第十单元　专题突破10　综合PCR的基因工程问题-2025年高考生物大一轮复习（课件+讲义+练习）

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1、注重基础;首先要通读教材。通过对教材的温习，能将课本相关知识有序地组织起来，形成知识链条和网络，使知识系统化、网络化，将所学的知识浓缩其中，将书本由“厚”变“薄”，了解各知识点在知识体系中的具体位置，弄清楚各知识点之间的内在联系，有利于联想记忆，也有利于深层次拓展知识，更利于培养综合运用知识去分析解决实际问题的能力。2、重视实验;从高考卷看，实验占有十分突出的位置。实验题不仅占分比例大，而且经常出现新的题型。是高考的重点也是难点，更是学生的失分点。 3、注重理论联系实际;生物的考试并不仅仅是考概念，学会知识的迁移非常重要，并要灵活运用课本上的知识。不过特别强调了从图表、图形提取信息的能力。历年高考试题，图表题都占有比较大的比例。 4、重视几种能力的训练。注重能力的考查是近几年高考的重点，基础知识是综合运用、提升能力的基石。夯实基础不能离开课本，无论什么综合题、联系实际的问题，原理都在课本里。在复习备考中，不能忽略现有教材的例子、资料分析、问题探讨、技能训练等。另外，生物考卷的阅读量越来越大，做题速度越来越重要，考生要在提高读题速度的同时不影响做题的正确率。
综合PCR的基因工程问题
2025年高考生物大一轮复习
阐述常规PCR、重叠延伸PCR、荧光定量PCR等的过程与原理，举例说明不同的PCR技术有着不同的应用。
类型一　利用PCR技术获取目的基因
获取目的基因是基因工程操作的第一步。获取目的基因的方法有多种，现在常用PCR特异性地快速扩增目的基因。PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。该技术由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得了诺贝尔化学奖。
1.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。下列叙述错误的是
A.第一轮复制得到2个DNA分子，即　①②各一个B.第二轮复制得到4个DNA分子，即　①②③④各一个C.第四轮复制得到16个DNA分子，其　中有4个X基因D.经五轮循环后产物中有五种不同的　DNA分子
类型二　利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式
检测目的基因在受体细胞内是否稳定存在是基因工程操作的重要步骤，可以借助载体上的标记基因、PCR技术和核酸分子杂交技术等方法鉴定受体细胞中是否转入了目的基因。在实际操作中，PCR技术不仅可以精准地鉴定受体细胞是否转入目的基因，还可以通过引物的巧妙设计鉴定目的基因的连接方式。
2.(2019·江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是____________________。
重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术在基因的定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特的应用。
类型三　利用PCR技术引导基因定点突变
3.水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。
注：图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。
(1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过_________________________来完成。(2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为______________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为_______(假设引物为单链DNA)。
(3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为_______________________________________________________________________。
引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会结合而失去作用
(4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是______________________________________________________________。
M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段
利用PCR技术进行基因扩增时，为了便于设计引物，要求目的基因两侧的序列是已知的。当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。
类型四　利用PCR技术扩增未知基因序列
4.(2020·江苏，33节选)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcR Ⅰ酶切为例)：
请据图回答问题：(1)步骤Ⅰ用的EcR Ⅰ是一种_______________________酶，它通过识别特定的____________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成_____________；PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得____________；Taq DNA聚合酶的作用是催化______________________________。
为模板的DNA链的延伸
(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
病原体检测是诊断和控制传染病的重要手段，为迅速而准确地确定病原体的存在和种类，发展了许多快速检测方法。PCR技术是一种基于DNA扩增原理的快速病原体检测方法，它能够在几小时内扩增和检测极小量的病原体DNA，并且具备高度的特异性和敏感性。
类型五　利用PCR技术快速检测病原体
5.(2024·烟台高三一模)人类猴痘由Yaba猴病毒(双链DNA病毒)引起，实时荧光定量PCR(qPCR)可用于Yaba 猴病毒的快速检测。进行qPCR 时，在反应体系加入Taq man探针，Taq man探针两端连有荧光基团(R)和抑制荧光发出的淬灭基团(Q)，完整的Taq man探针不发出荧光，当探针被水解后R基团会发出荧光(如图所示)，随循环次数的增加，荧光信号强度增加。
(1)采用 qPCR 检测Yaba 猴病毒需在一定的______溶液中才能进行，反应体系中还需提供DNA模板、原料、______、Taq man探针、Taq DNA聚合酶、Mg2＋等。qPCR过程中，Taq DNA 聚合酶的两个作用是_________________________________。
(2)qPCR检测病毒的核酸一般具有特异性强和灵敏度高的特点，这与反应体系中加入的______和______有关。但有时也可能会出现“假阴性”的结果。可能的原因有______________________________________________________(答出两点)。
范；取样所获样本量不足；病毒发生了基因突变
(3)在PCR反应体系中一般都要加入Mg2＋，原因是____________________________。为了探究Mg2＋对PCR扩增效果的影响，科研人员在PCR反应体系中加入不同浓度的Mg2＋进行了实验。结果如图所示，据此可得出的结论有_____________________________________
TaqDNA聚合酶需要Mg2＋激活
在不含 Mg2＋的缓冲液中靶基因几乎无法
____________________________________________________________________________________。
扩增；在不同浓度的Mg2＋缓冲液中靶基因的扩增效果不同；在实验浓度下，4 mM 为最佳浓度
一、选择题1.(2024·厦门高三质检)如图表示 PCR 过程中某个阶段反应体系的情况，①②③④表示相关物质，L、R 表示方向。下列叙述正确的是A.②链从L到R的方向为3′→5′， ①②链均可作为子链合成的模板B.PCR 过程需要通过解旋酶断开氢 键，且为边解旋边复制C.以1个DNA为模板经3次循环需消耗8个引物③D.物质③的5′端添加了某序列，至少需经2次循环才可获得该序列的双 链产物
2.(2024·重庆高三质检)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法，如图所示。不对称PCR中加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物，两者的比例通常为1∶100，PCR反应最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。下列相关说法错误的是A.用不对称PCR方法扩增目的基因时， 不需要知道基因的全部序列B.进行最初若干次循环的目的是增加 模板DNA的量C.最后大量获得的ssDNA与图中乙链 的碱基序列一致D.因为双链DNA和单链DNA的分子量大小不同，可通过电泳方法将其分离
3.(2024·无锡高三模拟)重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是A.过程①需要把两对引物同时加入一 个扩增体系以提高扩增效率B.过程①需要2轮PCR才能得到图中所 示PCR产物C.过程②的产物都可以完成延伸过程D.若过程④得到16个突变基因则需要 消耗15个通用引物RP2
4.反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列(图中L、R)进行扩增的技术，其过程如图所示。下列相关叙述不正确的是A.过程①用同一种限制酶对未知序列两端进行切割B.过程②需要使用DNA连接酶，形成磷酸二酯键C.过程③PCR体系需要添加耐高温的DNA聚合酶 和解旋酶D.该技术可检测T－DNA整合到植物染色体DNA 的位置
5.IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿的IKKβ基因编码区第1 183位碱基T突变为C。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术获得突变基因，如图所示。下列说法错误的是A.PCR1中使用的引物有引物A、引物CB.PCR2中使用的引物有引物B、大引物b链C.PCR1过程需要扩增3轮才能获得目标产物D.PCR2过程中，为减少错误DNA片段的产生 可适当升高复性温度
6.(2024·安顺高三调研)荧光定量PCR技术可定量检测样本中DNA含量，用于病毒检测。其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针。当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图)。通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值(荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数)。下列相关叙述错误的是A.PCR每个循环包括变性、复性(引物和模板结 合)、延伸3个阶段B.耐高温的DNA聚合酶在该反应中的作用是形 成磷酸二酯键C.最终监测的荧光强度与起始时反应管内样本 DNA的含量呈正相关D.Ct值越大表示被检测样本中病毒数目越多，患者危险性更高
7.(2024·襄阳高三模拟)通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述不正确的是A.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的 基因定向插入B.复性温度过高会导致引物不能与模板牢固结 合，PCR扩增效率下降C.第3轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成 两条链等长的突变基因D.第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等 长的DNA占1/2
8.(2024·南通高三调研)如图是被农杆菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者将其连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T－DNA插入位置两侧的未知序列，据此来确定T－DNA插入的具体位置。下列有关说法错误的是A.农杆菌在自然条件下主 要侵染双子叶植物和裸 子植物，T－DNA存在于其Ti质粒上B.利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列C.若扩增循环n次，需要2n＋1－2个引物D.将扩增出的未知序列与水稻基因组序列比对可确定T－DNA的插入位置
9.实时荧光定量RT－PCR技术需要在常规PCR基础上添加荧光染料或荧光探针，荧光染料能特异性掺入DNA双链中，从而发出荧光信号。在流感流行季节，对怀疑流感病毒感染的患者，可以通过实时荧光定量RT－PCR技术进行核酸检测。下列相关叙述不正确的是A.图中的探针可能是利用荧光分子标记的流感 病毒独特的基因序列B.核酸检测是通过检测荧光信号来确定样本中 是否有病毒核酸的C.PCR技术利用了DNA双链复制的原理，需要 解旋酶和耐高温的DNA聚合酶的催化D.用荧光RT－PCR技术测定病毒的核酸具有特异性
二、非选择题10.(2023·江苏，22节选)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有______________，扩增程序中最主要的不同是____________。
(2)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_______________________。
限制酶、(T4)DNA连接酶
(3)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有_______。A.稀释涂布平板需控制每个平 板30～300个菌落B.抗性平板上未长出菌落的原 因一般是培养基温度太高C.抗性平板上常常会出现大量 杂菌形成的菌落D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(4)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板、用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图2。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有________。
(5)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是________________________________________________________________________。
电泳只能检测DNA分子的大小(长度)，无法确定待检测DNA分子的碱基序列
11.基因工程在农业方面的应用发展迅速，我国转基因作物的种植面积在世界有较高排名。请回答下列相关问题：(1)目的基因的筛选与获取是基因工程的第一步。为提高机会和可能，目的基因往往从相关的______________________的基因中进行筛选。
(2)目的基因可以人工合成、从基因文库中获取，还可以利用PCR技术获取和扩增。如图1展示了PCR技术获取和扩增目的基因的原理，请分析回答下列问题：
①PCR技术利用了DNA半保留复制原理和______________原理。PCR的一次循环包括变性、复性和延伸三个过程，复性的作用是_______________________________________。②将一个DNA分子进行扩增，理论上目的基因最早在第____次循环后获得；第5次循环后，可扩增得到______个目的基因。
基互补配对与两条单链结合
(3)反向PCR可用于扩增未知序列，其原理如图所示。图中链状DNA分子内侧是已知序列，外侧为未知序列。请回答相关问题：
①EcR Ⅰ酶切后得到的—AATT称为黏性末端，“黏性”的含义是____________________________________________，EcR Ⅰ切割得到黏性末端的原
因是_________________________________。
切割位点在识别序列中心轴线两侧
②不直接在图2中DNA分子的两端设计引物并进行扩增，原因是_________________________________。
DNA两端序列未知，无法
③图4中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A延伸子链的延伸方向是_______(填“顺时针”或“逆时针”)，PCR产物______(填“含有”或“不含”)EcR Ⅰ的酶切位点。
12.(2024·湖北华中师大附中高三模拟)幽门螺杆菌是一种常见的人类致病菌，其骨架蛋白MreB通过影响脲酶活性而参与调控其致病性。为了更准确地分离出MreB蛋白，用重叠延伸PCR技术(指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠拼接起来的一项技术)，将幽门螺杆菌MreB基因中编码终止密码子前的DNA序列与TAP标签(可以标记幽门螺杆菌基因组中任何一个基因，且不会影响基因的表达)进行连接，构建了融合表达蛋白MreB和TAP标签的质粒，
实验流程如图所示。据图回答下列问题：
(1)重叠PCR获得带有标签的MreB基因①获得两种具有重叠片段DNA的过程中，PCR1和PCR2必须在不同的反应体系中，原因是_________________________________________________________________________________。
引物2和引物3中存在互补配对的片段，置于同一反应
体系时，它们会发生结合而失去作用
②PCR3反应体系中所加入的引物是______________。
(2)重组质粒的构建①为将带有标签的MreB基因定向插入到pK18mbSacB质粒中，需要在引物末端添加限制酶识别序列，据图分析，在引物1添加的序列所对应的限制酶是________，在引物
4添加的序列所对应的限制酶是_______。经过这两种酶酶切的带有标签的MreB基因和pK18mbSacB质粒进行连接时，可选用______________(填“E.cli DNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)。