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2025届高考 一轮复习 浙科版 基因工程的理论基础及技术基础 课件(浙江版)
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这是一份2025届高考 一轮复习 浙科版 基因工程的理论基础及技术基础 课件(浙江版)，共60页。PPT课件主要包含了本单元内容索引，脂质和蛋白质，参与纺锤体的形成等内容，欢迎下载使用。
5.1 基因工程是一种重组DNA技术5.1.1 概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的5.1.2 阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具5.1.3 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤5.1.4 举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质
5.2 蛋白质工程是基因工程的延伸5.2.1 概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质5.2.2 举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程6.1 转基因产品的安全性引发社会的广泛关注6.1.1 举例说出日常生活中的转基因产品6.1.2 探讨转基因技术在应用过程中带来的影响
6.2 中国禁止生殖性克隆人6.2.1 举例说出生殖性克隆人面临的伦理问题6.2.2 分析说明我国为什么不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验6.3 世界范围内应全面禁止生物武器6.3.1 举例说明历史上生物武器对人类造成了严重的威胁与伤害6.3.2 认同我国反对生物武器及其技术和设备的扩散
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第1讲 基因工程的理论基础及技术基础第2讲 基因工程的步骤、应用及其安全性问题
第1讲 基因工程的理论基础及技术基础
精读课本 盘点基础知识
一、基因工程是在多个生物学分支学科的基础上发展而来1．基因工程的概念：是指有意识地把一个人们所需要的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的________或____________的技术。基因工程的核心是___________________，早期也将基因工程称为_____________。
2．对基因工程概念的理解
3．基因工程得以诞生的理论基础
问题与思考1．为什么人的胰岛素原基因能拼接到大肠杆菌的质粒上，并且在大肠杆菌中仍能表达产生人胰岛素原？[提示] (1)两种生物都以DNA为遗传物质，并且DNA的结构基础相同，都是规则的双螺旋结构。(2)两种生物共用一套遗传密码，并且遗传信息的传递都遵循中心法则。
二、对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础1．限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”(1)来源及化学本质：主要是从____等微生物中分离纯化出来的，化学本质是______。(2)功能：识别双链DNA上______________________，并催化其中特定的两个核苷酸之间的__________水解。(3)作用特点①特异性，即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列，并切割特定的位点。②沿着脱氧核苷酸链的______方向读取。③所识别的DNA序列多数为________。
特定的一小段核苷酸序列
(4)结果：切割DNA分子成为___________DNA片段，并产生________或______(如图所示)。
切割DNA分子时产生的两种不同末端(箭头表示酶的切割位置)
问题与思考2．原核生物中存在限制酶的意义是什么？[提示] 原核生物中限制酶的作用是破坏外源DNA以保证自身安全，防止外来病原体的危害。3．限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？[提示] 限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
2．DNA连接酶——“分子缝合针”
3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(1)类型①最常用的载体是____，它是分布在微生物体内(如大肠杆菌、农杆菌等)的一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链_________________。②还有______(受体细胞是细菌)、动植物病毒(受体细胞是动植物细胞)。(2)质粒适合作载体的特点(载体必须具备的特点)①所有的载体都应该对受体细胞____，并且具有容易侵入受体细胞的特点。②有__________限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中，但对一种限制酶而言，最好只有____个酶切位点。③能在受体细胞中进行______________，或可整合到受体细胞染色体DNA上。④这些质粒上常有特殊的________，如抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等，便于对重组细胞的____和____。
问题与思考4．为什么说对一种限制酶而言，最好只有1～2个酶切位点？[提示] 如果同一种酶有多个酶切位点，会将载体切成许多片段，破坏载体的功能。5．什么样的基因可以作为标记基因？[提示] 具有筛选或鉴别作用的基因，如抗生素抗性基因、荧光蛋白基因、使菌落显色的基因等。6．基因工程中的载体与细胞膜上参与物质运输的载体有何不同？[提示] 基因工程中的载体通常是质粒，还有噬菌体、动植物病毒等，其本质是DNA，能将目的基因导入受体细胞内；细胞膜上的载体是蛋白质，与细胞膜的运输功能有关。
三、活动：DNA的粗提取和鉴定(一)实验原理1．提取DNA的原理(1)用_____(十二烷基硫酸钠)处理材料，能使_____________并与DNA____；EDTA(乙二胺四乙酸二钠)能________________，防止核DNA被酶解。(2)DNA在________的NaCl溶液中溶解度高，且Na＋与DNA形成____；DNA钠盐______酒精而某些蛋白质能溶于酒精。2．鉴定DNA的原理：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成____。
(二)材料用具1．选材：DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。2．试剂(1)研磨液——含有______、_____、Tris和HCl。(2)体积分数为____的冷酒精——析出DNA。(3)2 ml/L的NaCl溶液——_________。(4)二苯胺试剂——_________，要现配现用。(5)蒸馏水。
[注意点] (1)原则上凡是含有DNA的生物材料都可以用于提取DNA，但是，不同生物的组织中DNA含量不同。选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。(2)如果以菜花为实验材料，由于它的硬度较高，容易出现研磨不充分的情况，需要延长研磨的时间。如果以洋葱为实验材料，它的气味相对刺激，可以为学生准备护目镜，并注意通风。不同的实验材料，其DNA的含量有所差别，香蕉、草莓、鱼白等材料中的DNA含量较高。(3)DNA遇二苯胺会被染成蓝色。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。(4)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
四、活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定(一)聚合酶链式反应(PCR)1．概念：是在DNA聚合酶作用下，在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物学技术。2．PCR技术原理与条件
[注意点] (1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。(2)引物既可以是DNA单链，也可以是RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。(4)PCR的扩增结果：DNA分子以指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环次数)。
3．PCR技术的过程：由________________三个基本反应步骤构成。(1)________：模板DNA经加热至90～95 ℃一定时间后，使模板DNA双链解旋，成为2条单链DNA，以便它与引物结合。(2)________：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50～60 ℃，使2个引物分别与模板DNA链___端的相应序列互补配对。(3)________：将反应体系升温至72 ℃左右，在耐高温的Taq DNA聚合酶的催化作用下，以4种脱氧核苷三磷酸为原料，将单个脱氧核苷酸加到引物的3′端上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的单链DNA。
重复循环变性—退火—延伸3个步骤，就可获得更多的完整DNA分子，而且这种新链又可成为下次循环的模板，如下图所示。
4．PCR扩增DNA片段实验过程中的材料与相关试剂
5．PCR实验操作步骤
问题与思考7．哪些因素会影响变性温度和变性时间？[提示] 模板DNA的碱基组成(C、G含量)及DNA分子的长度。8．变性温度过高或时间过长会造成什么影响？[提示] 降低Taq DNA聚合酶活性。9．PCR技术中为什么需要引物？[提示] 因为DNA聚合酶只能将单个的脱氧核苷酸加到已有的片段上。10．如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？[提示] 根据目的基因两端(3′端)的核苷酸序列设计引物对。
11．两个引物分别与DNA链的哪一端的碱基互补？为什么？[提示] 与DNA链的3′端的碱基互补，因为DNA复制时，子链只能从5′→3′的方向延伸。12．退火温度的设定与引物的哪些方面有关？[提示] 引物碱基组成(C、G含量)，引物长度。13．退火温度过高或过低会造成什么影响？[提示] 温度过高，引物与模板难以结合，甚至无扩增产物；温度过低，引物与模板易发生非特异性结合，导致扩增出多种长度的DNA片段。
14．延伸的温度、时间与什么有关？[提示] 酶的种类和片段长度，温度对酶的活性影响很大，温度过高产物易变性，不稳定；温度过低，易错配，产物特异性降低。15．PCR技术能不能将一个目的基因从DNA长链中分离出来？如果能，需要至少循环到第几次时，可以获得完整的目的基因？[提示] 能，循环到第3次时，即可获得完整的目的基因。
(二)凝胶电泳技术1．电泳的概念：是指带电粒子在电场作用下，向与其携带电荷____的电极迁移的过程。2．原理(1)核酸是带负电的生物大分子，其迁移速率主要受核酸片段____的影响，还与____________________________等有关，在电场强度一定时，核酸分子越大，向正极迁移速率____。(2)电泳时常使用____作为介质，凝胶的孔隙可起到______的作用。(3)DNA本身是无色的，可以用____________染料对DNA进行标记，或使用________将DNA染成蓝色。3．作用：该技术是________________核酸或蛋白质的常用方法。
凝胶的浓度、DNA分子的构象
4．凝胶电泳实验过程中的材料与相关试剂
5．DNA片段的电泳鉴定方法步骤配制琼脂糖溶液→制备琼脂糖凝胶→加样→电泳→染色→观察→记录。
[注意点] (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。(2)该实验所需材料可以直接购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。(5)电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越大，迁移速率越慢，DNA分子的相对分子质量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。(6)观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
内化知识 突破重点难点
一、图解限制酶的选择原则甲 乙(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶。(4)农杆菌Ti质粒，限制酶的切割位点应该要在T-DNA中，因为目的基因只能随着T-DNA进入植物细胞，并整合到染色体DNA中。如：下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。
例1 (2021·辽宁选择性考试)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因)，大小为0.9 kb(1 kb＝1000碱基对)，利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：(1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经_____________过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入____________和____________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用__________________(填“E.cli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。
相关限制酶的识别序列及切割位点
注：箭头表示切割位点。
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于____________的生理状态，以提高转化效率。(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取单菌落(分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒，用(2)中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2，_____号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2 kb的DNA分子条带未出现在图中。
(5)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期(示意图见图3)不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的________(填“G1”“S”或“G2/M”)期。
注：间期包括G1期、S期和G2期。
注：G2/M表示G2期和M期。
二、与DNA、RNA相关酶的分析比较
例2 (2021·湖北选择性考试)限制性内切核酸酶EcRⅠ识别并切割 双链DNA，用EcRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为( )A．6 B．250 C．4000 D．24000[解析] 据题可知，EcRⅠ的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4＝1/4096，4096≈4000，4000个碱基对可能出现一个限制酶EcRⅠ的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为4000。C符合题意。
三、PCR技术的拓展与应用
例3 (2022·江苏选择性考试)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。(1)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由_____________组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是________________。(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 ml/L的目的是_____________。PCR扩增时，需在__________________________催化下，在引物____端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒(在EcRⅤ识别位点插入片段)。请完成下表。
部可能含有X蛋白特异性结合的物质
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经_________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的____倍。
延伸迁移 实现融会贯通
考向1 围绕基因工程的理论基础与基本工具，考查科学思维素养1．下列关于限制性内切核酸酶的叙述，正确的是( )A．限制性内切核酸酶主要从真核生物中提取B．限制性内切核酸酶能识别和切割RNAC．限制性内切核酸酶能识别任意的核苷酸序列D．限制性内切核酸酶切割DNA后可以形成黏性末端或平末端D [限制性内切核酸酶主要从某些原核生物中提取，A错误；限制性内切核酸酶能识别和切割DNA，B错误；限制性内切核酸酶具有专一性，能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，C错误；限制性内切核酸酶切割DNA后可以形成黏性末端或平末端，D正确。]
2．(2023·绍兴市选考科目诊断性考试)限制性内切核酸酶SalⅠ和XhⅠ识别序列与切割位点如下图1。用SalⅠ切割目的基因两侧，用XhⅠ切割载体质粒，再用DNA连接酶处理可形成重组质粒。实验者用2种酶单独切割或同时切割普通质粒和重组质粒，再将产物电泳分离，其结果如下图2。下列叙述正确的是( )A．SalⅠ切割产生的黏性末端与XhⅠ切割产生的黏性末端不同B．根据重组质粒的酶切结果可知有2个目的基因插入重组质粒中C．重组质粒上有1个限制酶SalⅠ和1个限制酶XhⅠ的识别序列D．2种酶切后产生的2 kb产物可作为探针筛选含目的基因的受体细胞
C [SalⅠ切割产生的黏性末端与XhⅠ切割产生的黏性末端都是3′—AGCT—5′，A错误；普通质粒长度都是5 kb，用一种酶切割重组质粒得到的结果都是7 kb，用两种酶切割结果显示为5 kb和2 kb两个片段，说明有1个目的基因插入重组质粒中，B错误；由于用一种酶切割后只有一个片段，用两种酶切割结果显示为两个片段，说明重组质粒上有1个限制酶SalⅠ和1个限制酶XhⅠ的识别序列，C正确；2种酶切后产生的2 kb产物需要经过荧光标记，然后解链成为单链DNA分子才可以作为探针筛选含目的基因的受体细胞，D错误。]
3．(2021·全国乙卷改编)用重组DNA技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E.cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中______________酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA连接酶连接。上图中________________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA 连接酶连接。(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
EcRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcRⅤ
(3)重组DNA技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能_____________；质粒DNA分子上有________________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是____________________________________________________________________________。(4)表达载体含有启动子，启动子是指_______________________________________________________________________________。
一个或多个限制酶切位点
用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有
位于基因首端的一段特殊DNA序列，
是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
考向2 围绕基因工程的相关技术基础，考查科学思维素养4．(2022·山东等级考)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是( )A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质B [低温时，DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；粗提取的DNA中可能含有RNA、脂质、少量蛋白质，D正确。]
5．(2023·山东德州三模)在进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验时，下列有关操作的表述错误的是( )A．PCR反应体系中加入两种特异性引物以获得引物之间的DNA片段B．PCR不同循环过程中变性的温度及时间相同以使DNA充分解旋C．根据DNA片段大小配置一定质量分数的琼脂糖溶液以便分离DNA分子D．调节电泳缓冲液pH使DNA分子相关基团带电荷
B [利用PCR技术扩增目的基因时，由于DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，因此要用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增；引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列；因此PCR反应体系中加入两种特异性引物以获得引物之间的DNA片段，A正确。PCR不同循环过程中变性的温度及时间一般相同，但如果模板的G和C碱基含量较高，变性时间可能延长，以使DNA充分解旋，B错误。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，因此根据DNA片段大小配置一定质量分数的琼脂糖溶液以便分离DNA分子，C正确。DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，因此调节电泳缓冲液pH可使DNA分子相关基团带正电荷或负电荷，D正确。]
6．(2023·浙江6月选考)紫外线引发的DNA损伤，可通过“核苷酸切除修复(NER)”方式修复，机制如图所示。着色性干皮症(XP)患者的NER酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤出现炎症等症状。患者幼年发病，20岁后开始发展成皮肤癌。下列叙述错误的是( )A．修复过程需要限制酶和DNA聚合酶B．填补缺口时，新链合成以5′到3′的方向进行C．DNA有害损伤发生后，在细胞增殖后进行修复，对细胞最有利D．随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释
5.1 基因工程是一种重组DNA技术5.1.1 概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的5.1.2 阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具5.1.3 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤5.1.4 举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质
5.2 蛋白质工程是基因工程的延伸5.2.1 概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质5.2.2 举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程6.1 转基因产品的安全性引发社会的广泛关注6.1.1 举例说出日常生活中的转基因产品6.1.2 探讨转基因技术在应用过程中带来的影响
6.2 中国禁止生殖性克隆人6.2.1 举例说出生殖性克隆人面临的伦理问题6.2.2 分析说明我国为什么不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验6.3 世界范围内应全面禁止生物武器6.3.1 举例说明历史上生物武器对人类造成了严重的威胁与伤害6.3.2 认同我国反对生物武器及其技术和设备的扩散
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第1讲 基因工程的理论基础及技术基础第2讲 基因工程的步骤、应用及其安全性问题
第1讲 基因工程的理论基础及技术基础
精读课本 盘点基础知识
一、基因工程是在多个生物学分支学科的基础上发展而来1．基因工程的概念：是指有意识地把一个人们所需要的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的________或____________的技术。基因工程的核心是___________________，早期也将基因工程称为_____________。
2．对基因工程概念的理解
3．基因工程得以诞生的理论基础
问题与思考1．为什么人的胰岛素原基因能拼接到大肠杆菌的质粒上，并且在大肠杆菌中仍能表达产生人胰岛素原？[提示] (1)两种生物都以DNA为遗传物质，并且DNA的结构基础相同，都是规则的双螺旋结构。(2)两种生物共用一套遗传密码，并且遗传信息的传递都遵循中心法则。
二、对DNA进行剪切、连接和复制是实现重组DNA技术的基础1．限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”(1)来源及化学本质：主要是从____等微生物中分离纯化出来的，化学本质是______。(2)功能：识别双链DNA上______________________，并催化其中特定的两个核苷酸之间的__________水解。(3)作用特点①特异性，即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列，并切割特定的位点。②沿着脱氧核苷酸链的______方向读取。③所识别的DNA序列多数为________。
特定的一小段核苷酸序列
(4)结果：切割DNA分子成为___________DNA片段，并产生________或______(如图所示)。
切割DNA分子时产生的两种不同末端(箭头表示酶的切割位置)
问题与思考2．原核生物中存在限制酶的意义是什么？[提示] 原核生物中限制酶的作用是破坏外源DNA以保证自身安全，防止外来病原体的危害。3．限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？[提示] 限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
2．DNA连接酶——“分子缝合针”
3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(1)类型①最常用的载体是____，它是分布在微生物体内(如大肠杆菌、农杆菌等)的一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核之外，并具有自我复制能力的双链_________________。②还有______(受体细胞是细菌)、动植物病毒(受体细胞是动植物细胞)。(2)质粒适合作载体的特点(载体必须具备的特点)①所有的载体都应该对受体细胞____，并且具有容易侵入受体细胞的特点。②有__________限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中，但对一种限制酶而言，最好只有____个酶切位点。③能在受体细胞中进行______________，或可整合到受体细胞染色体DNA上。④这些质粒上常有特殊的________，如抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等，便于对重组细胞的____和____。
问题与思考4．为什么说对一种限制酶而言，最好只有1～2个酶切位点？[提示] 如果同一种酶有多个酶切位点，会将载体切成许多片段，破坏载体的功能。5．什么样的基因可以作为标记基因？[提示] 具有筛选或鉴别作用的基因，如抗生素抗性基因、荧光蛋白基因、使菌落显色的基因等。6．基因工程中的载体与细胞膜上参与物质运输的载体有何不同？[提示] 基因工程中的载体通常是质粒，还有噬菌体、动植物病毒等，其本质是DNA，能将目的基因导入受体细胞内；细胞膜上的载体是蛋白质，与细胞膜的运输功能有关。
三、活动：DNA的粗提取和鉴定(一)实验原理1．提取DNA的原理(1)用_____(十二烷基硫酸钠)处理材料，能使_____________并与DNA____；EDTA(乙二胺四乙酸二钠)能________________，防止核DNA被酶解。(2)DNA在________的NaCl溶液中溶解度高，且Na＋与DNA形成____；DNA钠盐______酒精而某些蛋白质能溶于酒精。2．鉴定DNA的原理：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成____。
(二)材料用具1．选材：DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。2．试剂(1)研磨液——含有______、_____、Tris和HCl。(2)体积分数为____的冷酒精——析出DNA。(3)2 ml/L的NaCl溶液——_________。(4)二苯胺试剂——_________，要现配现用。(5)蒸馏水。
[注意点] (1)原则上凡是含有DNA的生物材料都可以用于提取DNA，但是，不同生物的组织中DNA含量不同。选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。(2)如果以菜花为实验材料，由于它的硬度较高，容易出现研磨不充分的情况，需要延长研磨的时间。如果以洋葱为实验材料，它的气味相对刺激，可以为学生准备护目镜，并注意通风。不同的实验材料，其DNA的含量有所差别，香蕉、草莓、鱼白等材料中的DNA含量较高。(3)DNA遇二苯胺会被染成蓝色。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。(4)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
四、活动：PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定(一)聚合酶链式反应(PCR)1．概念：是在DNA聚合酶作用下，在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物学技术。2．PCR技术原理与条件
[注意点] (1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。(2)引物既可以是DNA单链，也可以是RNA单链。细胞内的DNA进行复制时，也需要引物，一般为RNA片段。(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。(4)PCR的扩增结果：DNA分子以指数形式扩增(约为2n，其中n为扩增循环次数)。
3．PCR技术的过程：由________________三个基本反应步骤构成。(1)________：模板DNA经加热至90～95 ℃一定时间后，使模板DNA双链解旋，成为2条单链DNA，以便它与引物结合。(2)________：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至50～60 ℃，使2个引物分别与模板DNA链___端的相应序列互补配对。(3)________：将反应体系升温至72 ℃左右，在耐高温的Taq DNA聚合酶的催化作用下，以4种脱氧核苷三磷酸为原料，将单个脱氧核苷酸加到引物的3′端上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的单链DNA。
重复循环变性—退火—延伸3个步骤，就可获得更多的完整DNA分子，而且这种新链又可成为下次循环的模板，如下图所示。
4．PCR扩增DNA片段实验过程中的材料与相关试剂
5．PCR实验操作步骤
问题与思考7．哪些因素会影响变性温度和变性时间？[提示] 模板DNA的碱基组成(C、G含量)及DNA分子的长度。8．变性温度过高或时间过长会造成什么影响？[提示] 降低Taq DNA聚合酶活性。9．PCR技术中为什么需要引物？[提示] 因为DNA聚合酶只能将单个的脱氧核苷酸加到已有的片段上。10．如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？[提示] 根据目的基因两端(3′端)的核苷酸序列设计引物对。
11．两个引物分别与DNA链的哪一端的碱基互补？为什么？[提示] 与DNA链的3′端的碱基互补，因为DNA复制时，子链只能从5′→3′的方向延伸。12．退火温度的设定与引物的哪些方面有关？[提示] 引物碱基组成(C、G含量)，引物长度。13．退火温度过高或过低会造成什么影响？[提示] 温度过高，引物与模板难以结合，甚至无扩增产物；温度过低，引物与模板易发生非特异性结合，导致扩增出多种长度的DNA片段。
14．延伸的温度、时间与什么有关？[提示] 酶的种类和片段长度，温度对酶的活性影响很大，温度过高产物易变性，不稳定；温度过低，易错配，产物特异性降低。15．PCR技术能不能将一个目的基因从DNA长链中分离出来？如果能，需要至少循环到第几次时，可以获得完整的目的基因？[提示] 能，循环到第3次时，即可获得完整的目的基因。
(二)凝胶电泳技术1．电泳的概念：是指带电粒子在电场作用下，向与其携带电荷____的电极迁移的过程。2．原理(1)核酸是带负电的生物大分子，其迁移速率主要受核酸片段____的影响，还与____________________________等有关，在电场强度一定时，核酸分子越大，向正极迁移速率____。(2)电泳时常使用____作为介质，凝胶的孔隙可起到______的作用。(3)DNA本身是无色的，可以用____________染料对DNA进行标记，或使用________将DNA染成蓝色。3．作用：该技术是________________核酸或蛋白质的常用方法。
凝胶的浓度、DNA分子的构象
4．凝胶电泳实验过程中的材料与相关试剂
5．DNA片段的电泳鉴定方法步骤配制琼脂糖溶液→制备琼脂糖凝胶→加样→电泳→染色→观察→记录。
[注意点] (1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。(2)该实验所需材料可以直接购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。(5)电泳时，DNA分子的相对分子质量越大，受到的阻力越大，迁移速率越慢，DNA分子的相对分子质量越小，受到的阻力越小，迁移速率越快。(6)观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
内化知识 突破重点难点
一、图解限制酶的选择原则甲 乙(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcRⅠ两种限制酶。(4)农杆菌Ti质粒，限制酶的切割位点应该要在T-DNA中，因为目的基因只能随着T-DNA进入植物细胞，并整合到染色体DNA中。如：下图中甲、乙、丁，Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。
例1 (2021·辽宁选择性考试)PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列(简称phb2基因)，大小为0.9 kb(1 kb＝1000碱基对)，利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：(1)为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经_____________过程得到cDNA，将其作为PCR反应的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
(2)图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因(该基因序列不含图1中限制酶的识别序列)与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入____________和____________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用__________________(填“E.cli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。
相关限制酶的识别序列及切割位点
注：箭头表示切割位点。
(3)转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于____________的生理状态，以提高转化效率。(4)将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取单菌落(分别编号为1、2、3、4)培养并提取质粒，用(2)中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电泳分离，结果如图2，_____号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0.2 kb的DNA分子条带未出现在图中。
(5)将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期(示意图见图3)不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的________(填“G1”“S”或“G2/M”)期。
注：间期包括G1期、S期和G2期。
注：G2/M表示G2期和M期。
二、与DNA、RNA相关酶的分析比较
例2 (2021·湖北选择性考试)限制性内切核酸酶EcRⅠ识别并切割 双链DNA，用EcRⅠ完全酶切果蝇基因组DNA，理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为( )A．6 B．250 C．4000 D．24000[解析] 据题可知，EcRⅠ的酶切位点有6个碱基对，由于DNA分子的碱基组成为A、T、G、C，则某一位点出现该序列的概率为1/4×1/4×1/4×1/4×1/4×1/4＝1/4096，4096≈4000，4000个碱基对可能出现一个限制酶EcRⅠ的酶切位点，故理论上得到DNA片段的平均长度(碱基对)约为4000。C符合题意。
三、PCR技术的拓展与应用
例3 (2022·江苏选择性考试)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引起多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题。(1)纤毛结构如图Ⅰ所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由_____________组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是________________。(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 ml/L的目的是_____________。PCR扩增时，需在__________________________催化下，在引物____端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可示其在细胞内位置。将X-GFP基因融合片段M导入如图Ⅱ所示载体质粒Y，构建Y-M重组质粒(在EcRⅤ识别位点插入片段)。请完成下表。
部可能含有X蛋白特异性结合的物质
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经_________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的____倍。
延伸迁移 实现融会贯通
考向1 围绕基因工程的理论基础与基本工具，考查科学思维素养1．下列关于限制性内切核酸酶的叙述，正确的是( )A．限制性内切核酸酶主要从真核生物中提取B．限制性内切核酸酶能识别和切割RNAC．限制性内切核酸酶能识别任意的核苷酸序列D．限制性内切核酸酶切割DNA后可以形成黏性末端或平末端D [限制性内切核酸酶主要从某些原核生物中提取，A错误；限制性内切核酸酶能识别和切割DNA，B错误；限制性内切核酸酶具有专一性，能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，C错误；限制性内切核酸酶切割DNA后可以形成黏性末端或平末端，D正确。]
2．(2023·绍兴市选考科目诊断性考试)限制性内切核酸酶SalⅠ和XhⅠ识别序列与切割位点如下图1。用SalⅠ切割目的基因两侧，用XhⅠ切割载体质粒，再用DNA连接酶处理可形成重组质粒。实验者用2种酶单独切割或同时切割普通质粒和重组质粒，再将产物电泳分离，其结果如下图2。下列叙述正确的是( )A．SalⅠ切割产生的黏性末端与XhⅠ切割产生的黏性末端不同B．根据重组质粒的酶切结果可知有2个目的基因插入重组质粒中C．重组质粒上有1个限制酶SalⅠ和1个限制酶XhⅠ的识别序列D．2种酶切后产生的2 kb产物可作为探针筛选含目的基因的受体细胞
C [SalⅠ切割产生的黏性末端与XhⅠ切割产生的黏性末端都是3′—AGCT—5′，A错误；普通质粒长度都是5 kb，用一种酶切割重组质粒得到的结果都是7 kb，用两种酶切割结果显示为5 kb和2 kb两个片段，说明有1个目的基因插入重组质粒中，B错误；由于用一种酶切割后只有一个片段，用两种酶切割结果显示为两个片段，说明重组质粒上有1个限制酶SalⅠ和1个限制酶XhⅠ的识别序列，C正确；2种酶切后产生的2 kb产物需要经过荧光标记，然后解链成为单链DNA分子才可以作为探针筛选含目的基因的受体细胞，D错误。]
3．(2021·全国乙卷改编)用重组DNA技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。回答下列问题：(1)常用的DNA连接酶有E.cli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。上图中______________酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA连接酶连接。上图中________________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA 连接酶连接。(2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
EcRⅠ、PstⅠ、SmaⅠ和EcRⅤ
(3)重组DNA技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能_____________；质粒DNA分子上有________________________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因)，利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是____________________________________________________________________________。(4)表达载体含有启动子，启动子是指_______________________________________________________________________________。
一个或多个限制酶切位点
用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有
位于基因首端的一段特殊DNA序列，
是RNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程
考向2 围绕基因工程的相关技术基础，考查科学思维素养4．(2022·山东等级考)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是( )A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质B [低温时，DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；粗提取的DNA中可能含有RNA、脂质、少量蛋白质，D正确。]
5．(2023·山东德州三模)在进行DNA片段的扩增及电泳鉴定实验时，下列有关操作的表述错误的是( )A．PCR反应体系中加入两种特异性引物以获得引物之间的DNA片段B．PCR不同循环过程中变性的温度及时间相同以使DNA充分解旋C．根据DNA片段大小配置一定质量分数的琼脂糖溶液以便分离DNA分子D．调节电泳缓冲液pH使DNA分子相关基团带电荷
B [利用PCR技术扩增目的基因时，由于DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，因此要用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增；引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列；因此PCR反应体系中加入两种特异性引物以获得引物之间的DNA片段，A正确。PCR不同循环过程中变性的温度及时间一般相同，但如果模板的G和C碱基含量较高，变性时间可能延长，以使DNA充分解旋，B错误。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，因此根据DNA片段大小配置一定质量分数的琼脂糖溶液以便分离DNA分子，C正确。DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，因此调节电泳缓冲液pH可使DNA分子相关基团带正电荷或负电荷，D正确。]
6．(2023·浙江6月选考)紫外线引发的DNA损伤，可通过“核苷酸切除修复(NER)”方式修复，机制如图所示。着色性干皮症(XP)患者的NER酶系统存在缺陷，受阳光照射后，皮肤出现炎症等症状。患者幼年发病，20岁后开始发展成皮肤癌。下列叙述错误的是( )A．修复过程需要限制酶和DNA聚合酶B．填补缺口时，新链合成以5′到3′的方向进行C．DNA有害损伤发生后，在细胞增殖后进行修复，对细胞最有利D．随年龄增长，XP患者几乎都会发生皮肤癌的原因，可用突变累积解释
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