有,且质粒也有的限制酶是EcRⅠ,所以在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割,可选EcRⅠ,A正确;如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcRⅠ酶切后,再用DNA连接酶连接,形成一个含有目的基因的重组DNA,此重组DNA中EcRⅠ酶切位点有2个,B错误;为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化,酶切时可使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理,C正确;一个图1所示的质粒分子经EcRⅠ切割后,产生两个黏性末端,含有2个游离的磷酸基团,D正确。
【加固训练】图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制酶的识别序列与切割位点,图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcRⅠ、Sau 3AⅠ的切点是唯一的)。根据基因工程的有关知识,回答下列问题:(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被_____________酶切后的产物连接,理由是 ____________________________________________。 【解析】(1)由于限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同,所以经BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以与被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。
两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,如图(c)所示,这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有______________,不能表达的原因是______________________________________________________________________________________________。
【解析】(2)在基因表达载体中,启动子应位于目的基因的首端,终止子应位于目的基因的尾端,这样目的基因才能表达。图中甲、丙均不符合,所以不能表达目的基因产物。
甲中目的基因插在启动子的上游,丙中目的
基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶,常见的有______________________ 和__________________________,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是___________________________。 【解析】(3)常见的DNA连接酶有E.cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4 DNA连接酶。
E.cli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
T4 DNA连接酶
【知识纵横】四种酶比较
考点二 DNA的粗提取与鉴定
【精梳·攻教材】一、DNA的粗提取与鉴定1.实验原理:
【名师点睛】 搅拌注意事项加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,且要向同一个方向搅拌,以免DNA分子断裂,导致DNA分子不能形成丝状沉淀。
二、DNA片段的扩增及电泳鉴定1.实验基础:
2.PCR实验操作步骤:
3.DNA的电泳鉴定:凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为________的紫外灯下被检测出来。
【名师点睛】 DNA提取过程中避免污染的两种措施(1)高压灭菌:为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。(2)更换枪头:在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换,避免试剂的污染。
【辨·清易错】1.进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验所需的缓冲液和酶应分装成小份,并在20 ℃条件下储存。( )分析:缓冲液和酶应在-20 ℃条件下储存。2.在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关。( )分析:在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子的大小和构象等有关。3.为了节约资源,移液器上的枪头在实验过程中不必更换。( )分析:移液器上的枪头在实验过程中必须更换,避免试剂的污染。
4.用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物。( )5.凝胶电泳时,电泳缓冲液不要没过凝胶。( )分析:电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜。
【写·练表达】1.(选择性必修3 P74“探究·实践”拓展)DNA粗提取实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料,原因是:_____________________________________。2.(选择性必修3 P74“探究·实践”改编)提取植物细胞的DNA时,加入的洗涤剂目的是____________________________;加入研磨液的目的是____________________;加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是__________。
哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)
溶解细胞膜,有利于DNA的释放
防止DNA酶降解DNA
【精练·提能力】1.(多选)(2024·沧州模拟)从目标生物体内提取分离出DNA是进行基因工程操作的基础。下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是( )A.猪血可以作为“DNA的粗提取和鉴定”的实验材料B.若以新鲜洋葱为实验材料,则研磨液过滤后保留滤液C.实验过程中加入预冷酒精溶液的作用是纯化DNAD.DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热,冷却后呈紫色
【解析】选A、D。哺乳动物成熟红细胞中不含DNA,猪属于哺乳动物,猪血不适合选作“DNA的粗提取和鉴定”的实验材料,A错误;若以新鲜洋葱为实验材料,则研磨液过滤后保留滤液,B正确;DNA不溶于酒精溶液,实验过程中加入预冷酒精溶液的作用是纯化DNA,C正确;DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热,冷却后呈蓝色,D错误。
2.下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图,相关叙述正确的是( )A.图1中溶液a是去掉上清液的研磨液B.图2所示实验操作中有一处明显错误,可能导致试管2中蓝色变化不明显C.图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精,而蛋白质等杂质不溶D.图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
【解析】选B。图1中溶液a是研磨液静置几分钟后取的上清液,A错误;图2所示实验的试管中溶液的液面高于烧杯中的液面,可能导致加热不充分,试管2中蓝色变化不明显,B正确;图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精,而蛋白质等杂质能溶于酒精,C错误;图2试管1起对照作用,目的是证明沸水浴下物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色,而DNA遇二苯胺出现蓝色,D错误。
3.下列有关电泳的叙述,错误的是( )A.电泳是指带电分子在电场的作用下发生迁移的过程B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA的迁移速率C.进行电泳时,带电分子会向着与它所带电荷相同的电极移动D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
【解析】选C。DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基因可以带上正电荷或负电荷,在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程是电泳,即带电分子在电场的作用下发生迁移的过程,A正确,C错误;待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA分子在电泳中的迁移速率,B正确;PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定,D正确。
考点三 基因工程的操作程序
【精梳·攻教材】一、目的基因的筛选与获取1.目的基因:用于__________________或获得______________等的基因。2.目的基因筛选方法:
3.利用PCR获取和扩增目的基因:
【名师点睛】PCR过程中的温度控制(1)变性温度:90 ℃以上使得DNA热变性,打开双链间的氢键,而体内DNA复制靠的是解旋酶。(2)复性温度:复性温度在50 ℃左右,温度过高,则引物难以与模板链结合,温度过低则易使两条母链配对结合,均无法获得PCR产物。(3)延伸温度:温度在72 ℃左右,在DNA聚合酶和引物的作用下形成子链,方向为5 '到3 '。
二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1.构建目的:使目的基因__________________________________________,同时,使目的基因能够表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成及作用:
在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代
三、将目的基因导入受体细胞
【名师点睛】农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入(1)第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。(2)第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
四、目的基因的检测与鉴定
【辨·清易错】1.用PCR方法扩增目的基因时必须知道基因的全部序列。( )分析:PCR方法扩增目的基因时不需要知道基因的全部序列。2.外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。( )分析:外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行表达。3.将目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法。( )
4.抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达。( )5.应用DNA探针技术,可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。( )分析:应用DNA探针技术可以检测目的基因是否存在。
【写·练表达】1.(选择性必修3 P77“相关信息”)引物是一小段_________________________________________________;引物在PCR中发挥的作用是:作为新子链的合成起点,只能结合在母链的_____,使_____________________________________________。2.(选择性必修3 P81“资料卡”延伸)导入的目的基因,可能存在于细胞的哪些部位?可能存在于__________,也可能____________________。
能与DNA母链的一段碱基序列互
DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
【精研·破疑难】【命题研究】【典例】某质粒上有SalⅠ、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点,同时还含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程,如图所示。请回答下列问题:(1)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖,农杆菌中是否已含有目的基因?________(填“是”或“否”)。为什么?____________________________________________________________________________。 【解析】(1)含有目的基因的质粒中四环素抗性基因被破坏,在四环素培养基中不能生存。
含有目的基因的质粒中四环素抗性基因被破坏,
在四环素培养基中不能生存
(2)将已经转化的农杆菌进行如下操作,筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A(含氨苄青霉素)培养基中培养,长出菌落后,用无菌牙签挑取A培养基上的单个菌落,分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上,一段时间后,菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C培养基上的哪些菌落中?请在图中相应的位置上圈出来。聚焦考查点:标记基因作用。
【解析】(2)含有目的基因的菌落能在氨苄青霉素培养基中生长,不能在四环素培养基中生存。
【破解策略】标记基因的分类和应用分类:标记基因可分为选择基因和报告基因,它们都起着标记目的基因是否成功转化的作用,但是又有着各自的特点。
1.选择基因:(1)直接选择:载体上的选择基因一般是一些抗生素的抗性基因,当含有抗生素基因的载体进入受体细胞后,抗性基因在受体细胞内表达,使受体细胞能够抵抗相应抗生素,所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素,就可以只保留转入载体的受体细胞,原理如图所示:
(2)间接选择:将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时,如果插入某种抗生素抗性基因内部,则会导致该抗生素抗性基因失活。常用方法——“影印法”筛选含有重组质粒的受体细胞①将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌,如图1、2、3、4、5菌落。②再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上,如图能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落,如图1、5菌落。③最后,可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
2.报告基因:报告基因是指其编码产物能够被快速测定,且实验材料原本不会产生的性状的基因。常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因、荧光素酶基因、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)等。常用方法——“蓝白斑”筛选含重组质粒的受体细胞大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质,在经人工插入外源基因后,大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断,无法形成完整的β-半乳糖苷酶基因,故不能对无色化合物X-gal进行切割,菌落呈白色。
【精练·提能力】1.(2023·邢台模拟)PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键碱基,5'端无严格限制,可用于添加限制酶切割位点等序列。下列叙述正确的是( )A.PCR第五次循环,消耗了16对引物B.脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到5'端C.PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、Ca2+等D.图中引物扩增至少四次循环后才能获得两端均能添加限制酶切点的目的产物
【解析】选A。该DNA是双链,第一次循环要1对引物,第二次要2对,第三次4对,第四次要8对,第五次要16对,即PCR第五次循环,消耗了16对引物,A正确;进行PCR时,扩增是从引物的3'端开始延伸,因此脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到3'端,B错误;PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和扩增缓冲液(含Mg2+)等物质,不需要加入Ca2+,C错误;在第三轮循环产物中才开始出现完整的X基因(目的基因),D错误。
【知识纵横】(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。(2)引物既可以为DNA单链,也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行复制时,也需要引物,一般为RNA片段。
【从教材走向高考】2.(选择性必修3 P83练习与应用T1改编)我国科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果(番茄品种)细胞中,成功培育出抗冻千禧果。如图为培育过程使用的Ti质粒示意图,Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移。(1)利用PCR从海鱼基因组中扩增抗冻基因需要添加一对特异性引物,目的是_______________________________________________________;利用抗冻基因的mRNA逆转录后PCR也可获得抗冻基因。通过琼脂糖凝胶电泳,____________(填“能”或“不能”)区分两种方法获得的抗冻基因,理由是____________________________________________________________________________________________________________________________。
使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核
利用抗冻基因的mRNA
逆转录后PCR获得的抗冻基因中不含启动子、终止子和内含子等序列,DNA分子较小,
在凝胶中的迁移速率较大
【解析】(1)PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA的技术,引物使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,合成子链DNA。利用抗冻基因的mRNA逆转录后PCR获得的抗冻基因中不含启动子、终止子和内含子等序列,DNA分子较小,在凝胶中的迁移速率较大;而利用PCR从海鱼基因组中获得的抗冻基因含启动子、终止子和内含子等序列,DNA分子相对较大,在凝胶中的迁移速率较小。因此,可以通过琼脂糖凝胶电泳,区分两种方法获得的抗冻基因。
2.(选择性必修3 P83练习与应用T1改编)我国科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果(番茄品种)细胞中,成功培育出抗冻千禧果。如图为培育过程使用的Ti质粒示意图,Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移。(2)选择图示Ti质粒构建基因表达载体,应选择限制酶________ (填“Ⅰ”“Ⅱ”或“Ⅲ”),理由是__________________________________________________________________________________________________________________。 【解析】(2)选择图示Ti质粒构建基因表达载体时,限制酶Ⅰ会破坏四环素抗性基因影响后续的筛选,限制酶Ⅱ会破坏Vir区基因影响目的基因的转移,因此选择限制酶Ⅲ。
限制酶Ⅰ会破坏四环素抗
性基因,不利于含目的基因的受体细胞的筛选;限制酶Ⅱ会
破坏Vir区基因,影响目的基因的转移
2.(选择性必修3 P83练习与应用T1改编)我国科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果(番茄品种)细胞中,成功培育出抗冻千禧果。如图为培育过程使用的Ti质粒示意图,Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移。(3)为筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞,要在培养基中添加______________。成功转化的千禧果细胞经脱分化形成愈伤组织后,再使用________________________诱导培育成植株,最后在_________________条件下筛选出具有抗冻性状的千禧果植株。
【解析】(3)在培养基中添加四环素,可以筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞;将千禧果细胞经脱分化形成愈伤组织后,再通过再分化过程培育成植株,再分化过程通过调节生长素和细胞分裂素的比值诱导愈伤组织分化出根或芽。新形成的植株含有抗冻基因,在低温/寒冷条件下筛选出具有抗冻性状的千禧果植株。
【加固训练】1.烟草是我国重要的经济作物,其栽培容易受到气候、土壤等诸多生态因子的制约,因而烟草的栽培区域受到限制。土壤中的盐分是制约烟草生长的重要因素,它的含量过高不仅造成烟草产量和品质降低,同时还使土壤板结。某科研团队为获得抗逆性强的耐盐烟草品种,将抗盐基因H与质粒重组,再借助农杆菌导入烟草细胞中。请回答: (1)质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件有 ______________________________________________________________(答出2点即可)。而作为目的基因的表达载体,除满足上述基本条件外,还需要有启动子和终止子,其中启动子的作用是____________________________________________。
能自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制
RNA聚合酶识别和结合的位点,驱动转录
【解析】(1)质粒作为基因工程的工具,应具备的基本条件有能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点等;启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点,用以驱动基因的转录。
1.烟草是我国重要的经济作物,其栽培容易受到气候、土壤等诸多生态因子的制约,因而烟草的栽培区域受到限制。土壤中的盐分是制约烟草生长的重要因素,它的含量过高不仅造成烟草产量和品质降低,同时还使土壤板结。某科研团队为获得抗逆性强的耐盐烟草品种,将抗盐基因H与质粒重组,再借助农杆菌导入烟草细胞中。请回答:(2)对图中的质粒和外源DNA进行切割时,所用的限制酶是________________________________________。图中的质粒A还应含有T-DNA,T-DNA的作用是_____________________________________________________________。
BamHⅠ和HindⅢ或EcRⅠ和HindⅢ
携带目的基因进入烟草细胞并整合到烟草细胞的染色体DNA上
【解析】(2)据图分析可知,因SmaⅠ会破坏目的基因,故不能选用该限制酶进行切割,故构建基因表达载体时需要限制酶HindⅢ和BamHⅠ或HindⅢ和EcRⅠ;Ti质粒上含有T-DNA,T-DNA的作用是携带目的基因进入烟草细胞并整合到烟草细胞的染色体DNA上。
1.烟草是我国重要的经济作物,其栽培容易受到气候、土壤等诸多生态因子的制约,因而烟草的栽培区域受到限制。土壤中的盐分是制约烟草生长的重要因素,它的含量过高不仅造成烟草产量和品质降低,同时还使土壤板结。某科研团队为获得抗逆性强的耐盐烟草品种,将抗盐基因H与质粒重组,再借助农杆菌导入烟草细胞中。请回答:(3)将抗盐基因H插入T-DNA上,导入用_________处理过的农杆菌。筛选转基因成功的烟草细胞,经过⑤和⑥过程得到转基因抗盐的烟草幼苗,该过程所应用的原理是__________________________。
植物细胞具有全能性
【解析】(3)农杆菌为微生物细胞,作为受体细胞时,应让其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,通常用Ca2+进行处理;经过⑤脱分化和⑥再分化过程得到转基因抗盐的烟草幼苗,该过程所应用的原理是植物细胞具有全能性。
1.烟草是我国重要的经济作物,其栽培容易受到气候、土壤等诸多生态因子的制约,因而烟草的栽培区域受到限制。土壤中的盐分是制约烟草生长的重要因素,它的含量过高不仅造成烟草产量和品质降低,同时还使土壤板结。某科研团队为获得抗逆性强的耐盐烟草品种,将抗盐基因H与质粒重组,再借助农杆菌导入烟草细胞中。请回答:(4)若要获得抗盐能力更强的抗盐基因,可以对基因H进行改造,最终得到相应的蛋白质,该过程可以通过蛋白质工程完成,该过程的基本思路是__________________________________________________________________________________________________________________________。
①预期耐盐蛋白质的功能,②设计耐盐蛋白质的结构,
③推测应有的氨基酸序列,④找到并改变对应的基因序列,
【解析】(4)若要获得抗盐能力更强的抗盐基因,可以对基因H进行改造,最终得到相应的蛋白质,该过程可以通过蛋白质工程完成,基本思路是:①预期耐盐蛋白质的功能;②设计耐盐蛋白质的结构;③推测应有的氨基酸序列;④找到并改变对应的基因序列;⑤获得所需要的蛋白质。
【易错警示】启动子、终止子、起始密码子、终止密码子比较
2.玉米是世界上的第三大粮食作物,广泛种植于世界各地。研究表明,转基因抗虫玉米中的抗虫基因是从细菌中分离出的Bt毒蛋白基因,这种基因编码的蛋白质会进入害虫的肠道,能有效杀死玉米螟(一种农业害虫)。结合上述资料请回答下列问题:(1)Bt毒蛋白基因在基因工程中称为________________,其除这种编码蛋白质的基因外,还可以是____________________________;在构建基因表达载体的过程中,除要有Bt毒蛋白基因外,还必须有启动子、终止子和________________。 【解析】(1)Bt毒蛋白基因在基因工程中被称为目的基因;基因工程中的目的基因除这种编码蛋白质的基因外,还可以是具有调控作用的因子,构建目的基因表达载体,需要目的基因、启动子、终止子以及标记基因,标记基因的作用是为了筛选成功导入目的基因的受体细胞。
具有调控作用的因子
2.玉米是世界上的第三大粮食作物,广泛种植于世界各地。研究表明,转基因抗虫玉米中的抗虫基因是从细菌中分离出的Bt毒蛋白基因,这种基因编码的蛋白质会进入害虫的肠道,能有效杀死玉米螟(一种农业害虫)。结合上述资料请回答下列问题:(2)在利用PCR技术扩增Bt毒蛋白基因时,需要提供模板、原料、引物、________________________________________等条件,缓冲液中Mg2+的作用是_____________________。 【解析】(2)在利用PCR技术扩增Bt毒蛋白基因时,需要提供模板、原料、引物和耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)等条件,DNA聚合酶需要Mg2+激活。
耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)
激活DNA聚合酶
2.玉米是世界上的第三大粮食作物,广泛种植于世界各地。研究表明,转基因抗虫玉米中的抗虫基因是从细菌中分离出的Bt毒蛋白基因,这种基因编码的蛋白质会进入害虫的肠道,能有效杀死玉米螟(一种农业害虫)。结合上述资料请回答下列问题:(3)Bt毒蛋白基因与载体结合过程中需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶。若某限制酶的识别序列和切割位点是 ,请写出Bt毒蛋白基因被限制酶切割后所形成的黏性末端:__________________,DNA连接酶对所连接的两端碱基序列__________ (填“有”或“没有”)专一性要求。
2.玉米是世界上的第三大粮食作物,广泛种植于世界各地。研究表明,转基因抗虫玉米中的抗虫基因是从细菌中分离出的Bt毒蛋白基因,这种基因编码的蛋白质会进入害虫的肠道,能有效杀死玉米螟(一种农业害虫)。结合上述资料请回答下列问题:(4)为了防止抗虫玉米通过花粉传播带来的生态学问题,科研小组考虑将抗虫基因导入玉米根尖细胞的____________中以防止基因污染,同时在大规模种植的抗虫玉米田中设置一个或多个区域来种植普通玉米,目的是__________________________________________________________________。
延缓抗毒蛋白的玉米螟出
现(或减缓害虫抗性基因频率增加的速度)
【解析】(4)为了防止抗虫玉米通过花粉传播带来的生态学问题,科研小组考虑将抗虫基因导入玉米根尖细胞的线粒体中以防止基因污染,这样可以避免目的基因随着花粉传播到近源物种中,同时在大规模种植的抗虫玉米田中设置一个或多个种植普通玉米的区域,这样可以给玉米螟提供普通玉米食物,目的是延缓抗毒蛋白的玉米螟出现(或减缓害虫抗性基因频率增加的速度)。
【感悟高考】1.(2023·湖北选择考)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同B.若用PυuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
【解析】选D。本题考查基因工程相关知识。若用HindⅢ酶切,目的基因的插入方向可正可反,所以转录的产物可能不同,A正确;若用PυuⅠ酶切,重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR),所以在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因,B正确;DNA凝胶电泳技术可以分离大小不同的DNA片段,重组质粒的大小与质粒不同,能够鉴定重组质粒构建成功与否,C正确;SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中,若用SphⅠ酶切,重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR),因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落,在含Tet的培养基中不能形成菌落,D错误。
2.(2023·广东选择考)“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是( )A.裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质B.分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等C.沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度D.鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
【解析】选D。裂解是加蒸馏水让细胞吸水涨破,释放出DNA等物质,A正确;DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,能溶于2 ml/L的NaCl溶液,将溶液过滤,即可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离,B正确;DNA不溶于酒精,而某些蛋白质溶于酒精,可以反复多次用酒精沉淀出DNA,提高DNA纯度,C正确;将DNA溶解于NaCl溶液,加入二苯胺试剂,沸水浴5 min,待冷却后,能呈现蓝色,D错误。
3.(2021·山东等级考)粗提取 DNA 时,向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤,在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是( )A.加入适量的木瓜蛋白酶B.在37～40 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟C.加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精D.加入 NaCl 调节浓度至 2 ml/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0.14 ml/L
【解析】选A。木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质,由于酶具有专一性,不能水解DNA,过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物,A正确;在37～40 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟不能去除滤液中的杂质,应该放在60～75 ℃的水浴箱中保温 10～15 分钟,使蛋白质变性析出,B错误;向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌,过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精,此时DNA析出,不会进入滤液中,C错误;加入 NaCl 调节浓度至 2 ml/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0.14 ml/L, DNA在此溶液中溶解度小而析出,不会进入滤液中,D错误。
【加固训练】(2023·广东选择考)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。回答下列问题:(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与______________植株的种子大小相近。 【解析】(1)根据题干信息可知,突变后的基因为隐性基因,则野生型DAI基因为显性基因,因此采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。
(2023·广东选择考)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。回答下列问题:(2)用PCR反应扩增DAI基因,用限制性内切核酸酶对PCR产物和__________进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DAI基因可以正常表达,其上下游序列需具备______________________。 【解析】(2)利用PCR技术扩增DAI基因后,应该用同种限制性内切核酸酶对DAI基因和载体进行切割,再用DNA连接酶将两者连接起来。在基因表达载体中,启动子位于目的基因的首端,终止子位于目的基因的尾端,因此为确保插入的DAI基因可以正常表达,其上下游序列需具备启动子和终止子。
(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图),用于后续验证突变基因与表型的关系。①农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_______________________________。 ②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约________%的培养基中幼苗继续培养。
DAI基因和卡那霉素抗性基因
③将②中选出的T2代阳性植株__________(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性内切核酸酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息如下,在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
【解析】(3)①根据题中信息和图形分析,将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T-DNA上含有DAI基因和卡那霉素抗性基因)菌液中转化,再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上,若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体,则说明含有卡那霉素抗性基因,即表示其基因组中插入DAI基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DAI基因,由于T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点,所以不确定是单一位点插入还是多位点插入,若是单一位点插入,相当于一对等位基因的杂合子,其自交后代应该出现3∶1的性状分离比,而题目要求选出单一位点插入的植株,因此应该选择阳性率约75%的培养基中幼苗继续培养。
③将以上获得的T2代阳性植株自交,再将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上,若某培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的植株,即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据图形分析,野生型和突变型基因片段的长度都是150 bp,野生型的基因没有限制酶X的切割位点,而突变型的基因有限制酶X的切割位点,结合图中的数据分析可知,电泳图中野生型只有150 bp,突变型有50 bp和100 bp,如图:
【预测高考】锁定新情境:靶向基因操作技术 TALEN是一种靶向基因操作技术,该技术利用了TAL靶向识别单元对靶向基因的识别作用和Fk1蛋白对靶向基因的切割作用实现了对特定靶向基因的敲除。相关操作如下:TAL靶向识别单元的构建。TAL靶向识别单元为间隔32个氨基酸的双连氨基酸(即两个相连的氨基酸)序列。不同的双连氨基酸分别与靶向基因中的A、T、C、G有恒定的对应关系,根据靶向基因的碱基序列可以设计出双连氨基酸序列。
基于核心素养的新考向:1.(结构与功能观)目的基因的获取与扩增。根据TAL靶向识别单元中双连氨基酸序列和Fk1蛋白的氨基酸序列,可按照 _________________________________________________________________________________________, 最终合成目的基因(写出具体步骤)。再通过PCR技术进行扩增。扩增前,需根据目的基因的核苷酸序列设计出___________种引物;扩增时,需先加热至90～95 ℃,再冷却至50～60 ℃,再加热至70～75 ℃,此操作的目的是_____________________________________________________________________________________________________________。
先推测出mRNA序列,再推测出目的基因
的脱氧核苷酸序列,利用化学法以单个脱氧核苷酸为原料
加热使DNA变性后解聚为
单链,冷却使引物结合到互补DNA链上,再加热促进DNA聚合酶发挥作用,开始互
【解析】1.已知TAL靶向识别单元中双连氨基酸序列和Fk1蛋白的氨基酸序列,可先推测出mRNA序列,再推测出目的基因的脱氧核苷酸序列,然后利用化学法以单个脱氧核苷酸为原料,最终合成目的基因,再通过PCR技术进行扩增。PCR扩增前,需根据目的基因的核苷酸序列设计出2种引物;扩增时,需先加热至90～95 ℃使DNA变性后解聚为单链,再冷却至50～60 ℃使引物结合到互补DNA链上,再加热至70～75 ℃促进DNA聚合酶发挥作用,开始互补链的合成。
2.(归纳与概括)利用质粒和目的基因构建基因表达载体。在构建的基因表达载体中,启动子应位于基因的上游,它是_____________________________的部位;标记基因的作用是___________________________。 【解析】2.在构建的基因表达载体中,启动子位于基因的首端,它是RNA聚合酶识别和结合的部位;标记基因的作用是便于重组DNA分子的筛选。
RNA聚合酶识别和结合
便于重组DNA分子的筛选
3.(分析与比较)目的基因的表达与检测。目的基因进入受体细胞后,在受体细胞中维持稳定和表达的过程,称为__________。从分子水平上,通过_____________________________________方法可检测基因工程操作是否成功。 【解析】3.目的基因进入受体细胞后,在受体细胞中维持稳定和表达的过程,称为转化。分子水平上的检测:①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入目的基因用PCR技术;②检测目的基因是否转录出了mRNA用PCR技术;③检测目的基因是否翻译成蛋白质用抗原—抗体杂交技术。
杂交(或PCR技术)
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