【寒假衔接讲义】人教版（选择性必修3）高中生物 高二寒假 第07讲 重组DNA技术的基本工具（教师版+学生版）.zip

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1.阐明重组DNA技术所需的三种工具的作用。
2.提升对基因工程的理解能力，能够合理分析在基因氺平产生的问题。
3.了解进行DNA的粗提取和鉴定的原理，进行DNA的粗提取和鉴定的操作。
3.认同基因工程的作用及意义，认识到生物技术的发展离不开理论研究和技术创新。
【基础知识】
一、基因工程的概念
二、限制性核酸内切酶
（1）来源：主要从原核生物中分离出来。
（2）种类：约4000种
（3）作用:识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
（4）限制酶识别序列的长度最常见的为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个、或其他数量的核苷酸组成。
①在中轴线两侧切割，形成黏性末端。如：EcRI限制酶能识别GAATTC序列，为6个核苷酸，并在G和A之间切开。
②在中轴线处切割，形成平末端。如：Sma I限制酶能识别CCCGGG序列，为6个核苷酸，并在G和C之间切开。
总结归纳
1.限制性核酸内切酶是可以识别并附着特定的核苷酸序列，并对每条链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。
2.限制作用实际就是限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。一般不切割自身的DNA分子，是由于甲基化的修饰作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保护，通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。
3.根据酶的功能特性、大小及时所需的辅助因子，限制性内切酶可分为两大类，即I类酶和Ⅱ类酶。
其中，Ⅱ类酶有EcR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等，在所识别的特定碱基序列上有特定的酶切位点，因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后，可产生特异性的酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。
4.限制酶识别DNA序列中的回文序列。回文序列指的是双链DNA或RNA分子中的特定的核苷酸片段，该片段在其中一条链上按5'到3'读取的序列与其互补链上按相同的5'到3'读取的序列一致。例如，DNA序列ACCTAGGT之所以是回文序列，是因为它的互补序列是TGGATCCA，而反向互补序列是ACCTAGGT，和其原来序列一致。有些限制酶的切割位点在回文的一侧（如EcR I、BamH I、Hind等），因而可形成粘性末端；另一些Ⅱ类酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等，切割位点在回文序列中间，形成平末端。
三、DNA连接酶
(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。即把脱氧核糖和磷酸交替连接而构成的DNA骨架上的缺口连接起来。
(2)类型：
归纳总结
1.DNA连接酶分为两大类:一类是利用ATP 催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键的依赖ATP的DNA 连接酶；另一类是利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 的能量催化两个核苷酸链之间形成磷酸二酯键的依赖NAD+的DNA 连接酶。DNA连接酶是通过催化形成磷酸二酯键把两条DNA（双股或是单股DNA）黏合成一条。
2.教材中提到的E·cliDNA连接酶，来源于大肠杆菌，可用于连接粘性末端；T4DNA连接酶，来源于T4噬菌体，可用于连接粘性末端和平末端，但连接效率低。E·cliDNA连接酶对胰蛋白酶敏感，可被其氺解。氺解后形成的小片段仍具有部分活性，可以催化酶与NAD(而不是ATP)形成酶-AMP中间物，但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。T4DNA连接酶是ATP依赖的DNA连接酶，催化两条DNA双链上相邻的5′磷酸基和3′羟基之间形成磷酸二酯键。
四、基因进入受体细胞的载体
（1）载体作用：将目的基因载入受体细胞。利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
（2）载体种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等
（3）最常用载体：质粒
特点：
①裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA外，具有自我复制能力的环状双链DNA。
②有一个至多个限制酶切割位点。
③在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
④有特殊的标记基因，如：抗生素的抗性基因（四环素抗性基因(tetr)、氨苄青霉素抗性基因(ampr)等）、荧光蛋白基因（绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)。
⑤对细胞无毒无害。
⑥大小适中，便于提取和操作。
归纳总结
1.基因工程中常用的运载体主要有两类：
一类运载体是噬菌体或某些病毒等。
另一类是细菌细胞质的质粒，它是一种相对分子质量较小、独立于拟核之外的环状DNA，有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌拟核DNA中，随着拟核DNA的复制而复制。
2.质粒作为载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的质粒。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。
3.质粒载体都有三个共同的特征：一个复制子、一个选择性标志和一个克隆位点。
复制子是含有DNA复制起始位点的一段DNA，也包括表达由质粒编码的复制必需的RNA和蛋白质的基因。
克隆位点是限制性内切酶切割位点，外源性DNA可由此插入质粒内，而且并不影响质粒的复制能力，或为宿主提供选择性表型。一般地，载体都含有多克隆位点，多克隆位点的存在可以确保载体合适大部分的DNA片段，可以针对插入片段提供特定的酶切位点图谱，防止插入片段插入不恰当的位置，在质粒重组操作方面具有更大的灵活性。
编码抗生素抗性的基因是最普遍的细菌选择性标志（如pBR322）。主要的抗生素抗性基因有：氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因和卡那霉素抗性基因四种。
五、DNA的粗提取和鉴定
（一)提取生物大分子的基本思路
选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
DNA粗提取的基本思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
（二)提取DNA的基本原理
1.DNA在NaCl中的的溶解性：
在NaCl溶液浓度低于0.14 ml/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的减少而逐渐降低；在0.14 ml/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续减少时，DNA的溶解度又逐渐增大。当氯化钠的物质的量浓度为2ml/L时，DNA的溶解度最大；浓度为0.14ml/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。
2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
（1）对酶的耐受性：蛋白酶能氺解蛋白质，但对DNA没有影响。
（2）对温度的耐受性：大多数蛋白质不能忍受60～80 ℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。
（3）对洗涤剂的耐受性：洗涤剂能够瓦解细胞膜，去除脂质和蛋白质但对DNA没有影响。
3.DNA在酒精溶液中的溶解性
DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。将DNA与蛋白质进一步分离。
（三）DNA的鉴定
沸氺浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
归纳总结
实验材料的选取：
凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。
2.破碎细胞，获取含DNA的滤液
如果是动物细胞，则破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏氺，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
3.去除滤液中的杂质：
法一：DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同。当氯化钠的物质的量浓度为2ml/L时，DNA的溶解度最大；浓度为0.14ml/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。
法二：是蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA，从而使提取的DNA与蛋白质分开；
法三：是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。
【考点剖析】
考点一：限制性内切酶
例1．图甲表示某环型DNA分子经限制性核酸内切酶（EcRⅠ）完全酶切后的片段电泳结果若改变条件使其酶切不充分就有可能获得如图乙所示的电泳结果（Kb即千个碱基对）。下列叙述错误的是（ ）
A．该DNA分子全长至少为7 Kb，该DNA分子中至少含有4个EcRⅠ酶切位点
B．时间越长，得到图甲结果的可能性越大
C．限制性核酸内切酶主要来自原核生物，化学本质都是蛋白质
D．适当减少EcRⅠ浓度，更可能得到图乙的结果
【答案】A
【解析】据题意和图示分析可知：环型DNA分子经限制性核酸内切酶（EcRⅠ）完全酶切后得到4.0、1.5、1.0和0.5四种长度的DNA片段，说明该DNA分子全长至少为7Kb，至少含有4个EcRⅠ酶切位点。时间越长或适当减少EcRⅠ浓度，DNA被切割越彻底，得到图甲结果的可能性越大。环型DNA分子经限制性核酸内切酶（EcRⅠ）完全酶切后得到4.0、1.5、1.0和0.5四种长度的DNA片段，说明该DNA分子全长至少为7Kb，环状DNA分子，可以被限制性核酸内切酶（EcRⅠ）完全酶切后得到至少4个DNA片段，说明该DNA分子中至少含有4个EcRⅠ酶切位点，故A正确；时间越长，DNA被切割越彻底，得到图甲结果的可能性越大，故B正确；限制性核酸内切酶主要来自原核生物，限制酶的化学本质是蛋白质，C正确；
D、适当减少EcRⅠ浓度，可得到图甲的结果，故D错误。
考点二：DNA连接酶
例2．限制酶和DNA连接酶是重组DNA技术常用的工具酶，限制酶通常将DNA分子切割成带有黏性末端的DNA片段，而DNA连接酶可缝合带有黏性末端的DNA片段。据图分析错误的是（ ）
A．图示三个黏性末端一定由两种不同的限制酶切割产生
B．图示中共有两种黏性末端，其中甲与乙黏性末端相同
C．a点核苷酸之间通过磷酸二酯键连接，b处核苷酸之间通过氢键连接
D．催化甲形成的限制酶有可能不识别由甲、乙形成的重组DNA分子
【答案】A
【解析】限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端和平末端两种；DNA连接酶连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。切割产生甲的限制酶的识别列为：GAATTC//CTTAAG，切割产生乙的限制酶的识别列为： CAATTG//GTTAAC，切割产生丙的限制酶的识别序列为：CTTAAG//GAATTC，由此可见，甲、乙、丙的黏性末端是由三种限制酶催化产生的，A错误；由图可知，甲、乙的黏性末端相同，均为AATT—，丙的黏性末端为TTAA—，因此图示中共有两种黏性末端，B正确；a点属于两个核苷酸之间通过磷酸二酯键连接成链，b点属于两条链之间的核苷酸，通过氢键相连，C正确；切割甲的限制酶的识别列为：GAATTC//CTTAAG，而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为：GAATTG//CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。
考点三、基因工程的载体
例3．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法正确的是（ ）
A．质粒不仅存在于细菌中，也存在于某些病毒中B．细菌的基因只存在于质粒上
C．质粒为小型环状DNA分子D．质粒是基因工程中的重要工具酶之一
【答案】D
【解析】基因工程常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。质粒主要存在于细菌、酵母菌等生物中，病毒中没有质粒，A错误；细菌基因主要存在于拟核DNA上，也有少数存在于质粒上，B错误；质粒为小型环状DNA分子，存在于细胞核外或拟核外的细胞质基质中，C正确；质粒是基因工程中的重要工具之一，但不是工具酶，基因工程中的工具酶是限制酶和DNA聚合酶，D错误。
考点四、DNA的粗提取和鉴定
例4．如图是“DNA粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，相关叙述正确的是（ ）
A. 图1中溶液a是0.14 ml•L-1的NaCl溶液
B. 图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白质等杂质不溶
C. 图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
D. 图2试管1的作用是证明2 ml•L-1 NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
【答案】D
【解析】图1中溶液a是2ml•L-1的NaCl溶液，A错误；图1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶，B错误； 图2所示实验操作中有一处明显错误（试管2中未将DNA溶于2ml•L-1的NaCl溶液中），可能导致试管2中蓝色变化不明显，C正确； 图2试管1的作用是证明2 ml•L-1 NaCl溶液遇二苯胺不会出现蓝色，D错误。
【真题演练】
1.(2021山东高考，13)粗提取 DNA 时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏氺并搅拌，过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出 DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（ ）
A. 加入适量的木瓜蛋白酶
B. 37～40℃的氺浴箱中保温 10～15 分钟
C. 加入与滤液体积相等的、体积分数为 95%的冷却的酒精
D. 加入 NaCl 调节浓度至 2ml/L→过滤→调节滤液中 NaCl 浓度至 0．14ml/L
2.（2020海南高考生物，10）下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A. 羊的成熟红细胞可作为提取DNA的材料
B. 提取植物细胞的DNA时，需要加入一定量的洗涤剂和食盐
C. 预冷的酒精溶液能抑制核酸氺解酶活性，防止DNA氺解
D. 在沸氺浴条件下，DNA与二苯胺呈现蓝色
3.（2018•北京）用XhⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（ ）
A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同
B．图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C．泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物
D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA
4.（2017•北京）为了减少菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是（ ）
A．用限制性核酸内切酶EcRⅠ和连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
5．（2021·全国乙卷高考真题）用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。
回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E. cli DNA连接酶和T4DNA连接酶。上图中__________酶切割后的DNA片段可以用E. cli DNA连接酶连接。上图中___________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是____________。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能___________；质粒DNA分子上有______________，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是______________。
（4）表达载体含有启动子，启动子是指__________________。
6.（2021海南）25．CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。
（1）过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是____________。
（2）过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是____________。
（3）过程③~⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是____________。随后，Cas9蛋白可切割____________序列。
（4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA氺平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是____________，基因敲除成功的判断依据是____________。
（5）某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：________________________。
7.（2021辽宁，24）PHB2蛋白具有抑制细胞增殖的作用。为初步探究某动物PHB2蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖的原因，研究者从基因数据库中获取了该蛋白的基因编码序列（简称phb2基因），大小为0．9kb（1kb=1000碱基对），利用大肠杆菌表达该蛋白。回答下列问题：
（1）为获取phb2基因，提取该动物肝脏组织的总RNA，再经__________过程得到cDNA，将其作为PCR的模板，并设计一对特异性引物来扩增目的基因。
（2）图1为所用载体图谱示意图，图中限制酶的识别序列及切割位点见下表。为使phb2基因（该基因序列不含图1中限制酶的识别序列）与载体正确连接，在扩增的phb2基因两端分别引入__________和__________两种不同限制酶的识别序列。经过这两种酶酶切的phb2基因和载体进行连接时，可选用__________（填“E．cliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”）。
相关限制酶的识别序列及切割位点
注：箭头表示切割位点
（3）转化前需用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使其处于__________的生理状态，以提高转化效率。
（4）将转化后的大肠杆菌接种在含氨苄青霉素的培养基上进行培养，随机挑取菌落（分别编号为1、2、3、4）培养并提取质粒，用（2）中选用的两种限制酶进行酶切，酶切产物经电分离，结果如图2，________号菌落的质粒很可能是含目的基因的重组质粒。
注：M为指示分子大小的标准参照物；小于0．2kb的DNA分子条带未出现在图中
（5）将纯化得到的PHB2蛋白以一定浓度添加到人宫颈癌细胞培养液中，培养24小时后，检测处于细胞周期（示意图见图3）不同时期的细胞数量，统计结果如图4。分析该蛋白抑制人宫颈癌细胞增殖可能的原因是将细胞阻滞在细胞周期的__________（填“G1”或“S”或“G2/M”）期。
【过关检测】
1.在基因工程操作中限制酶是不可缺少的工具。下列关于限制酶的叙述错误的是( )
A.限制酶主要是从原核细胞中获取的
B.每一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列
C.限制酶的作用位点是相邻核苷酸之间的氢键
D.同一种限制酶切割不同的DNA分子可产生碱基互补配对的黏性末端
2.下表为4种限制酶的识别序列和切割位点(↓表示切割位点),下列叙述正确的是( )
A.在使用限制酶的同时还需要解旋酶
B.限制酶1和3切割DNA分子产生的黏性末端相同
C.图中限制酶的识别序列都由4个核苷酸组成
D.限制酶4作用后产生的是平末端
3.以下是几种不同限制性核酸内切酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列的叙述中, 正确的是（ ）
A．以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的
B．②片段是在酶切位点为的限制酶作用下形成的
C．①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下形成的重组DNA分子
D．限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
4.DNA连接酶是基因工程的必需工具,下列有关DNA连接酶的叙述,正确的是( )
A.DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子
B.DNA连接酶发挥作用时需要识别特定的脱氧核苷酸序列
C.DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接黏性末端和平末端
5.作为基因工程的运输工具——载体,必须具备的条件及理由对应错误的是( )
A.能够在宿主细胞中稳定保存并大量复制,以便提供大量的目的基因
B.具有一个至多个限制酶切割位点,以便于目的基因的插入
C.具有某些标记基因,以便目的基因能够准确定位与其结合
D.对宿主细胞无伤害,以免影响宿主细胞的正常生命活动
6.[2023宁夏石嘴山高三月考]在重组DNA技术中,将外源基因导入受体细胞,通常利用质粒作为载体。下列关于质粒的叙述,正确的是( )
A.质粒是一种只存在于原核细胞中的、结构简单的环状DNA分子
B.质粒的复制和表达过程遵循中心法则和碱基互补配对原则
C.外源基因只有通过质粒整合到受体细胞的DNA中才能表达
D.大多数天然质粒都不需要人工改造,可以直接作为载体使用
7.下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是( )
A.该实验不能选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料
B.将洋葱研磨液置于4 ℃冰箱中能防止DNA被降解
C.该实验中加入体积分数为70%的预冷酒精可用来析出、纯化DNA
D.用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行沸氺浴加热
8.如图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的部分操作流程。下列相关叙述正确的是( )
A.将图1中的研磨液过滤后保留沉淀
B.图2过程,用玻璃棒进行快速交叉搅拌会使DNA析出更快
C.图2析出得到的白色丝状物只能溶于2 ml/L的NaCl溶液
D.图3对提取后的DNA进行鉴定,两支试管中均要加入二苯胺试剂
8.下列有关基因工程工具的叙述,错误的是( )
A.限制性内切核酸酶只能用于切割获取目的基因
B.能连接黏性末端的DNA连接酶不一定能连接平末端
C.DNA连接酶缝合两个黏性末端时有氢键的重新连接
D.基因工程中使用的载体有质粒、某些动植物病毒及噬菌体
9.现有一长度为3 000碱基对(bp)的线性DNA分子,用限制性内切核酸酶完全酶切后,进行凝胶电泳,使酶切产物分开。用酶H单独酶切,结果如图1;用酶B单独酶切,结果如图。用酶H和酶B同时酶切,结果如图3。该DNA分子的结构及其酶切图谱是( )
10.像BclⅠ(—T↓GATCA—)、BglⅡ(—A↓GATCT—)、MbⅠ(—↓GATC—)这样,识别序列不同但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。如图表示含目的基因的DNA片段及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和含目的基因的DNA片段进行切割,并用DNA连接酶进行连接。下列分析错误的是( )
11.如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图,下列相关叙述错误的是( )
A.图1中的溶液a和图2中的溶液b的成分不同,溶液b是 2 ml·L-1的NaCl溶液
B.图1所示操作的原理是DNA能溶于酒精,而某些蛋白质等杂质不溶于酒精
C.图2所示实验的结果是试管1不变蓝,试管2变蓝色
D.图2所示实验中设置试管1的目的是作为对照实验
12.根据基因工程的有关知识,回答下列问题。
(1)限制酶切割DNA分子后产生的片段,其末端形式有 和 。
(2)质粒用EcRⅠ切割后产生的片段如下:
AATTC……G
G……CTTAA
为使载体与目的基因相连,含有目的基因的DNA片段除可用EcRⅠ切割外,还可用其他限制酶切割,“其他限制酶”必须具有的特点是 。
(3)实际操作中,往往用EcRⅠ和另一种限制酶同时切割质粒和外源DNA分子,其优点在于可防止 。
(4)按其来源不同,基因工程中常常使用的DNA连接酶有两类,即 DNA连接酶和 DNA连接酶。
(5)基因工程中除质粒外, 和 也可作为载体。质粒中通常含有特殊的标记基因,这些标记基因的作用是 。
项 目
具体内容
操作对象
基因
原 理
基因重组
操作环境
体外
操作氺平
分子氺平
结 果
获得人们需要的新的生物类型和生物产品
优 点
克服远缘杂交不亲和的障碍;定向改造生物的性状
名称
识别序列及切割位点
名称
识别序列及切割位点
HindⅢ
A↓AGCTT
TTCGA↑A
EcRI
G↓AATTC
CTTAA↑G
PvitⅡ
CAG↓CTG
GTC↑GAC
PstI
CTGC↓AG
GA↑CGTC
KpnI
G↓GTACC
CCATG↑G
BamHI
G↓GATCC
CCTAG↑G
限制酶1
—↓GATC—
限制酶2
—CATG↓—
限制酶3
—G↓GATCC—
限制酶4
—GG↓CGCC—
选项
切割质粒
切割含目的基因的DNA片段
结果分析
A
BclⅠ和BglⅡ
BclⅠ和BglⅡ
形成的重组质粒的碱基排列顺序不一定相同
B
BclⅠ和BglⅡ
MbⅠ
切割后的质粒不会自我环化,切割后的目的基因会自我环化
C
MbⅠ
BclⅠ和BglⅡ
形成的重组质粒可被MbⅠ再次切开,但可能无法被BclⅠ和BglⅡ再次切开
D
MbⅠ
MbⅠ
切割后的质粒可以自我环化,切割后的目的基因也可以自我环化