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    2025届高考生物一轮总复习选择性必修3第十单元生物技术与工程第51讲基因工程的基本工具和基本操作程序课件

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    这是一份2025届高考生物一轮总复习选择性必修3第十单元生物技术与工程第51讲基因工程的基本工具和基本操作程序课件,共60页。PPT课件主要包含了DNA分子,转基因,遗传特性,生物类型,基因重组,原核生物,特定核苷酸序列,磷酸二酯键,大肠杆菌,黏性末端等内容,欢迎下载使用。

    【课标要求】 1.阐明重组DNA技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.活动:(1)DNA的粗提取与鉴定。(2)DNA片段的扩增及电泳鉴定。
    考点一 重组DNA技术的基本工具 1.基因工程的概念
    2.重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(简称限制酶)。①主要来源:_______________________。②种类:分离的限制酶有______________种。③特点(专一性):识别双链DNA分子的___________________________。使每一条链中特定部位的_______________________断开。
    [易错提醒] 限制酶作用的化学键是磷酸二酯键,不是氢键;在切割含目的基因的DNA分子时,需用限制酶切割2次此DNA分子,产生4个末端。
    黏性末端和平末端
    [易错提醒] 与膜载体的区别:基因工程中的载体是DNA分子,能将目的基因导入受体细胞内,并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制;膜载体是蛋白质,与细胞膜的通透性有关。
    [教材命题点思考]1.天然的DNA分子是否可以直接用作基因工程载体?为什么?______________________________________________________________________________________________________________________________提示:不可以。含有复制原点、含有一种或多种限制酶的识别序列、有标记基因等特点的DNA分子才可以直接用作基因工程的载体。实际上,天然的DNA分子一般不完全具备上述条件,往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
    2.实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具,除具备普通质粒载体的条件外,还应具有的条件是_____________________________(答出2点即可)。提示:对靶细胞具有较高的转化效率、不能增殖、对细胞无害
    3.限制酶EcR Ⅰ只能识别序列—GAATTC—,并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcRⅠ的切点,请画出目的基因两侧被限制酶EcRⅠ切割后所形成的黏性末端。______________________________________________________________________________________________________________________________
    1.限制酶的选择原则(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。
    ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,以便将目的基因“切出”,如图可选择PstⅠ。②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,防止破坏目的基因,如图不能选择Sma Ⅰ。
    ③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图可选择用Pst Ⅰ和EcR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切割位点,而且这两种限制酶切割后不会完全破坏标记基因)。
    (2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。
    (3)根据Ti质粒的T­DNA片段选择限制酶,图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,丙Ti质粒宜选取(设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。
    2.标记基因的作用可用于检测目的基因是否导入受体细胞。
    1.(2023·高考新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
    下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(  )A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.cli DNA连接酶连接B.质粒用酶3切割,目的基因用酶1切割,用T4 DNA连接酶连接C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4 DNA连接酶连接D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.cli DNA连接酶连接
    解析:只用一种限制酶切割质粒和目的基因,会使质粒和目的基因发生自身环化或使目的基因在质粒中反向连接,A项不符合题意;用酶1切割目的基因,产生的是黏性末端,用酶3切割质粒,产生的是平末端,无法连接,B项不符合题意;质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后,可使用T4 DNA连接酶连接,使目的基因定向插入质粒中,C项符合题意;酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同,易导致目的基因和质粒自身环化或使目的基因在质粒中反向连接,并且用酶4切割会破坏标记基因,D项不符合题意。
    2.图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗性基因(TetR)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题:
    (1)EcRⅤ酶切位点为 ,EcRⅤ酶切出来的线性载体P1为_________末端。解析:由题图可知,EcR Ⅴ酶切出来的载体质粒为平末端。
    (2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理,在两端各添加了一个碱基为_____________的脱氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在___________酶作用下,形成重组质粒P3。解析:由题图可知,目的基因的两端各有一个游离的腺嘌呤脱氧核苷酸,由于载体P1为平末端,所以载体P1的两端应该各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸,这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P1连接起来。
    (3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌落,其生长情况见下表(“+”代表生长,“-”代表不生长)。根据表中结果判断,应选择的菌落是_________(填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是____________________________、_______________________。
    解析:由题图可知,构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏,所以导入目的基因的菌落只能在没有抗生素或含有氨苄青霉素的培养基中存活,故应该选B类菌落。A类菌落能在题表中条件下存活,说明导入的是P0质粒。C类菌落只能在无抗生素的培养基中存活,说明C类菌落没有导入质粒。
    (4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是______________。某学生尝试用图中另外一对引物,结果从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp 片段,原因是_____________________。
    解析:据题图分析,目的基因的外侧链只能用丙作引物,内侧链可用甲、乙作引物。如果用甲、丙作引物,则无论目的基因是否插入正确,都能通过PCR扩增大量目的基因,如果用乙、丙作为引物,当目的基因插入不正确(反向插入)时,乙、丙两引物都结合在外侧,PCR不能正常进行,因此选用乙、丙作为引物可以进行PCR鉴定。若扩增出的DNA片段为400 bp,则正好是目的基因反向连接后,外侧链用乙作引物,内侧链用甲作引物扩增出的片段。
    考点二 基因工程的基本操作程序 1.目的基因的筛选与获取(1)目的基因的获取方法:人工合成目的基因、利用___________________目的基因、通过构建基因文库来获取目的基因。
    (2)利用PCR获取和扩增目的基因。
    [易错提醒] 变性过程双链DNA解聚为单链不需要解旋酶。在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量;引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,作为新子链的合成起点,只能结合在母链的3′端,使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸;真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活,故PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。
    2.基因表达载体的构建——基因工程的核心
    在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代
    [易错提醒] 启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别
    [易错提醒] 若考虑两两相连,则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况:目的基因与目的基因连接;目的基因与质粒连接;质粒与质粒的连接,需筛选出重组质粒。
    3.将目的基因导入受体细胞(1)植物细胞。
    [易错提醒] 农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入:第一次拼接是指将目的基因拼接到Ti质粒的T­DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指将插入目的基因的T­DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上;第一次导入是指将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指将含目的基因的T­DNA导入受体细胞。导入的目的基因,可能存在于细胞质中,也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中,造成“基因污染”。
    (2)动物细胞:_________法,将目的基因注入动物的______________中。(3)原核生物:先用______________处理大肠杆菌细胞,使之处于一种能吸收周围环境中__________________的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中。
    4.目的基因的检测与鉴定
    [易错提醒] 分子水平检测是否插入了目的基因和是否转录出了mRNA时,都遵循碱基互补配对原则;都使用基因探针,探针是放射性同位素或荧光标记的含目的基因的单链DNA片段。
    [教材命题点思考]1.目前在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是什么?______________________________________________________________________________________________________________________________提示:在PCR过程中,要加热超过90 ℃,所以使用Taq DNA聚合酶,而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
    2.以mRNA为材料可以获得DNA,其原理是_____________________________________________________。提示:在逆转录酶的作用下,以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成DNA
    3.从受体细胞中分离纯化出目的蛋白,该蛋白作为抗原注入机体后,刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是_________,该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV,检测的原理是_________________________。提示:抗体 抗原、抗体特异性结合
    4.为确定转基因抗盐烟草是否培育成功,既要用__________________检测目的基因是否已插入,又要在个体水平上鉴定,后者的具体过程是________________________________________________________。提示:PCR技术 将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中,观察该烟草植株的生长状态
    [模型命题点思考]5.据图回答下列问题。
    (1)从图中可以看出,目的基因是______________________________,使用的载体是_________,将目的基因导入受体细胞的方法是_______________________。(2)若进行个体生物学水平的鉴定,则采用的方法是_________________________________________________________________________。提示:(1)Bt抗虫蛋白基因 Ti质粒 农杆菌转化法(2)用棉叶饲喂棉铃虫
    1.PCR循环图示与规律
    注:第三轮循环后,开始出现双链等长的目的基因片段。
    2.筛选出含有目的基因的受体细胞(1)原理:将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时,如果插入某种抗生素抗性基因内部,则会导致该抗生素抗性基因失活。如下图,目的基因插入四环素抗性基因内部,则四环素抗性基因失活。(2)被转化的细菌有三种:含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。
    (3)筛选方法:将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌,如下图1、2、3、4、5菌落,再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上,如下图能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落,如下图1、5菌落。最后,可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
    考向1 PCR及应用1.(2024·梅州联考)PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键,5′端无严格限制,可用于添加限制酶切点等序列,dNTP(四种脱氧核苷三磷酸)是DNA合成的原料。下列相关说法错误的是(  )A.图示环节所需的温度比上一个环节的低B.dNTP作为扩增的原料会依次连接到3′端C.Taq DNA聚合酶催化磷酸二酯键的形成D.经过1个循环后,获得的子代DNA的双链中脱氧核苷酸数量相同
    解析:题图中环节为引物与模板碱基互补配对,表示的是复性环节,复性的上一环节为变性,复性的温度(50 ℃左右)比变性的温度(90 ℃以上)低,A项正确;在PCR扩增中,子链延伸的方向是从5′端到3′端,所以dNTP作为扩增的原料会依次连接到3′端,B项正确;Taq DNA聚合酶能催化磷酸二酯键的形成,C项正确;由于两个引物均不在该片段的端点,因此一个循环后,得到的两个DNA片段中脱氧核苷酸的数量不一定相同,一般PCR第三轮才可以扩增出双链脱氧核苷酸数量相同的子代DNA,D项错误。
    2.重叠延伸PCR是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,经过多次PCR扩增,获得目的基因的方法。该技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、基因的定点诱变等方面具有广泛的应用前景,下图表示利用重叠延伸PCR技术扩增某目的基因的过程。下列叙述错误的是(  )
    A.引物中G+C的含量越高,引物与模板DNA结合的稳定性越高B.在第一阶段由于引物2和引物3发生碱基互补配对,因此两者置于不同反应系统中C.引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制后,共产生4种双链DNA分子D.在引物1、2组成的反应系统中,经第一阶段要形成图示双链DNA,至少要经过2次复制
    解析:C与G之间有3个氢键,A与T之间有2个氢键,因此引物中G+C的含量越高,引物与模板DNA结合的稳定性越高,A项正确;由题图可知,引物2和引物3分别作用于同一段DNA的两条链,二者会发生碱基互补配对,因此需将它们置于不同反应系统中,B项正确;引物1、2组成的反应系统和引物3、4组成的反应系统中均进行一次复制后,各产生2种双链DNA分子,由于引物1和引物4合成的DNA属于同一种DNA,因此共产生了3种双链DNA分子,C项错误;在引物1、2组成的反应系统中,经第一阶段要形成题图所示双链DNA,至少要经过2次复制,D项正确。
    考向2 基因工程的操作程序3.某质粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三种限制酶切割位点,同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程如下图所示。请回答下列问题:
    (1)将目的基因导入植物细胞,采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是__________________;该质粒含有一段特殊的DNA片段,称为_______。该方法中农杆菌的作用是________________________________________________________。(2)在构建重组质粒时,和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比,选用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ两种酶的好处是_________________________________________________________________________________________________。
    感染烟草细胞,把目的基因插入
    烟草细胞的染色体DNA上
    防止目的基因自连和质粒自连,以提高带有目的基因的重组质粒的合成效率,防止目的基因与质粒反向连接
    (3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素培养基上都可以生长繁殖,农杆菌中是否已有目的基因?_________(填“是”或“否”)。为什么?___________________________________________________。
    含有目的基因的质粒中抗四环素基因被破坏
    (4)将已经转化的农杆菌进行如下操作,筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养,长出菌落后,用无菌牙签挑取A上的单个菌落,分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上,一段时间后,菌落的生长状况如下图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中?请在图中相应的位置上圈出来。
    4.(2023·广东选择考)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变,筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序,发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。回答下列问题:(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与______________植株的种子大小相近。
    解析:据题干信息可知,突变体是由野生型DA1基因发生隐性突变形成的,采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株,若突变体表型确由隐性突变造成,由于转入的基因为显性基因,则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。
    (2)用PCR反应扩增DA1基因,用限制性内切核酸酶对PCR产物和_________ 进行切割,用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达,其上下游序列需具备__________________。解析:构建基因表达载体时,需要用限制性内切核酸酶对经过PCR扩增的DA1基因和作为载体的Ti质粒进行切割。为确保插入的DA1基因可以正常表达,DA1基因(目的基因)的上下游需具备启动子和终止子。
    (3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入,也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如下图所示),用于后续验证突变基因与表型的关系。
    ①农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_______________________________。②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约_________%的培养基中幼苗继续培养。
    DA1基因(和卡那霉素抗性
    ③将②中选出的T2代阳性植株______________(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性内切核酸酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息见下图,在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
    解析:①卡那霉素抗性基因为标记基因,标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。用农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在含有卡那霉素的培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了DA1基因(和卡那霉素抗性基因)。②假设DA1基因用A表示,结合题中信息可知,T1代中能在含有卡那霉素的培养基上生长的植株的基因型为Aa或AA或多位点插入,T1代阳性植株自交所得T2代种子按单株收种并播种于含有卡那霉素的培养基上,
    当T1代阳性植株基因型为Aa时,该植株上所结种子有75%能够萌发并长成幼苗,因此,应选择阳性率约为75%的培养基中幼苗继续培养。③T2代阳性植株的基因型为1/3AA、2/3Aa,将②中选出的T2代阳性植株自交,所得的T3代种子按单株收种并播种于含有卡那霉素的培养基上,基因型为AA的植株自交,其后代不会发生性状分离,在含有卡那霉素的培养基上,所有种子都能够萌发并生长,而基因型为Aa的植株自交,其后代会发生性状分离,在含有卡那霉素的培养基上部分种子不能萌发,因此阳性率达到100%的培养基中的幼苗为纯合子(AA),即目标转基因植株。分析题图可知,
    野生型相关基因中不含限制性内切核酸酶X的识别序列,不能被该酶切割,已知DA1基因的长度为150 bp,因此,野生型相关基因被限制性内切核酸酶X切割并电泳后得到的条带为150 bp。突变型相关基因中含有限制性内切核酸酶X的识别序列,用该酶切割后,突变基因被切割成100 bp、50 bp两种DNA片段,经电泳后得到的条带为100 bp和50 bp。突变型和野生型相关基因经限制性内切核酸酶X切割并电泳后得到的结果如下图所示。
    考点三 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定 1.DNA的粗提取与鉴定(1)实验原理。
    (2)方法步骤(以洋葱为例)。
    [易错提醒] 加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA分子的断裂,导致DNA分子不能形成丝状物。本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料,原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA),可选用鸡血细胞作为材料。
    2.DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)原理。①PCR原理:DNA的热变性原理,即通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
    (2)方法步骤。①PCR扩增。准备→移液→混合→_______→反应。②鉴定PCR产物:琼脂糖凝胶电泳法。配制琼脂糖溶液→制备琼脂糖凝胶→将电泳缓冲液加入电泳槽中→加样→电泳→取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
    [易错提醒] 为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理;在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换,避免试剂的污染;离心的目的是使挂在管壁上的液体全部甩下。
    考向1 DNA的粗提取与鉴定1.(2024·广东一模)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,正确的是(  )A.新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取B.DNA不溶于体积分数为95%的冷酒精而溶于2 ml/L 的NaCl溶液C.在研磨植物细胞时加入研磨液是为了溶解细胞壁D.溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后即呈蓝色
    解析:猪是哺乳动物,其成熟的红细胞无细胞核,不能用于提取DNA,A项错误;DNA不溶于体积分数为95%的冷酒精,但能溶于2 ml/L的NaCl溶液,B项正确;溶解植物细胞壁用纤维素酶和果胶酶,研磨时加入研磨液是为了溶解DNA并破碎细胞膜,C项错误;DNA与二苯胺试剂混匀后需沸水浴加热才能呈现蓝色,D项错误。
    2.下图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图,下列相关叙述正确的是(  )
    A.图1中的丝状物不含有DNAB.图2所示实验操作中有一处明显错误,可能导致试管2中蓝色变化不明显C.图1所示操作的原理是DNA溶于酒精,而蛋白质等杂质不溶酒精D.图2试管1的作用是证明物质的量浓度为2 ml/L 的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
    解析:题图1中的丝状物就是粗提取的DNA,A项错误;题图2所示实验的试管中,溶液的液面高于烧杯中的液面,可能导致加热不充分,试管2中蓝色变化不明显,B项正确;题图1所示操作的原理是DNA不溶于酒精,而蛋白质等杂质溶于酒精,C项错误;题图2试管1起对照作用,目的是证明沸水浴条件下,物质的量浓度为2 ml/L的NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色,而DNA遇二苯胺出现蓝色,D项错误。
    考向2 DNA片段的扩增及电泳鉴定3.下列关于PCR操作过程的叙述,错误的是(  )A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理B.PCR利用了DNA的热变性原理C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化D.在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换
    解析:为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理,A项正确;PCR利用了DNA的热变性原理,B项正确;缓冲液和酶应分装成小份,在-20 ℃ 环境中储存,使用前,将所需试剂从冰箱取出,放在冰块上缓慢融化,C项错误;在向微量离心管中添加反应组分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换,以免其他成分的污染,D项正确。
    4.在基因工程操作过程中,科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体,进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果如下图所示。以下相关叙述中,错误的是(  )A.该载体最可能为链状DNA分子B.两种限制酶在载体上各有一个酶切位点C.限制酶R1与R2的切点最短相距约200 bpD.限制酶作用位点会导致磷酸二酯键断裂
    解析:当仅用一种限制酶切割载体时,仅产生一种长度的DNA片段,因此该载体最有可能为环状DNA分子,A项错误;当仅用一种限制酶切割载体时,两种限制酶切割产生的DNA片段等长,而两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段,所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点,B项正确;两种限制酶同时切割时产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段,所以两种限制酶的酶切位点最短相距200 bp,C项正确;限制酶切割DNA分子,破坏的是作用位点上两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键,D项正确。
    提示:切割产生的DNA片段末端与EcR Ⅰ切割产生的末端相同
    2.在培育某些转基因植物时,常用农杆菌转化法,农杆菌的作用是____________________________________________________。提示:侵染植物,将目的基因转移到受体细胞中
    [原因分析类]3.若用重组质粒转化大肠杆菌,一般情况下,不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞,原因是________________________________。提示:未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱4.若用家蚕作为表达基因A的受体,在噬菌体和昆虫病毒两种载体中,不选用______________作为载体,其原因是______________________________。提示:噬菌体 噬菌体的宿主是细菌,而不是家蚕
    5.若要使目的基因在受体细胞中表达,需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞,原因是__________________________(答出2点即可)。提示:目的基因无复制原点;目的基因无表达所需的启动子
    6.设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图所示),请分别说明理由。
    ①第1组: _____________________________;②第2组:________________________________。提示:①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效 ②引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
    7.新冠病毒是一种单链RNA病毒,常用“荧光RT—PCR技术”进行检测,方法是取检测者的mRNA逆转录出cDNA,并大量扩增时,用荧光标记的新冠病毒核酸探针来检测PCR产物中是否含有新冠病毒的cDNA,请回答下列问题:(1)“荧光RT—PCR技术”所用的试剂盒中通常都应该含有:_________、___________________________________、荧光标记的核酸探针、引物、dNTP、缓冲体系。
    耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)
    (2)如果要同时扩增两种基因,则试剂盒中的引物应该有_________种。下图为新冠病毒的“ORFla0b基因”对应的cDNA片段结构示意图,则与之对应的引物结合的部位应该是图中的_________(子链延伸方向为其自身的5′→3′,用图中数字作答)。若已知该基因的引物Ⅰ,能否依据其碱基序列设计出另一种引物Ⅱ?_________,理由是___________________________________________________。
    两段引物的碱基序列没有相关
    性(既不相同,也不互补)
    高考真题体验1.(2021·高考全国卷乙)用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶,其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如下图所示。
    回答下列问题:(1)常用的DNA连接酶有E.cli DNA连接酶和T4 DNA 连接酶。上图中___________________________酶切割后的DNA片段可以用E.cli DNA连接酶连接。上图中___________________________________酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。解析:E.cli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来。T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。
    EcR Ⅰ、Pst Ⅰ
    EcR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcR Ⅴ
    (2)DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是__________________。解析:DNA连接酶通过催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键,将目的基因片段与质粒载体片段连接起来。
    (3)DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中能______________;质粒DNA分子上有________________________,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因(如某种抗生素抗性基因),利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞,方法是____________________________________________________。解析:作为载体,质粒DNA分子上必须有复制原点,才能使质粒在受体细胞中能进行自我复制;质粒DNA分子上应具有一个至多个限制酶切割位点,便于外源DNA插入;质粒DNA分子上有标记基因,可以用添加特定抗生素的选择培养基培养经转化处理的宿主细胞,以达到筛选的目的。
    一个至多个限制酶切割位点
    用添加特定抗生素的选择培养基培养已转化处理的宿主细胞
    (4)表达载体含有启动子,启动子是指______________________________。答案:位于基因的上游、一段有特殊序列结构的DNA片段,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA解析:启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,RNA聚合酶与该区域结合可驱动基因转录出mRNA。
    2.(2022·广东选择考)“绿水逶迤去,青山相向开。”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。基于某些梭菌的特殊代谢能力,有研究者以某些工业废气(含CO2等一碳温室气体,多来自高污染排放企业)为原料,通过厌氧发酵生产丙酮,构建一种生产高附加值化工产品的新技术。回答下列问题:(1)研究者针对每个需要扩增的酶基因(如下图所示)设计一对_________,利用PCR技术,在优化反应条件后扩增得到目标酶基因。
    (2)研究者构建了一种表达载体pMTL80k,用于在梭菌中建立多基因组合表达库,经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等,其中抗生素抗性基因的作用是___________________________________________,终止子的作用是_____________________________________。(3)培养过程中发现重组梭菌大量表达上述酶蛋白时,出现了生长迟缓的现象,推测其原因可能是__________________________________________________________,此外丙酮的积累会伤害细胞,需要进一步优化菌株和工艺才能扩大应用规模。
    作为标记基因,筛选含有
    终止转录,使转录在所需要的地方
    CO2等气体用于大量合成丙酮,而不是用于重组梭
    (4)这种生产高附加值化工产品的新技术,实现了___________________,体现了循环经济的特点。从“碳中和”的角度看,该技术的优势在于___________________________________________,具有广泛的应用前景和良好的社会效益。
    不仅不排放CO2,还可以消耗工业废气中的CO2
    3.(2023·山东等级考)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。
    (1)与图甲中启动子结合的酶是______________。除图甲中标出的结构外,作为载体,质粒还需具备的结构有___________________________________________________________(答出2个结构即可)。解析:RNA聚合酶与图甲中启动子结合开始转录。作为载体必须具备的条件:要具有限制酶的切割位点;要有标记基因(如抗生素抗性基因),以便于重组质粒的筛选;具有复制原点,能在宿主细胞中稳定存在并复制;是安全的,对受体细胞无害,而且要易从供体细胞分离出来。题图甲有启动子和终止子,因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点。
    限制酶切割位点、标记基因、
    复制原点(答出2个结构即可)
    (2)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物__________________。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的_________(填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
    F2和R1(或F1和R2)
    解析:用PCR扩增分析法确定重组质粒中目的基因插入方向是否正确时,常设计一对引物,一个引物与目的基因序列互补,另一个引物与质粒序列互补,两引物延伸方向相反,以扩增出两引物间的序列,若插入方向正确,则可扩增出相应序列,反之,则不能扩增出相应序列,故选用的引物应为F2、R1或F1、R2,若选用引物F1、R1,不论目的基因插入方向是否正确,都可扩增出目的基因序列。b链是模板链,而根据题图上启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右,对应的模板链方向应该是3′→5′,非模板链(也就是a链)是5′→3′;DNA复制的方向是子链的5′→3′,在引物基础上延伸的方向是5′→3′,所以引物结合的单链的方向是3′→5′;题图中F1是前引物,在左侧,所以其配对的单链是3′→5′的b链,故其序列应该与a链相应部分的序列相同。
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