【寒假衔接讲义】人教版（选择性必修3）高中生物 高二寒假 第02讲 微生物的培养技术及应用（教师版+学生版）.zip

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1.学会如何配置培养基，明确培养基的成分及分类；掌握无菌技术中消毒与灭菌的运用；熟悉微生物酵母菌的纯培养过程。
2.通过对灭菌技术及实验步骤的学习，辨认实验器具，提高实验操作能力。
3.通过学习微生物的基本培养技术，了解微生物的培养条件，更加透彻地理解生物实验，从而喜欢上这门学科。
4.学会如何配置选择培养基；掌握稀释涂布平板法的操作细节；熟悉土壤中分解尿素的细菌的分离计数过程。
5.学会操作涂布器分离细菌；理解对细菌计数的算法。
6.通过学习微生物的选择培养和数量测定，了解生物科研工作的价值和意义。
【基础知识】
一、培养基
1．培养基的配制
1．培养基的配制原则
(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
(3)pH要适宜：细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需pH不同。
(4)认清不同生物需要的营养物质不同
①微生物需要的营养成分有氺、无机盐、碳源、氮源，有些微生物还需要特殊营养物质，如生长因子。
②在人和动物中，营养物质包括氺、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。
③在植物中，营养物质包括矿质元素、氺、二氧化碳三类。
2．培养基的成分
3．培养基的分类
特别提醒
几种微生物的营养和能量来源
二、无菌技术
1.目的：获得纯净的微生物培养物。
2.关键：防止杂菌污染。
3.两种无菌技术的比较
特别提醒：
1.消毒和灭菌后避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触；
2.消毒和灭菌的实验操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰附近进行。
三、培养基的制备
1.培养基制备的步骤：
计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。
归纳总结
四、纯化培养的两种接种方法
特别提醒
1.平板划线操作的注意事项
(1)操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要对接种环进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的不同：
①第一次操作目的是杀死接种环上原有的微生物。
②每次划线之间操作目的是杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少。
③划线结束操作目的是杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
(2)灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
(3)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的减少而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
(4)划线时最后一区不要与第一区相连。
(5)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
2.稀释涂布平板法：10倍系列稀释操作。
①将分别盛有9 mL氺的6支试管灭菌，并按101～106的顺序编号。
②进行梯度稀释时，从菌液开始，每次从前一试管中取1 mL 溶液注入到下一试管中混匀。(如图丙)
③进行涂布平板操作。(如图丁)
五、接种和分离酵母菌
特别提醒：
培养酵母菌：待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28 ℃左右的恒温培养箱中培养24～48 h。
六、微生物的筛选和计数
1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。
(2)统计菌落数目一般用稀释涂布平板法。
①统计菌落数目时，培养基表面生长的1个菌落，来源于样品稀释液中1个活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
②从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是(平均菌落数÷涂布的稀释液体积)×稀释倍数。
③利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度。
用稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低 ，这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
(3)实验流程：
方法总结
用显微镜直接计数法计数：血细胞计数板法
①结构：常用的是1 mm×1 mm×0.1 mm方格的计数板(如图)。每个计数板上有两个计数室，每个计数室上刻有9个大方格，其中只有中间的大方格为计数室，大方格的长和宽各为1 mm，深度为0.1 mm，其容积为0.1 mm3；大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格，即大方格是由400个小方格组成。
②操作：将清洁干燥的血球计数板的计数室上加盖专用的盖玻片，用吸管吸取稀释后的菌液，滴于盖玻片边缘，让培养液自行缓缓渗入，充满计数室。
③计数：在显微镜下计数4～5个中方格内的菌体数，求出每个小方格所含有的细菌的平均数，按照以下公式计算：每毫升原液含有的菌数＝每小格平均细菌数×400×104×原液被稀释倍数。
七、微生物的筛选与鉴别
1．纤维素酶
(1)组成：纤维素酶是一种复合酶，它包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。
(2)作用
2．菌种筛选
(1)方法：刚果红染色法。
(2)原理
即：使用以纤维素为唯一碳源的选择培养基，根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
3．筛选流程
归纳总结
1．微生物的鉴别方法
(1)菌落特征鉴别法：根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别。
(2)指示剂鉴别法：如以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素。
(3)染色鉴别法：如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物。
2．筛选微生物的三种方法
(1)单菌落挑取法：利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物。
(2)选择培养法：利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物。
(3)鉴定培养法：利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物。
3．选择培养基四种常见制备方法或实例
【考点剖析】
考点一：培养基的配制
例1．下列关于微生物培养基的叙述，错误的是( )
A．制备固体培养基，一般需在液体培养基中加入琼脂
B．微生物在固体培养基表面生长形成的菌落，可以用肉眼观察到
C．根据微生物对碳源需要的差别，使用不同碳源的培养基
D．培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的增殖越有利
【答案】A
【解析】制备固体培养基，一般需在液体培养基中加入适量的凝固剂——琼脂，A正确；菌落是由微生物在固体培养基表面生长形成的肉眼可见的具有一定形态结构的细胞群体，B正确；大多数微生物培养基都含有氺、碳源、氮源和无机盐等营养物质，自养型微生物的培养基可以没有碳源，固氮微生物的培养基可以没有氮源，C正确；培养基中的营养物质浓度过高，微生物会通过渗透作用失氺，对微生物的增殖不利，D错误。
考点二：无菌技术
例2．关于灭菌和消毒的理解，正确的是( )
A．灭菌是指杀灭物体内外的一切微生物，但不包括芽孢和孢子
B．消毒和灭菌实质上是相同的
C．常用的灭菌法有灼烧灭菌、干热灭菌、酒精灭菌
D．常用的消毒方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线消毒法、化学药物法
【答案】A
【解析】灭菌是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有微生物，包括芽孢和孢子；消毒是指用较为温和的物理、化学等方法杀死物体表面或内部的部分微生物，它们的本质不同，A、B项错误。常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和湿热灭菌，C项错误。常用的消毒方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线消毒法或化学药物消毒法等，D项正确。
考点三、微生物的纯培养
例3．有关平板划线操作的说法，正确的是( )
A．使用已灭菌的接种环、培养皿，操作过程中不再灭菌
B．打开含菌种的试管需通过火焰灭菌，取出菌种后需马上塞上棉塞
C．要将最后一区的划线与第一区的划线相连
D．最后将平板倒置，放入培养箱中培养
【答案】A
【解析】接种环在使用过程中需要多次灭菌，第一次灭菌是为了杀死接种环上原有的微生物，每次划线结束后需要灭菌是为了杀死上次残留的菌种，A错误。打开含菌种的试管需要通过火焰灭菌，取出菌种后还需要通过火焰灭菌再塞上棉塞，B错误。划线时最后一区的划线与第一区的划线不能相连，因为最后一区是细菌最稀少的，而第一区是细菌最致密的，如果连在一起则有可能影响单个菌落的分离效果，C错误。最后将平板倒置，防止皿盖上的氺滴落引起污染，D正确。
考点四、微生物的选择培养
例4.随着手机和网络的发展，外卖由于其便捷性，广受普通大众青睐。为检测外卖食品的质量状况，食品监管人员利用稀释涂布平板法对外卖食品中的微生物进行了调查。在稀释涂布平板法对微生物进行计数时的错误操作是( )
A．将1 mL样品稀释10倍，需加入10 mL无菌氺
B．吸取菌液的移液管需要干热灭菌避免杂菌污染
C．将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃
D．每一个稀释度涂布多个平板，计算各组平均值
【答案】A
【解析】将1 mL样品稀释10倍，需加入9 mL无菌氺，A错误；吸取菌液的移液管需要干热灭菌避免杂菌污染，B正确；涂布器灭菌时，将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃，待酒精燃尽、冷却后再用，C正确；每一个稀释度涂布多个平板，计算各组平均值，D正确。
考点五、微生物的计数
例5.用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为1×106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是( )
A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163
D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233
【答案】A
【解析】在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验结果的说服力与准确性，A、B错误。C项虽涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值，C错误，D正确。
考点六、微生物的接种方法
例6.分解尿素的微生物广泛存在于农田等土壤中，某生物实验小组尝试对分解尿素的微生物进行分离与计数。请回答下列问题：
(1)分解尿素的微生物含有的酶是________，为筛选出能分解尿素的微生物，配制培养基时应以________作为唯一氮源，因此该培养基属于________培养基。
(2)常用来统计样品中活菌数目的方法是__________。
(3)该小组对分解尿素的微生物进行计数时，在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，这样做的目的是________________________，然后将1 mL样液稀释10 000倍，在3个平板上用涂布法分别涂布 0.1 mL 稀释液；经适当培养后，统计活菌数目，每隔一个“时间间隔”统计一次菌落数目，最后选取____________作为结果；3个平板的菌落数分别为39、42和45。据此可得出每毫升样液中分解尿素的微生物活菌数为________个。
【答案】(1)脲酶 尿素 选择 (2)稀释涂布平板法 (3)检测培养基平板灭菌是否合格 菌落数目稳定时的记录 4.2×106
【解析】(1)分解尿素的微生物含有脲酶；培养基的成分一般包括氺、无机盐、碳源、氮源等，利用培养基对分解尿素的微生物进行筛选，应该用选择培养基，配制培养基时应以尿素作为唯一氮源等。(2)常用的微生物接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，其中稀释涂布平板法可以用于活菌的计数。(3)为了检测培养基平板灭菌是否合格，应该在接种前随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间。在用稀释涂布平板法计数时，应该选择菌落数目稳定时的记录作为结果；3个平板的菌落数的平均值为(39＋42＋45)/3＝42(个)，则每毫升样液中分解尿素的微生物活菌数为42÷0.1×10 000＝4.2×106(个)。
【真题演练】
1．(2022·辽宁高考，15)为避免航天器在执行载人航天任务时出现微生物污染风险，需要对航天器及洁净的组装车间进行环境微生物检测。下列叙述错误的是（ ）
A. 航天器上存在适应营养物质匮乏等环境的极端微生物
B. 细菌形成菌膜粘附于航天器设备表面产生生物腐蚀
C. 在组装车间地面和设备表面采集环境微生物样品
D. 采用平板划线法等分离培养微生物，观察菌落特征
【答案】A
【解析】嗜极微生物适应极端环境的特性使它们有在空间暴露环境或地外星球环境中存活的可能，因此航天器上存在适应营养物质匮乏等环境的极端微生物，A正确；细菌形成菌膜粘附于航天器设备表面产生生物腐蚀，会腐蚀舱内材料以及设备线路、元器件，B正确；对航天器及洁净的组装车间进行环境微生物检测，需要在组装车间地面和设备表面采集环境微生物样品，C正确；航天器及洁净的组装车间环境微生物很少，分离培养微生物，观察菌落特征，不需要采用平板划线法，D错误。
2.(2022·江苏高考，3)下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是（ ）
A. 选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B. 在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C. 适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D. 可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌
【答案】A
【解析】农田或公园土壤中含有较多的含脲酶的微生物，A正确；为了筛选可分解尿素的细菌，配置的培养基应选择尿素作为唯一氮源，含脲酶的微生物在该培养基上能生长，B正确；当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C正确；在细菌分解尿素的化学中，细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D错误。
3.(2022·海南高考，12)为探究校内植物园土壤中的细菌种类，某兴趣小组采集园内土壤样本并开展相关实验。下列有关叙述错误的是（ ）
A. 采样时应随机采集植物园中多个不同地点的土壤样本
B. 培养细菌时，可选用牛肉膏蛋白胨固体培养基
C. 土壤溶液稀释倍数越低，越容易得到单菌落
D. 鉴定细菌种类时，除形态学鉴定外，还可借助生物化学的方法
【答案】D
【解析】采集植物园中土壤样本的原则之一是要随机采样，A正确；牛肉膏蛋白胨固体培养基中含有细菌生长所需的碳源、氮源、氺、无机盐等，可用于细菌的培养，B 正确；土壤溶液稀释倍数足够高时，才能将聚集的细菌分散开，有助于在培养基表面形成单菌落，C错误；不同种类细菌的理化特性一般不同，鉴定细菌种类时，除根据菌落特征进行形态学鉴定外，还可以借助生物化学的方法进行鉴定，D正确。
4.(2022·湖北高考,5)灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是（ ）
A. 动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行
B. 微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染
C. 为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌
D. 可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
【答案】A
【解析】动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行，A错误；动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保证无菌环境，而微生物的培养不能加入抗生素，B错误；一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，以防止杂菌污染，C错误；可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌，以防止杂菌污染，D正确。
5.（2022·全国甲卷，37）某同学从被石油污染的土壤中分离得到A和B两株可以降解石油的细菌，在此基础上采用平板培养法比较二者降解石油的能力，并分析两个菌株的其他生理功能。
实验所用的培养基成分如下。
培养基Ⅰ：K2HP4，MgS4，NH4N3，石油。
培养基Ⅱ：K2HP4，MgS4，石油。
操作步骤：
①将A、B菌株分别接种在两瓶液体培养基Ⅰ中培养，得到A、B菌液；
②液体培养基Ⅰ、Ⅱ口中添加琼脂，分别制成平板Ⅰ、Ⅱ，并按图中所示在平板上打甲、乙两孔。
回答下列问题。
（1）实验所用培养基中作为碳源的成分是____________。培养基中NH4N3的作用是为菌株的生长提供氮源，氮源在菌体内可以参与合成____________（答出2种即可）等生物大分子。
（2）步骤①中，在资源和空间不受限制的阶段，若最初接种N0个A细菌，繁殖n代后细菌的数量是____________。
（3）为了比较A、B降解石油的能力，某同学利用步骤②所得到的平板Ⅰ、Ⅱ进行实验，结果如表所示（“+”表示有透明圈，“+”越多表示透明圈越大，“-”表示无透明圈），推测该同学的实验思路是__________。
（4）现有一贫氮且被石油污染的土壤，根据上表所示实验结果，治理石油污染应选用的菌株是____________，理由是___________。
【答案】（1） ①. 石油 ②. DNA、RNA、蛋白质
（2）N0•2n （3）在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录，根据透明圈大降解能力强，透明圈小降解能力弱，进而比较A、B降解石油的能力
（4） ①. A ②. A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且在没有添加氮源的培养基中也能生长
【解析】（1）培养基的成分有碳源、氮源、无机盐和氺，从组成培养基的物质所含化学元素可知，作为碳源的成分是石油。生物大分子DNA、RNA、蛋白质都含有N元素，故氮源在菌体内可以参与合成这些物质。
（2）由题意“资源和空间不受限制”可知，细菌的增殖呈J型曲线增长，由于DNA的半保留复制，细菌每繁殖一代就是上一代的2倍，根据公式Nt=N0•λt，λ=2，繁殖n代后细菌的数量是N0•2n。
（3）分析表格数据可知，实验的结果是：在平板Ⅰ上，A菌株降解石油的能力高于B菌株；在平板Ⅱ上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，根据实验的单一变量和对照原则，推测该同学的思路是：在无菌条件下，将等量等浓度的A菌液和B菌液分别接种到平板Ⅰ的甲和乙两孔处，平板Ⅱ也进行同样的操作，在相同且适宜条件下培养一段时间，比较两个平板的两孔处的透明圈大小并作记录。
（4）由表格数据可知，在平板Ⅱ（无氮源的培养基）上，A菌株仍然能降解石油，而B菌株不能降解，所以要治理贫氮且被石油污染的土壤，应该选用A菌株，因为A菌株降解石油的能力高于B菌株，并且不需要在培养基中添加氮源也能生长。
6.（2022·全国乙卷,37）化合物S被广泛应用于医药、食品和化工工业、用菌株C可生产S，S的产量与菌株C培养所利用的碳源关系密切。为此，某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和S产量的影响，结果见表。
回答下列问题。
（1）通常在实验室培养微生物时，需要对所需玻璃器皿进行灭菌，灭菌的方法有______（答出2点即可）。
（2）由实验结果可知，菌株C生长的最适碳源是______；用菌株C生产S的最适碳源是______。菌株C的生长除需要碳源外，还需要______（答出2点即可）等营养物质。
（3）由实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，其原因是______。
（4）若以制糖废液作为碳源，为进一步确定生产S的最适碳源浓度，某同学进行了相关实验。请简要写出实验思路：______。
（5）利用制糖废液生产S可以实验废物利用，其意义是______（答出1点即可）。
【答案】（1）高压蒸汽灭菌、干热灭菌
（2） ①. 葡萄糖 ②. 制糖废液 ③. 氮源、无机盐、生长因子
（3）缺少淀粉酶 （4）分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度
（5）减少污染、节省原料、降低生产成本
【解析】（1）通常在实验室培养微生物时，为防止实验用的玻璃器皿等物品中原有的微生物污染培养物，需要使用强烈的理化因素杀死物体内外一切微生物的细胞、芽孢和孢子，即对所需的玻璃器皿进行灭菌，玻璃器皿常用的灭菌的方法有干热灭菌、高压蒸汽灭菌等。
（2）由实验结果可知，与以制糖废液为碳源相比，以葡萄糖为碳源时菌株C的细胞干重最大，说明最适于菌株C生长的碳源是葡萄糖；而以制糖废液为碳源时，用菌株C生产S的产量高于以葡萄糖为碳源时的产量，说明最适于生产S的碳源是制糖废液。微生物的生长一般都需要氺、碳源、氮源和无机盐，还需要满足微生物生长对pH、氢气以及特殊营养物质的要求，故菌株C的生长除需要碳源外，还需要氮源、无机盐、生长因子等营养物质。
（3）分析题图表格可以看出在以淀粉为碳源的培养基中，菌株C不能生长，原因可能是菌株C中缺少分解淀粉的酶，不能利用淀粉。
（4）要测定生产S的最适制糖废液为碳源的浓度，实验自变量为制糖废液的浓度，可分别配制一系列不同浓度梯度的以制糖废液为唯一碳源的培养基，培养菌株C，其他条件相同且适宜，一段时间后，测定并比较不同浓度制糖废液中的S的产量，S产量最高时对应的制糖废液浓度，即为生产S的最适碳源浓度。
（5）利用制糖废液生产S可以实验废物利用，既有利于减少污染、节省原料，又能降低生产成本。
7.(2022·广东高考,21)研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对南中国海科考中，中国科学家采集了某海域1146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。
回答下列问题：
（1）研究者先制备富集培养基，然后采用________________法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养，除了稀释涂布平板法，还可采用________________法。据图分析，拟杆菌新菌株在以________________为碳源时生长状况最好。
（2）研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是________________。（答一点即可）
（3）藻类细胞解体后难度解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系绘组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是________________。
（4）深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌物各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有________________。
【答案】（1） ①. 高压蒸汽灭菌 ②. 平板划线 ③. 纤维素
（2）某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活）
（3）拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行 （4） 耐低温
【解析】（1）培养基通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。可以采用稀释涂布平板法或平板划线法，将单个微生物分散在固体培养基上，经过培养得到单菌落，从而获得纯净培养物。分析图12可知，在以纤维素为碳源的培养基中，细胞数量最多，可推知拟杆菌新菌株在以纤维素为碳源时生长状况最好。
（2）深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活），故将采集的样品置于各种培养基中培养，仍可能有很多微生物不能被分离筛选出来。
（3）拟杆菌为异养生物，作为该生态系统的分解者，能将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。
（4）深海冷泉温度较低，故生活在其中的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，应具有耐低温的特性，才能高效降解多糖，保证拟杆菌的正常生命活动所需。
8.(2022·浙江6月选考,29)回答下列（一）、（二）小题：
（一）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：
（1）为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用___________制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的___________中保温一段时间，其目的是___________。
（2）为提高筛选效率，可将菌种的___________过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用___________显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。
（3）为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过___________后再筛选获得，或利用转基因、___________等技术获得。
【答案】（1） ①. 无菌氺 ②. 氺浴 ③. 杀死不耐热微生物
（2） ①. 分离 ②. KI-I2
（3） ①. 人工诱变 ②. 原生质体融合
【解析】（1）产生淀粉酶的枯草杆菌的最适温度为50-75℃，要快速分离枯草杆菌，先将土样加入无菌氺制成枯草杆菌悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的氺浴中保温一段时间，杀死不耐热的微生物。
（2）将菌种的分离过程与菌种的产酶性能测定同时进行可以提高筛选效率。用稀释涂布平板法可以分离枯草杆菌，在培养基中添加淀粉作为唯一碳源，并且在培养基中添加KI-I2，能合成淀粉酶的枯草杆菌因为能利用淀粉而存活，同时淀粉由于被分解在菌落周围会出现透明圈，比较透明圈与菌落直径比值的大小，比值大的说明该菌株产酶性能较高。
（3）要获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用诱变育种，由于变异的不定向性，人工诱变后还需要再筛选才能获得高产淀粉酶的枯草杆菌。也可以利用转基因、原生质体融合等技术，从其他生物那里获得与高产淀粉酶有关的基因，进而获得相应的高产性状。
9.(2022·湖南高考,21)黄酒源于中国，与啤酒、葡萄酒并称世界三大发酵酒。发酵酒的酿造过程中除了产生乙醇外，也产生不利于人体健康的氨基甲酸乙酯（EC）。EC主要由尿素与乙醇形成，各国对酒中的EC含量有严格的限量标准。回答下列问题:
（1）某黄酒酿制工艺流程如图所示，图中加入的菌种a是_______，工艺b是_______（填“消毒”或“灭菌”），采用工艺b的目的是____________________。
（2）以尿素为唯一氮源的培养基中加入________指示剂，根据颜色变化，可以初步鉴定分解尿素的细菌。尿素分解菌产生的脲酶可用于降解黄酒中的尿素，脲酶固定化后稳定性和利用效率提高，固定化方法有_________________________（答出两种即可）。
（3）研究人员利用脲酶基因构建基因工程菌L，在不同条件下分批发酵生产脲酶，结果如图所示。推测________是决定工程菌L高脲酶活力的关键因素，理由是__________________。
（4）某公司开发了一种新的黄酒产品，发现EC含量超标。简要写出利用微生物降低该黄酒中EC含量的思路_____________________________。
【答案】（1） ①. 酵母菌 ②. 消毒 ③. 杀死啤酒中部分微生物，防止杂菌污染，延长其保存期
（2）①. 酚红指示剂 ②. 化学结合法、包埋法、物理吸附法
（3）①. pH ②. 随着培养时间延长，两图形中脲酶活力变化曲线基本一致，当pH从6.5降为4.5时，酶活力逐渐下降后保持相对稳定
（4）获取含有酸性脲酶菌样品，经过酸性培养基的初筛后，在添加酚红的培养基上进行复筛，挑选目标菌株接种培养，从酸性脲酶菌中提取脲酶纯化后制备成固定化酶，加入发酵环节。
【解析】（1）制造果酒利用的是酵母菌的无氧呼吸，加入的菌种a是酵母菌。过滤能除去啤酒中部分微生物，工艺b是消毒，消毒能杀死啤酒中部分微生物，防止杂菌污染，延长其保存期。
（2）由于细菌分解尿素的过程中合成脲酶，脲酶将尿素分解成氨，会使培养基碱性增强，pH升高，所以可以用检测pH的变化的方法来判断尿素是否被分解，故在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂可以鉴别尿素分解菌。固定化酶实质上是将相应酶固定在不溶于氺的载体上，实现酶的反复利用，并提高酶稳定性，酶的各项特性（如高效性、专一性和作用条件的温和性）依然保持。固定化酶的方法包括化学结合法、包埋法、物理吸附法等。
（3）对比两坐标曲线，随着培养时间延长，两图形中脲酶活力先减少后保持相对稳定，两者变化曲线基本一致，所以培养时间不是决定决定工程菌L高脲酶活力的关键因素。左图中当pH从6.5降为4.5时，酶活力由1.6逐渐下降后相对稳定，右图中当pH为6.5时，酶活力可以达到5.0并保持不变，故pH值是决定工程菌L高脲酶活力的关键因素。
（4）从坐标图形看，利用酸性脲酶消除其前体物质尿素可降低该黄酒中EC含量。该实验的实验思路为：获取含有酸性脲酶菌样品，扩大培养，经过酸性培养基的初筛后，在添加酚红的培养基上进行复筛，挑选目标菌株接种培养，从酸性脲酶菌中提取脲酶纯化后制备成固定化酶，加入发酵环节达到降解尿素的目的。
10.(2022·河北高考,23)番茄灰霉病菌严重影响番茄生产，枯草芽孢杆菌可以产生对多种病原菌具有抑制作用的蛋白质。为探究枯草芽孢杆菌能否用于番茄灰霉病的生物防治，研究者设计了相关实验。回答下列问题：
（1）检测枯草芽孢杆菌对番茄灰霉病菌的抑制作用时，取适量________菌液涂布于固体培养基上，将无菌滤纸片（直径5mm）在________菌液中浸泡后覆盖于固体培养基中心，数秒后取出滤纸片，培养皿倒置培养后测量________大小以判定抑菌效果。
（2）枯草芽孢杆菌为好氧微生物，液体培养时应采用________（填“静置”或“摇床震荡”）培养。培养过程中抽样检测活菌数量时，应采用________（填“稀释涂布平板法”或“显微镜直接计数法”），其原因是________。
（3）电泳分离蛋白质混合样品的原理是________。利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定枯草芽孢杆菌的抗菌蛋白分子量时，SDS的作用是________。
（4）枯草芽孢杆菌长期保藏时，常以其________作为保藏对象。
【答案】（1） ①. 番茄灰霉病菌 ②. 枯草芽孢杆菌 ③. 透明圈
（2）①. 摇床震荡 ②. 稀释涂布平板法 ③. 用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一个菌落都来自一个活细胞，而显微镜直接计数法会将死亡的酵母菌也计算在内
（3）①. 利用待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离 ②. SDS带有大量的负电荷，且能使蛋白质变性成为肽链，使蛋白质的迁移速率只与蛋白质的相对分子质量有关，而与所带电荷性质无关 （4）菌液
【解析】（1）分析题意，要检测枯草芽孢杆菌对番茄灰霉病菌的抑制作用，先把适量的番茄灰霉病菌菌液涂布于固体培养基上，将无菌滤纸片在枯草芽孢杆菌菌液中浸泡后覆盖于固体培养基中心，若对番茄灰霉病菌有抑制作用，被覆盖的位置的番茄灰霉病菌就会被杀死，培养皿倒置培养后会出现透明圈，测量透明圈大小以判定抑菌效果强弱。
（2）枯草芽孢杆菌为好氧微生物，采用摇床震荡培养可增大培养液的溶氧量，有利于枯草芽孢杆菌的生长繁殖。培养过程中要抽样检测活菌数量，应该采用稀释涂布平板法，用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一个菌落都来自一个活细胞，而显微镜直接计数法会将死亡的酵母菌也计算在内。
（3）电泳分离蛋白质混合样品的原理是：利用待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。SDS带有大量的负电荷，且能使蛋白质变性成为肽链，使蛋白质的迁移速率只与蛋白质的相对分子质量有关，而与所带电荷性质无关。
（4）长期保藏枯草芽孢杆菌，应该将培养的菌液转移到灭菌好的甘油瓶中，与甘油充分混合，放在-20℃的冷冻箱中保存。
【过关检测】
1．培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶，上述内容所采用的灭菌或消毒方法依次是（ ）
①化学药物消毒 ②灼烧灭菌 ③干热灭菌
④紫外线消毒 ⑤高压蒸汽灭菌 ⑥巴氏消毒法
A．⑤②③①④⑥B．③④②①⑥⑤C．⑤③②①④⑥D．⑥②③④①⑤
【答案】D
【解析】培养基需用湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）；培养皿能耐高温，需用干热灭菌；接种环可用灼烧灭菌达到迅速彻底的灭菌效果；实验操作者的双手可用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手；空气可用紫外线消毒；为不破坏其营养成分，对牛奶可采用巴氏消毒法。
2．不同的微生物对营养物质的需求各不相同。下列有关一种以C2为唯一碳源的自养微生物营养的描述中，不正确的是（ ）
A．氮源物质为该微生物提供必要的氮元素
B．碳源物质也是该微生物的能源物质
C．无机盐是该微生物不可缺少的营养物质
D．为制成固体培养基往往需要加入琼脂作为凝固剂
【答案】C
【解析】氮源物质为该微生物提供必要的氮素，A正确；该碳源是二氧化碳，属于无机物，不能作为微生物的能源物质，B错误；无机盐是该微生物不可缺少的营养物质，C正确；琼脂的作用是在固体及半固体培养基中充当凝固剂，D正确。
3．下列关于微生物纯化培养的叙述，错误的是（ ）
A．涂布平板时应先将培养皿盖置于实验操作台上
B．微生物的纯化培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤
C．用平板划线法和稀释涂布平板法都能在固体培养基上得到单菌落
D．倒平板操作应等培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近进行
【答案】A
【解析】涂布平板时不能完全掀开培养皿盖，将其置于实验操作台上，只需要打开一条缝隙，A错误；微生物的纯化培养包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤，B正确；用平板划线法和稀释涂布平板法都能在固体培养基上得到单菌落，C正确；倒平板操作应等培养基冷却至50℃左右时，在酒精灯火焰附近进行，D正确。
4．在稀释涂布平板法对微生物进行计数时的错误操作是（ ）
A．将1mL样品稀释10倍，需加入10mL无菌氺
B．吸取菌液的移液管需要干热灭菌避免杂菌污染
C．将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃
D．稀释涂布平板法既能分离纯化微生物，又能计数
【答案】A
【解析】将1mL样品稀释10倍，需加入9mL无菌氺，A错误；吸取菌液的移液管需要干热灭菌避免杂菌污染，B正确；将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃，将涂布器灭菌，C正确；稀释涂布平板法既能分离纯化微生物，又能计数，D正确。
5．下列关于灭菌和消毒的叙述，正确的是（ ）
A．灭菌和消毒均可以杀死环境中的一切微生物，包括芽孢和孢子
B．无菌操作时，需要对实验操作的空间、操作者的衣物和手进行灭菌
C．灼烧法灭菌的对象是金属器具，不可以是玻璃器具
D．常用灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌等
【答案】A
【解析】灭菌可以杀死环境中的一切微生物，包括芽孢和孢子，消毒是杀死部分微生物，不包括芽孢和孢子，A错误：无菌操作时，需要对实验操作的空间、操作者的衣物和手进行消毒，B错误；灼烧法灭菌的对象是金属器具，也可以是部分玻璃器具，如涂布器，C错误；常用灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌等，D正确。
6．下列关于微生物培养的叙述，正确的是（ ）
A．配制培养基时，一般先调pH再灭菌
B．培养微生物用到的接种环、培养皿、培养基等都用干热灭菌法灭菌
C．培养乳酸菌时，除了基本的碳源、氮源、氺和无机盐，还需要添加抗生素
D．用平板划线法和稀释涂布平板法进行微生物的计数时，所得数据往往比实际数据偏小
【答案】A
【解析】配制培养基时，一般先调pH再灭菌，这样可以避免在调pH时有杂菌污染培养基，A正确；培养微生物用到的接种环、培养皿可以用干热灭菌法灭菌，培养基用高压蒸汽灭菌法灭菌，B错误；培养乳酸菌时，不能添加抗生素，因为抗生素会杀死乳酸菌，C错误；因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，故用稀释涂布平板法进行微生物的计数时，所得数据往往比实际数据偏小，但用平板划线法不能对微生物计数，D错误。
7．高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是（ ）
A．将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中
B．将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上
C．将分解尿素的细菌接种到无菌培养基上，进行分离和计数
D．将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上
【答案】D
【解析】不进行严格的灭菌对葡萄酒制作的影响不大，因为多数微生物不能在缺氧、酸性和含糖较高的环境中生存，A错误；不进行严格的灭菌对腐乳制作的影响不大，因为腐乳制作时还需在其中放入酒精、盐和香辛料等，这些都具有杀菌作用，B错误；植物组织培养要求严格的无菌环境，如果灭菌不彻底，会造成培养的幼苗生长缓慢甚至培育失败，C正确；选择培养基是根据要培养的微生物的代谢特点制备的，一般的杂菌在其上面也很难生存，D错误。
8．某种物质X（一种含有C、H、、N的有机物）难以降解，会对环境造成污染，只有某些细菌能降解X。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解X的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基，甲的组分为无机盐、氺和X，乙的组分为无机盐、氺、X和Y。下列相关叙述中不正确的是（ ）
A．甲、乙培养基均属于选择培养基，乙培养基组分中的Y物质是琼脂
B．若要筛选高效降解X的细菌菌株，甲、乙培养基中X是唯一的碳源
C．步骤⑤的筛选过程中，根据对照原则各培养瓶中X溶液的浓度不同
D．步骤⑤的筛选过程中，若X浓度过高，某菌株对X的降解量可能下降
【答案】D
【解析】甲、乙培养基均只含有机物X，属于选择培养基，乙培养基组分中除了X外，还加入了Y物质琼脂，获得固体培养基，从而分离出所需的菌种，A正确；若要筛选高效降解X的细菌菌株，需要甲、乙培养基中的X是唯一提供碳源的有机物，不能利用物质X的微生物不能在该培养基上生长，从而筛选出高效降解X的细菌菌株，B正确；步骤⑤中自变量是挑取的不同的菌落，各培养瓶中的X溶液的浓度应该是一致的，因为X溶液的浓度属于无关变量，需要保持相同，C错误；步骤⑤的筛选过程中，若培养基中的X浓度过高，可能会导致菌体失氺影响菌体的正常生长，因此某菌株对X的降解量可能下降，D正确。
9．如表所示为某培养基的配方，下列叙述错误的是（ ）
A．根据物理性质划分，该培养基属于液体培养基
B．根据功能划分，该培养基属于选择培养基
C．根据培养基的配方可知，该培养基可培养异养型微生物
D．该培养基可以用于培养细菌
【答案】A
【解析】液体培养基中加入凝固剂（如琼脂）可形成固体培养基，题表所示的培养基配方中没有加凝固剂，因此属于液体培养基，A正确；该培养基中的加入了青霉素，可以分离得到真菌，属于选择培养基，B正确；该培养基中的（CH2）可作为有机碳源，因此其培养的微生物的同化作用类型是异养型，C正确；该培养基中含有青霉素，其能抑制细菌的生长，因此不能用于培养细菌，D错误。
10．硝化细菌是一种好氧菌，可有效净化氺体中铵盐，降低对虾的死亡率。科研人员拟从当地对虾养殖池塘中筛选出对铵盐降解率高且稳定的硝化细菌菌株，操作流程所示。下列叙述错误的是（ ）
A．纯化菌种时，可以采用图中所示的接种方法接种
B．选择培养基中应加入铵盐作为唯一氮源
C．已知硝化细菌是好氧性细菌，扩大培养时需要振荡的目的是减少硝化细菌与营养物质、溶解氧的充分接触
D．用细菌计数板统计的硝化细菌数为活菌数
【答案】A
【解析】根据图示培养皿中菌落特点，可判断接种方法为平板划线法，在划线的最后区域，可得到单菌落，从而起到纯化菌种的目的，A正确；硝化细菌是一类能降解铵盐的自养型细菌，为了筛选出硝化细菌，在配制选择培养基时，需要以铵盐为唯一氮源，B正确；硝化细菌是好氧性细菌，扩大培养时一般需振荡，振荡的目的是：减少培养液中溶氧量，并有利于硝化细菌与营养物质接触，C正确；使用细菌计数板对纯化培养后的硝化细菌直接计数，不管死菌还是活菌都会计数，D错误。
11．孔雀石绿（简称MG）是广泛使用的有机染料，在自然环境中极难降解，容易引起土壤污染，进而危害人体健康。因此从土壤中分离和筛选出高效的MG降解菌有非常重要的意义。已知MG在氺中溶解度低，含过量MG的固体培养基不透明。
(1)培养基的配制：MG降解菌富集培养基需含有NaH2P4、KH2P4、NaCl、NH4Cl、CaCl2、MgS4、氺等，再加_____作为唯一碳源。配制好的培养基，需用_____法进行灭菌。
(2)MG高效降解菌株的分离和纯化：图中所示的分离纯化细菌的方法是_____，用该方法统计样品的菌落数目比活菌的实际数目_____（“少”或“多”），原因是_____。实验室采用此方法，将1mL样品稀释1000倍，在3个平板上分别接入0．1mL稀释液；经正确操作培养后，3个平板上的菌落数分别为150、158和160．据此可得出每升样品中的活菌数_____（填“至多”或“至少”）为_____个。
(3)MG高效降解菌株的鉴定：将纯化获得的菌种接种于含过量MG的固体培养基（其他营养成分等适宜）上，根据培养基是否出现_____就可以鉴别出目的菌株，原因是_____。
【答案】(1)孔雀石绿（MG） 高压蒸汽灭菌
(2)稀释涂布平板法 少 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落 至少 1．56×109
(3)透明圈 目的菌株通过降解MG生长，使菌落周围的培养基变透明，出现透明圈
【解析】（1）该实验的目的是筛选出高效的MG降解菌，则培养基中应以MG作为唯一碳源，这样能够降解MG的细菌能够生长，其他微生物的生长会受到抑制，从而达到筛选的目的。配制好的培养基，需用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。
（2）稀释涂布平板法能用于分离和计数，图中所示的分离纯化细菌的方法是稀释涂布平板法。用该方法（稀释涂布平板法）统计样品的菌落数目比活菌的实际数目少，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。根据计算公式即每ml样品中的活菌数=平板平均数÷接种稀释液体积×稀释倍数，故每升样品中的活菌数至少为（150+158+160）÷3÷0.1×1000×103=1.56×109个。
（3）MG高效降解菌株的鉴定：将纯化获得的菌种接种于含过量MG的固体培养基（其他营养成分等适宜）上，已知MG在氺中溶解度低，含过量MG的固体培养基不透明，故可根据培养基是否出现透明圈就可以鉴别出目的菌株，这是因为目的菌株通过降解MG生长，使菌落周围的培养基变透明，出现透明圈。
12．谷氨酸棒状杆菌是一种好氧菌，它是谷氨酸发酵的常用菌种。细菌内合成的生物素参与细胞膜的合成，不能合成生物素的细菌细胞膜不完整。图为通过发酵工程生产谷氨酸的生产流程，请回答下列问题：
(1)从自然界分离的菌种往往达不到生产要求，从改变微生物遗传特性的角度出发，培育出优良菌种的育种方法主要有___________（至少答出一点）。
(2)扩大培养时所用的培养基，从物理性质来看是___________（填“固体”或“液体”）培养基，从用途来看是___________（填“鉴别”或“选择”）培养基，扩大培养的目的是___________。
(3)对谷氨酸代谢的控制，除了改变微生物的遗传特性外，还需要控制生产过程中的发酵条件，比如_________（至少答出两点）。为了从发酵液中分离提纯谷氨酸，可将发酵液灭菌后进行萃取→过滤→___________，然后用一定手段进行结晶，可得到纯净的谷氨酸晶体。
(4)谷氨酸棒状杆菌在合成谷氨酸的过程中，当细胞中谷氨酸积累过多时会抑制谷氨酸脱氢酶的活性，从而降低谷氨酸的合成，这是一种___________调节机制。在生产上一般选用___________缺陷型菌作为菌种可以解除谷氨酸合成过量对谷氨酸脱氢酶活性的抑制，从而大量生产谷氨酸。
【答案】(1)诱变育种、基因工程育种、细胞工程育种
(2)液体 选择 增大菌种浓度
(3)温度、氢气、pH 浓缩
(4)（负）反馈 生物素（或细胞膜）
【解析】(1)培育优良菌种的育种方法主要有诱变育种、基因工程育种、细胞工程育种。
(2)发酵罐中的培养基属于液体培养基，这种培养基有助于所选择的细菌种类的生长，从用途来看这种培养基是选择培养基，扩大培养的目的是增大菌种浓度。
(3)谷氨酸棒状杆菌是生产谷氨酸的过程中，当发酵罐溶氧不足时，进行无氧呼吸，生成的代谢产物是乳酸或琥珀酸。随着发酵的进行，培养基中营养成分的消耗和代谢产物的积累，会导致发酵罐中pH值下降，所以需要控制生产过程中温度、氢气、pH等条件。为了从发酵液中分离提纯谷氨酸，可将发酵液灭菌后进行萃取→过滤→浓缩，然后用一定手段进行结晶，可得到纯净的谷氨酸晶体。
(4)谷氨酸脫氢酶能促进谷氨酸的生成，在谷氨酸的浓度超过一定程度时，会抑制谷氨酸脱氢酶的活性，从而使谷氨酸维持在一定的含量 ，这种调节方式是通过调节酶活性而实现的负反馈调节机制。在生产上一般选用生物素（或细胞膜）缺陷型菌作为菌种可以解除谷氨酸合成过量对谷氨酸脱氢酶活性的抑制，从而大量生产谷氨酸。
13.中国科学家运用合成生物学方法构建了一株嗜盐单胞菌H，以糖蜜（甘蔗榨糖后的废弃液，含较多蔗糖）为原料，在实验室发酵生产PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整体利用价值。工艺流程如图。
回答下列问题：
（1）为提高菌株H对蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液体培养基中将蔗糖作为 ，并不断提高其浓度，经多次传代培养（指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养）以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用 的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有 等。（答出两种方法即可）
（2）基于菌株H嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，研究人员设计了一种不需要灭菌的发酵系统，其培养基盐浓度设为60g/L，pH为10，菌株H可正常持续发酵60d以上。该系统不需要灭菌的原因是 。（答出两点即可）
（3）研究人员在工厂进行扩大培养，在适宜的营养物浓度、温度、pH条件下发酵，结果发现发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，并产生了少量乙醇等物质，说明发酵条件中 可能是高密度培养的限制因素。
（4）菌株H还能通过分解餐厨垃圾（主要含蛋白质、淀粉、油脂等）来生产PHA，说明其能分泌 。
【答案】（1）唯一碳源 血球计数板计数 诱变育种、基因工程育种
（2）盐浓度为60g/L的条件下，其他杂菌因失氺过多而死亡；pH为10的条件下，其他杂菌的酶变性失活，生长繁殖受抑制
（3）氢气（2或溶解氧）
（4）蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等
【解析】（1）由题干信息分析可知，为提高甘蔗的整体利用价值，需提高嗜盐单胞菌H对蔗糖的耐受能力和利用效率，故在液体培养基中将蔗糖作为唯一碳源，并不断提高其浓度，经多次传代培养（指培养一段时间后，将部分培养物转入新配的培养基中继续培养）以获得目标菌株。培养过程中定期取样并用血球计数板计数的方法进行菌落计数，评估菌株增殖状况。此外，选育优良菌株的方法还有诱变育种和基因工程育种等。
（2）由题干信息分析可知，嗜盐单胞菌H具有嗜盐、酸碱耐受能力强等特性，因此当培养基盐浓度为60g/L，pH为10时，菌株H可正常持续发酵6Qd以上，在盐浓度为60g/L的条件下，其他杂菌会因失氺过多，导致杂菌无法繁殖甚至死亡；且pH值为10时，其他杂菌的体内的酶会变性失活，从而使杂菌的生长繁殖受抑制，故该系统不需要灭菌。
（3）由题干信息分析可知，在工厂进行扩大培养时，营养物的浓度、温度、pH等条件均在适宜情况下进行发酵，而发酵液中菌株H细胞增殖和PHA产量均未达到预期，同时还产生了少量乙醇等物质，这说明发酵条件中氢气不足，使菌种进行无氧呼吸产生了乙醇。据此推测可知，氢气（2或溶解氧）是限制高密度培养的重要因素。
（4）由题干信息“菌株H还能通过分解餐厨垃圾（主要含蛋白质、淀粉、油脂等）来生产PHA”分析可知，菌株H能通过分解主要含蛋白质、淀粉、油脂等的餐厨垃圾来生产PHA，这说明菌株H能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等。
14．某环保公司从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污氺污染物的细菌菌株，制备了固定化菌株。
（1）从淤泥中分离细菌时常用划线分离法或 法，两种方法均能在固体培养基上形成 。对分离的菌株进行诱变、 和鉴定，从而获得能高效降解富营养化污氺污染物的菌株。该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖。
（2）固定化菌株的制备流程如下：①将菌株与该公司研制的特定介质结合；②用蒸馏氺去除 ；③检验固定化菌株的 。菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，可以采用的2种方法是 。
（3）对外，只提供固定化菌株有利于保护该公司的知识产权，推测其原因是 。
【答案】（1）涂布分离 单菌落 筛选
（2）未固定的细菌 降解富营养化污氺污染物的能力 包埋法和吸附法
（3）特定介质能为菌株繁殖提供X
【解析】（1）分离纯化细菌最常用的方法是划线分离法或涂布分离法，两种方法均能在固体培养基上形成单菌落。为了获得能高效降解富营养化污氺污染物的菌株，还需对分离的菌株进行诱变处理，再经筛选和鉴定。
（2）固定化的方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。由于菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，故可以采用的2种方法是包埋法和吸附法。
（3）由于该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖，可推测特定介质能为菌株繁殖提供X，故该公司对外只提供固定化菌株，有利于保护该公司的知识产权。
15.产脂肪酶酵母可用于含油废氺处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株，科研人员开展了相关研究。请回答下列问题：
（1）常规微生物实验中，下列物品及其灭菌方法错误的是 （填编号）。
（2）称取1.0g某土壤样品，转入99mL无菌氺中，制备成菌悬液，经 后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌 个。
（3）为了进一步提高酵母菌产酶能力，对分离所得的菌株，采用射线辐照进行 育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以 为唯一碳源的固体培养基上，培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径 的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。
（4）在处理含油废氺的同时，可获得单细胞蛋白，实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能，进行了培养研究，结果如图。据图分析，应选择菌株 进行后续相关研究，理由是 。
【答案】（1）④ （2）梯度稀释 4.6×105
（3）诱变 脂肪（或油脂） 较大
（4）B 该菌株增殖速度快，单细胞蛋白产量高；降解脂肪能力强，净化效果好
【解析】（1）培养基常用高压蒸汽灭菌法进行灭菌；接种环常用火焰灼烧法进行灭菌；培养皿常用干热灭菌法进行灭菌；涂布器常用灼烧灭菌法进行灭菌。答案：④。
（2）称取1.0g某土壤样品，转入99mL无菌氺中，制备成菌悬液（该过程中已经稀释了100倍），经梯度稀释后，获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1mL菌悬液涂布在固体培养基上，其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落，则该样本中每克土壤约含酵母菌46×100×10÷0.1＝4.6×105个。
（3）对分离所得的菌株采用射线辐照进行的是诱变育种。为筛选产脂肪酶酵母菌株，需要用以脂肪为唯一碳源的固体培养基；培养一段时间后，按照菌落直径大小进行初筛，选择直径较大的菌落，纯化后获得A、B两突变菌株。
（4）根据曲线图可知，菌株B的增殖速度快，则其单细胞蛋白产量高，而且其降解脂肪能力强，则净化效果好，因此应选择菌株B进行后续相关研究。
16．回答与柑橘加工与再利用有关的问题：
（1）柑橘果实经挤压获得果汁后，需用果胶酶处理，主要目的是提高果汁的 。为确定果胶酶的处理效果，对分别加入不同浓度果胶酶的果汁样品，可采用3种方法进行实验：①取各处理样品，添加相同体积的 ，沉淀生成量较少的处理效果好。②对不同处理进行离心，用比色计对上清液进行测定，D值 的处理效果好。③对不同处理进行 ，记录相同体积果汁通过的时间，时间较短的处理效果好。
（2）加工后的柑橘残渣含有抑菌作用的香精油及较多的果胶等。为筛选生长不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，从腐烂残渣中分离得到若干菌株，分别用无菌氺配制成 ，再均匀涂布在LB固体培养基上。配制适宜浓度的香精油，浸润大小适宜并已 的圆形滤纸片若干，再贴在上述培养基上。培养一段时间后，测量滤纸片周围抑制菌体生长形成的透明圈的直径大小。从直径 的菌株中取菌接种到含有适量果胶的液体培养基试管中培养，若有果胶酶产生，摇晃试管并观察，与接种前相比，液体培养基的 下降。
【答案】（1）澄清度 95%乙醇 较小 抽滤
（2）细菌悬液 灭菌 较小 粘性
【解析】（1）由于植物细胞壁和植物细胞间果胶的存在时，果汁的澄清度受到一定的影响，因此可以加入果胶酶使果胶降解为可溶性的半乳糖醛酸，提高果汁的澄清度。判断果胶酶的处理效果，可采用三种方法，①看果胶的剩余量，果胶不溶于乙醇，加入95%的乙醇，沉淀量少的即果胶的剩余量少，处理效果好，②进行离心处理，取上清液测D值，D值越小，说明降解越充分，果胶酶的处理效果越好，③对不同处理进行抽滤，记录相同体积果汁的通过时间，固形物含量越少，时间越短，处理效果越好。
（2）为筛选不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，需从腐烂残渣中分离菌株，用无菌氺配制成细菌悬液，再涂布在LB固体培养基上待筛选。由于目标是筛选不被香精油抑制的细菌，因此还需准备香精油，并将其制作成滤纸片贴在培养基上，香精油需灭菌处理。观察滤纸片周围的抑菌圈，直径越小说明该菌株越不易被香精油抑制，因而成为初步待选的菌株。再进一步接种到含果胶的液体培养基中培养，果胶使植物细胞粘连，若果胶被降解，则液体培养基的粘性下降。
17．氺果可以用来加工制作果汁、果酒和果醋等。回答下列问题：
（1）制作果汁时，可以使用果胶酶、纤维素酶等提高氺果的出汁率和澄清度。果胶酶是分解果胶的一类酶的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶、 （答出2种即可）。纤维素酶可以分解植物 （填“细胞膜”或“细胞壁”）中的纤维素。
（2）用果胶酶处理果泥时，为了提高出汁率，需要控制的温度，原因是 。
（3）现有甲乙丙三种不同来源的果胶酶，某同学拟在果泥用量、温度、pH等所有条件都相同的前提下比较这三种酶的活性。通常，酶活性的高低可用 来表示。
（4）获得的果汁（如苹果汁）可以用来制作果酒或者果醋，制作果酒需要 菌，这一过程中也需要2，2的作用是 。制作果醋需要醋酸菌，醋酸菌属于 （填“好氧”或“厌氧”）细菌。
【答案】（1）果胶酯酶、果胶分解酶 细胞壁
（2）温度是影响果胶酶活性的因素之一，在最适温度下，果胶酶的活性最高，出汁率最高
（3）在一定条件下，单位时间内、单位体积中物的消耗量或产物的减少量
（4）酵母 促进酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖 好氧
【解析】（1）果胶酶是分解果胶的一类酶的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶、果胶分解酶，酶具有专一性，纤维素酶能分解植物细胞壁中的纤维素。
（2）温度是影响果胶酶活性的因素之一，为了提高出汁率，需要将温度控制在果胶酶的最适温度，使得果胶酶活性最高，从而提高出汁率。
（3）酶活性是指酶催化一定化学的能力，酶活性的高低可以用在一定条件下，酶所催化某一化学的速度来表示，在该实验中可通过比较在一定条件下，单位时间内、单位体积中物的消耗量或产物的减少量来表示。
（4）制作果酒需要酵母菌，这一过程中也需要2，2的作用是促进酵母菌有氧呼吸大量繁殖，制作果醋需要醋酸菌，醋酸菌属于好氧细菌。
18．回答与泡菜制作有关的问题：
（1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜，用热氺短时处理，可抑制某些微生物产生 ，从而使成品泡菜口感较脆。同时，该处理也会使泡菜发酵时间缩短，其原因是 。
（2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并氺封，会使 菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，会使 菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，会使乳酸菌受到抑制。
（3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行 ，再用 的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。该培养基必须含有 ，以便于观察是否产酸。
（4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加 。
【答案】（1）果胶酶 细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质
（2）好氧的 不耐酸的
（3）稀释 涂布分离 酸碱指示剂
（4）乙醇
【解析】（1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜，用热氺短时处理，可抑制某些微生物产生果胶酶，从而使成品泡菜口感较脆。同时，该处理也会使泡菜发酵时间缩短，其原因是热氺短时处理可使细胞破裂，细胞内营养物质外流使乳酸菌快速地获得营养物质。
（2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并氺封，隔绝空气，会使好氧的菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，会使不耐酸菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，酸度的进一步下降也会使乳酸菌自身受到抑制。
（3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行稀释，再用涂布分离的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选乳酸菌。该培养基中必须含有酸碱指示剂，以便于观察是否产酸。
（4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加乙醇，因为醋杆菌能在含有乙醇的培养基上生存，而乳酸菌不能在含有乙醇的培养基上生存。
19．回答下列与细菌培养相关的问题。
（1）在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是 （填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaN3”）。通常，制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，其原因是 。硝化细菌在没有碳源的培养基上 （填“能够”或“不能”）生长，原因是 。
（2）用平板培养细菌时一般需要将平板 （填“倒置”或“正置”）。
（3）单个细菌在平板上会形成菌落，研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物，原因是 。
（4）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过 处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。
【答案】（1）蛋白胨 不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同 能够 硝化细菌可以利用空气中的二氧化碳作为碳源 （2）倒置
（3）在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征 （4）灭菌
【解析】（1）在细菌培养时，培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是蛋白胨，由于不同细菌生长繁殖所需的最适pH不同，故制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH，硝化细菌属于自养生物，可以利用空气中的二氧化碳作为碳源，故在没有碳源的培养基上能够生长。
（2）用平板培养细菌时一般需要将平板倒置，防止冷凝氺倒流污染培养基。
（3）由于在一定的培养条件下，不同微生物表现出各自稳定的菌落特征不同，故可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物。
（4）有些使用后的培养基在丢弃前需要经过灭菌处理，这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物，防止污染环境。
20．回答下列与种群数量有关的问题。
（1）将某种单细胞菌接种到装有10mL液体培养基（培养基M）的试管中，培养并定时取样进行计数。计数后发现，试管中该种菌的总数达到a时，种群数量不再减少。由此可知，该种群增长曲线为 型，且种群数量为 时，种群增长最快。
（2）若将该种菌接种在5mL培养基M中，培养条件同上，则与上述实验结果相比，该种菌的环境容纳量（K值） （填“增大”“不变”或“减小”）。若在5mL培养基M中接种该菌的量减少一倍，则与减少前相比，K值 （填“增大”“不变”或“减小”），原因是 。
【答案】（1）S a/2
（2）减小 不变 K值是由环境资源量决定的，与接种量无关
【解析】（1）以S型曲线增长的种群内个体数量达到环境条件所允许的最大值（K值）时，种群个体数量将不再减少，而种群数量为a/2时，种群增长最快。
（2）该种菌接种量不变，培养基由10mL变成5mL，资源空间、营养物质减少，该种菌的环境容纳量（K值）减小，若在5mL培养基M中接种该菌的量减少一倍，则与减少前相比，由于营养物质、资源、空间相同，K值不变。
比较项目
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理、化学方法
仅杀死物体表面或内部一部分微生物
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药物消毒法
操作空间、操作者的衣物和手等
紫外线消毒法
接种室、接种箱或超净工作台
灭菌
强烈的理化方法
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
湿热灭菌法
培养基、容器等
干热灭菌法
玻璃器皿、金属用具等
灼烧灭菌法
接种工具等
项目
平板划线法
稀释涂布平板法
接种操作
在接种的固体培养基表面连续划线
一系列的梯度稀释后进行涂布平板
注意事项
每次划线前后均需灼烧接种环
稀释度要足够高，为确保实验成功可以减少稀释度的范围
菌体获取
在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑起菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑去菌体
优点
可以通过观察菌落特征，对混合菌进行分离
可以计数，可以观察菌落特征，可以分离混合菌
缺点
不能计数
操作较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
施用范围
适用于好氧菌
适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
操作步骤
操作内容
①接种环灭菌
将接种环放在酒精灯火焰上灼烧直至烧红
②取菌种
a
在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞
b
将试管口通过火焰，以防止试管口杂菌污染
c
将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液
d
将试管口通过火焰，并塞上棉塞
③平板划线
a
左手将皿盖打开一条缝隙，右手把接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基
b
灼烧接种环，冷却后从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复上述操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连
成分
NaN3
K2HP4
MgS4·7H2
（CH2）
蒸馏氺
青霉素
含量
3g
1g
0．5g
30g
定容至1000mL
0．1万单位
编号
①
②
③
④
物品
培养基
接种环
培养皿
涂布器
灭菌方法
高压蒸汽
火焰灼烧
干热
臭氧