专题35 基因工程-【提分讲练】最新高考生物二轮复习专题解读和分层练习

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【要点速记】
1．限制性核酸内切酶（简称限制酶）
（1）来源：主要是从___________中分离纯化出来的。
（2）作用：识别特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的____________。
（3）作用结果：
2．DNA连接酶
（1）作用：将DNA片段拼接成新的DNA分子。
（2）常见类型及功能：
3．载体
（1）种类：
①常用载体：质粒，为细菌拟核之外小型__________分子。
②其他载体：__________________、动植物病毒等。
（2）特点和意义：
（3）作用：
①作为__________，携带外源DNA片段进入受体细胞。
②利用它在宿主细胞内对_____________进行大量复制。
【重难点突破】
1．DNA连接酶和限制酶的关系
（1）限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。
（2）DNA连接酶起作用时，不需要模板。
2．与DNA有关的4种酶比较
考点二、基因工程的基本操作程序
【要点速记】
1．目的基因的获取
（1）目的基因：主要指____________的基因，也可以是一些具有________作用的因子。
（2）获取目的基因的方法
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
（1）目的：使目的基因____________________________________，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。
（2）基因表达载体的组成及作用：
（3）构建过程：
3．将目的基因导入受体细胞“三种类型”比较
4．目的基因的检测与鉴定的“两个水平”
【重难点突破】
1．基因表达载体的构建——核心步骤
（1）需要用到的工具：限制酶、DNA连接酶、载体。
（2）基因表达载体组成包含目的基因、启动子、终止子、标记基因等。
（3）基因表达载体要能在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代，还要能表达和发挥作用。
（4）启动子（DNA片段）≠起始密码子（RNA）；终止子（DNA片段）≠终止密码子（RNA）。
（5）目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子和终止子的调控，所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位。
（6）构建基因表达载体一般用同种限制酶切割载体和目的基因。也可用两种限制酶切割，以避免质粒或目的基因自身连接。
（7）限制酶切割载体时不能破坏标记基因，以避免标记基因不能表达，不能筛选出含有目的基因的受体细胞。
2．PCR技术与DNA复制比较
考点三、基因工程的应用和蛋白质工程的崛起
【要点速记】
1．植物基因工程
（1）培育抗虫转基因植物：用于杀虫的基因主要是__________基因、____________基因、______________基因、植物凝集素基因等。
（2）抗病转基因植物：使用最多的是____________基因和____________基因。
（3）抗逆转基因植物：抗逆基因有_______基因、__________基因等。
（4）利用转基因改良植物的品质：如提高玉米中某种氨基酸含量、延长番茄储存时间、培育新花色的矮牵牛等。
2．动物基因工程
（1）提高动物生长速度：将外源___________基因转入动物体内，可以提高产量。
（2）用于改善畜产品的品质：将___________基因导入奶牛基因组，可以使转基因牛分泌的乳汁中乳糖的含量大大减低。
（3）用转基因动物生产药物：将__________基因与______________的启动子等调控组件重组在一起，培育乳腺生物反应器。
（4）用转基因动物作器官移植的__________。
3．基因工程药品：
（1）受体细胞：多为___________。原因是其_______________________________。
（2）方式：利用基因工程培育“_________”来生产药品。
（3）成果：利用“工程菌”可生产细胞因子、抗体、疫苗、激素等。
4．基因治疗：
（1）概念：把______导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，达到治疗疾病的目的。
（2）类型：体外基因治疗和_______________。
（3）实质：正常基因的表达掩盖病变基因的表达，达到治疗疾病的目的。
（4）成果：将腺苷酸脱氨酶基因转入患者的___________中，治疗复合型免疫缺陷症。
5．蛋白质工程
（1）流程图：
A．________，B．_________，C．__________，D．_________，E．_________。
（2）手段：__________或__________。
（3）结果：改造了现有蛋白质或制造出____________。
（4）应用：主要集中应用于对____________进行改造，改良生物性状。
【重难点突破】
1．基因工程应用中的几个易错点
（1）青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的；
（2）动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体型巨大的个体；
（3）原核生物的基因（如抗虫基因）可以作为真核生物（棉花）的目的基因；
（4）Bt毒蛋白基因产生的Bt毒蛋白并无毒性，进入昆虫消化道被分解成多肽后才产生毒性。
2．概念辨析
（1）基因诊断：也称为DNA诊断或基因探针技术，即在DNA水平分析检测某一基因，从而对特定的疾病进行诊断。
（2）基因探针：是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列。
（3）基因芯片：将数以万计、乃至百万计的基因探针有规律地排列在支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列。
（4）基因治疗：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。
3．蛋白质工程的原理、途径：
（1）原理：通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造出一种新的蛋白质。
（2）途径：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）。
4．比较基因治疗与基因诊断
要点速记答案
考点一、1．（1）原核生物 （2）磷酸二酯键 （3）黏性末端 平末端 2．（2）大肠杆菌 黏性末端 黏性 磷酸二酯键 3．（1）环状DNA λ噬菌体的衍生物 （2）一至多个 标记 （3）运载工具 目的基因
考点二、1．（1）编码蛋白质 调控 （2）基因文库 基因组文库 PCR DNA双链复制 引物 Taq酶 变性 引物 Taq酶 指数 化学 核苷酸序列 DNA合成仪 2．（1）在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代 （2）启动子 标记基因 目的基因 3．体细胞或受精卵 受精卵 原核细胞 Ti质粒的T－DNA 染色体的DNA 显微注射 新性状 感受态 感受态细胞 4．DNA分子杂交 分子杂交 抗原－抗体杂交 分子 个体
考点三、1．（1）Bt毒蛋白 蛋白酶抑制剂 淀粉酶抑制剂 （2）病毒外壳蛋白 病毒的复制酶 （3）抗旱 抗除草剂 2．（1）生长激素 （2）肠乳糖酶 （3）药用蛋白 乳腺蛋白基因 （4）供体 3．（1）原核细胞 繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少 （2）工程菌 4．（1）正常基因 （2）体内基因治疗 （4）淋巴细胞 5．（1）转录 翻译 分子设计 多肽链 预期功能 （2）基因修饰 基因合成 （3）新的蛋白质 （4）现有蛋白质
专题35 基因工程（基础）
一、单选题
1．基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段时需使用（ ）
A．同种限制酶B．两种限制酶
C．同种DNA连接酶D．两种DNA连接酶
【答案】A
【解析】基因工程中，切割载体和含有目的基因的DNA片段时，需要使用同种限制酶，以产生相同的黏性末端，再在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子．故选A。
2．下列关于蛋白质工程实施的叙述，不正确的是（ ）
A．可以根据人类的需要，设计并制造出自然界不存在的全新蛋白质
B．可以根据功能的需要替代蛋白质中的某一个肽段或一个特定的结构区域
C．可以通过基因工程间接地改造蛋白质中特定的一个或几个氨基酸
D．可以通过人工化学合成的方法直接对蛋白质的氨基酸进行改造
【答案】D
【解析】蛋白质工程是在原有蛋白质的基础上，根据人们的需求对蛋白质分子作出的定向的改造，可以设计并制造出自然界不存在的全新蛋白质，A正确；蛋白质工程可以根据功能的需要替代蛋白质中的某一个肽段或一个特定的结构区域，B正确；蛋白质工程较小的改造是改造蛋白质分子中某些活性部位的1个或几个氨基酸残基通过定点诱变技术，以获得人类所需要的目的蛋白质，C正确；蛋白质工程不能通过人工化学合成的方法直接对蛋白质的氨基酸进行改造，D错误。
3．下列关于基因文库的叙述，正确的是（ ）
A．可以根据目的基因的有关信息，从基因文库中获取目的基因
B．基因组文库中基因不具有内含子，部分基因文库中具有
C．基因组文库中基因不具有启动子，部分基因文库中具有
D．基因组文库中基因可以在物种间交流，部分基因文库不可以
【答案】A
【解析】基因文库中含有某种生物的全部基因，根据目的基因的相关信息（如目的基因的序列），可从基因文库中得到所需目的基因，A正确；部分基因文库中的基因是由mRNA反转录而来，mRNA是由基因编码区的外显子转录而来，故部分基因文库中的基因不含有内含子，而基因文库中含有内含子，B错误；部分基因文库中的基因是由mRNA反转录而来，mRNA是由基因编码区的外显子转录而来，因此部分基因文库中的基因不含启动子和终止子，而基因组文库中具有启动子和终止子，C错误；基因组文库中的基因部分可以在物种间进行交流，部分基因文库中的基因可以在物种间进行交流，D错误。
4．目前科学家们通过蛋白质工程制造出了蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等。采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是（ ）
①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列
②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计序列
③蓝色荧光蛋白基因的合成
④表达出蓝色荧光蛋白
A．①②③④B．②①③④C．②③①④D．④②①③
【答案】B
【解析】蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列→相应基因的修饰改造或人工合成→相应的表达。因此，采用蛋白质工程技术制造出蓝色荧光蛋白过程的正确顺序是：②蓝色荧光蛋白的功能分析和结构设计→①推测蓝色荧光蛋白的氨基酸序列和基因的核苷酸序列→③蓝色荧光蛋白基因的合成→④表达出蓝色荧光蛋白。即B正确。
5．用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述不正确的是（ ）
A．常用相同的限制性内切酶处理目的基因和质粒
B．DNA 连接酶和 RNA 聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶
C．可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒
D．导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达
【答案】B
【解析】常用相同的限制性内切酶处理目的基因和质粒，目的是形成相同的黏性末端，便于目的基因和质粒的连接。A正确。基因工程的工具酶只有限制酶和DNA连接酶，构建重组质粒时必需的工具酶是DNA连接酶。B错误。用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了质粒或重组质粒，是利用了质粒上有标记基因（即抗生素抗性基因）。C正确。即使目的基因导入受体细胞，也不一定能复制、表达。D正确。
6．限制酶可辨识并切割DNA分子上特定的核苷酸序列．如图为四种限制酶BamHⅠ、EcRⅠ、HindⅢ及BglⅡ的辨识序列及每一种限制酶的特定切割部位．其中切割出来的DNA片段末端可以互补结合的两种限制酶是（ ）

A．BamHⅠ和EcRⅠB．BamHⅠ和HindⅢ
C．BamHⅠ和BglⅡD．EcRⅠ和HindⅢ
【答案】C
【解析】DNA黏性末端可以互补配对需具备互补的碱基序列，即相同的黏性末端，根据图示可知BamHI和BglII切割形成的黏性末端都是﹣GATC，可以互补配对。综上所述，C正确，A、B、D错误。
7．用XhⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段，酶切位点及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是（ ）

A．图1中两种酶识别的核苷酸序列不同 B．图2中酶切产物可用于构建重组DNA
C．泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物 D．图中被酶切的DNA片段是单链DNA
【答案】D
【解析】酶具有专一性，不同的限制酶识别并切割不同的核苷酸序列，A正确；图2中酶切产物可用于构建重组DNA，B正确；分析图1，限制酶SalⅠ有三处切割位点，切割后产生4个DNA片段，泳道①中是用SalⅠ处理得到的酶切产物，C正确；图中被酶切的DNA片段是双链DNA，D错误。
8．关于基因表达载体的构建，叙述不正确的是（ ）
A．目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传和表达发挥作用
B．一个基因表达载体的组成含有目的基因、标记基因、启动子、终止子等
C．终止子位于 mRNA 的尾端，使转录在所需要的地方停止下来
D．涉及了碱基互补配对原则
【答案】C
【解析】构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传和表达发挥作用，A正确；一个基因表达载体的组成含有目的基因、标记基因、启动子、终止子等，B正确；终止子位于基因的尾端，使转录在所需要的地方停止下来，C错误；构建基因表达载体时，目的基因与运载体连接时涉及碱基互补配对原则，D正确。
9．判断下列有关基因工程和酶的相关叙述，正确的是（ ）
A．限制酶不能切割烟草花叶病毒的核酸
B．载体的化学本质与载体蛋白相同
C．同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性
D．DNA连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成氢键
【答案】A
【解析】限制酶是DNA内切酶，烟草花叶病毒是RNA病毒，酶有专一性，因此不能切割，A正确；基因工程的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒，细胞膜运输载体是蛋白，不相同，B错误；同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，但识别的都是相同的核苷酸序列并且在相同的切点作用，仍然体现了酶的专一性，C错误；DNA连接酶可催化DNA片段间形成磷酸二酯键，D错误。
10．为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因 C，拟将其与质粒重组，再借助农杆菌导入菊花中。下列操作与实验目的不符的是（ ）

A．用限制性核酸内切酶 EcR Ⅰ和连接酶构建重组质粒
B．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
C．用含基因 C 的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将基因 C 导入细胞
D．用分子杂交方法检测基因 C 是否整合到菊花染色体上
【答案】B
【解析】据图分析可知，在目的基因的两端、启动子和终止子之间都有限制性核酸内切酶EcRⅠ的切割位点，因此可以用限制性核酸内切酶EcRⅠ切割目的基因和运载体，之后再用DNA连接酶连接形成基因表达载体，A正确；图2中显示标记基因时潮霉素抗性基因，应该在培养基中添加潮霉素，筛选被转化的菊花细胞，B错误；将目的基因导入到植物细胞，常用农杆菌转化法，可以将目的基因C导入到农杆菌的Ti质粒的T-DNA段，之后再用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞中染色体上的DNA上，C正确；要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术，D正确。
11．应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是指（ ）
A．用于检测疾病的医疗器械B．用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子
C．合成β—球蛋白的DNAD．合成苯丙氨酸羟化酶的DNA片段
【答案】B
【解析】基因探针是带有可检测标记（如同位素或荧光染料等）的一小段已知序列的寡聚核苷酸，可通过分子杂交探测与其序列互补的基因是否存在。它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。所以B正确。
12．下列关于基因工程应用的叙述，错误的是（ ）
A．提高农作物的抗逆能力是植物基因工程技术应用之一
B．制备乳腺生物反应器时应将目的基因和乳腺蛋白基因的启动子重组
C．基因治疗是治疗遗传病的有效手段，分为体内基因治疗和体外基因治疗
D．转基因技术应用在工程菌上不会带来生命伦理和安全问题
【答案】D
【解析】植物基因工程技术的主要应用之一是提高农作物的抗逆能力，A正确；制备乳腺生物反应器时，应将目的基因（药用蛋白基因）和乳腺蛋白基因的启动子重组，B正确；基因治疗是治疗遗传病的有效手段，分为体内基因治疗和体外基因治疗，C正确；转基因技术应用在工程菌上会带来安全问题，如“工程菌”在降解塑料的过程中所产生的中间产物，可能对人类生活环境造成二次污染，D错误。
13．Mse Ⅰ、Pst Ⅰ、EcR Ⅰ三种限制酶的识别序列及切割位点分别是GAAT↓TAATTC、C↓TGCAG、G↓AATTC,如图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切点。

若要用如图质粒和外源DNA构建重组质粒,需要对质粒进行改造，构建新的限制酶切位点。在构建新的限制酶切位点的过程中需要使用的酶是（ ）
A．限制酶PstⅠ、DNA聚合酶、DNA连接酶
B．限制酶EcRⅠ、DNA聚合酶、DNA连接酶
C．限制酶EcRⅠ、限制酶PstⅠ、DNA聚合酶
D．限制酶PstⅠ、限制酶EcRⅠ、DNA连接酶
【答案】B
【解析】分析图2可知，含目的基因的外源DNA中含有限制酶PstⅠ、MseⅠ、EcRⅠ的切割位点，其中EcRⅠ酶的切割位点位于目的基因中。因此构建基因表达载体时。不能用EcRⅠ酶切割，应该用限制酶PstⅠ、MseⅠ进行切割；为了保证切割的质粒与目的基因露出的粘性末端相同，在对质粒进行改造时，应该将限制酶EcRⅠ的切割位点改造成限制酶MseⅠ的切割位点；因此，首先需要用限制酶EcRⅠ切割，其次需要用DNA聚合酶将相应的脱氧核苷酸序列连接上去，最后再用DNA连接酶连接形成限制酶MseⅠ的切割位点，所以B选项正确。
14．下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（ ）
A．不同的限制酶切割形成的黏性末端一定不同
B．PCR反应中周期性的温度设置是特定的，与扩增的目的基因和引物无关
C．在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体
D．质粒上的目的基因都必须整合到受体细胞的DNA上并表达
【答案】C
【解析】限制酶具有专一性，不同的限制酶切割形成的黏性末端也可能相同，也可能不同，A错误；PCR反应中周期性的温度可在一定范围内设置，不是特定的，与扩增的目的基因和引物有关，B错误；在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体，这样获得基因表达载体的概率更高，C正确；质粒本身也是DNA，也能自我复制，所以进入受体细胞以后，既可以自己进行表达，也可以整合到体细胞的DNA 并表达，D错误。
15．科学家将某药物蛋白合成基因转移到白色来亨鸡胚胎细胞的DNA中，发育后的雌鸡就能产出含该药物蛋白的鸡蛋，在每一只鸡蛋的蛋清中都含有大量的药物蛋白；而且这些鸡蛋孵出的鸡，仍能产出含该药物蛋白的鸡蛋。据此分析不正确的是（ ）
A．这些鸡是基因工程的产物B．这种变异属于可遗传的变异
C．食用此鸡蛋后药用蛋白可发挥作用D．该种变异属于定向变异
【答案】C
【解析】这些鸡是将某药物蛋白合成基因转移到白色来亨鸡胚胎细胞的DNA中获得的，是基因工程的产物，A正确；这种变异属于基因重组，是可遗传的变异，B正确；食用此鸡蛋后，药用蛋白会被水解，不能再发挥作用，C错误；转基因技术可以定向改造生物的性状，故该种变异属于定向变异，D正确。
16．下列哪项叙述不是基因工程载体必须具备的条件（ ）
A．具有某些标记基因B．决定宿主细胞的生存
C．能够在宿主细胞中复制D．有一个或多个限制酶切点
【答案】B
【解析】基因工程的载体携带目的基因进入宿主细胞，且可以使目的基因在宿主细胞中表达，因此载体需要具有标记基因，以利于目的基因的检测和鉴定；需能够在宿主细胞中复制，从而使目的基因复制；需具有一个或多个限制酶切点，以利于插入目的基因。载体不需要决定宿主细胞的生存。
17．有关限制性内切酶 Hind Ⅲ和 Xh I 的识别序列及切割位点分别为 A↓AGCTT 和C↓TCGAG，相关叙述正确的是（ ）
A．两种限制酶的识别序列在 DNA 分子中出现的概率不同
B．两种限制酶切割形成的粘性末端都是-AGCT
C．分别用这两种酶切割目的基因和质粒后能形成重组质粒
D．实验中可通过控制反应时间、酶的浓度等控制酶切效果
【答案】D
【解析】由题可知，限制性内切酶HindⅢ和Xh I的识别序列刚好互补（AG与TC互补），因此两种限制酶的识别序列在DNA分子中出现的概率相同，A错误；HindⅢ切割形成的粘性末端是-AGCTT，而Xh I切割形成的粘性末端都是-TCGAG，B错误；两种限制酶切割形成的粘性末端不相同，不能互补，C错误；实验中可通过控制反应时间、酶的浓度等控制酶切效果，D正确。
18．第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码抗原蛋白的基因插入到适宜的质粒中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答，且可持续一段时间。下列有关DNA疫苗的叙述，正确的是（ ）
A．表达产物是抗体B．基本组成单位是脱氧核苷酸
C．是经改造后的乙肝病毒D．生产过程不需要DNA连接酶和限制性核酸内切酶
【答案】B
【解析】表达产物是抗原，A错误；DNA的基本组成单位是脱氧核苷酸，B正确；DNA疫苗是指将编码抗原蛋白的基因插入到适宜的质粒中得到的重组DNA分子，不是病毒，C错误；要形成重组质粒，生产过程需要DNA连接酶和限制性核酸内切酶，D错误。
19．科研人员利用农杆菌转化法将抗病毒蛋白基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜，Ti质粒如图所示。下列叙述，正确的是（ ）
A．农杆菌的拟核DNA与番木瓜基因发生重组
B．构建重组质粒需要限制酶和DNA聚合酶
C．含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性
D．转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性
【答案】D
【解析】农杆菌的拟核DNA不会与番木瓜基因发生重组，和番木瓜基因发生重组的是其质粒上的基因，A错误；构建重组质粒需要限制酶和DNA连接酶，B错误；含重组Ti质粒的农杆菌具有卡那霉素抗性，而不具有四环素抗性，C错误；因为转入番木瓜的是重组Ti质粒的T-DNA，其中不含卡那霉素抗性基因，因此转基因抗病番木瓜不含有卡那霉素抗性基因，故不具有卡那霉素抗性，D正确。
20．有关基因工程的叙述正确的是（ ）
A．限制酶只在获得目的基因时才用 B．重组质粒的形成在细胞内完成
C．质粒都可作运载体 D．蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料
【答案】D
【解析】基因工程中的基因表达载体的构建过程中，需要用同种限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒，A错误；重组质粒的形成是在生物体外完成的，B错误；质粒作为运载体必须符合一定的条件，如含有多个限制酶切位点、含有标记基因等，C错误；在蛋白质工程中，可根据氨基酸的顺序推测密码子，进而推出DNA中碱基序列，D正确。
21．利用生物工程改造生物特性，从而生产人类所需要的产品。下列有关措施的叙述中，不正确的是（ ）
A．利用基因突变原理培育成青霉素高产菌株
B．利用基因突变原理培育成生产人干扰素的酵母菌
C．利用基因工程手段培育成生产人胰岛素的大肠杆菌
D．利用基因工程培育出能抗除草剂的转基因玉米
【答案】B
【解析】利用基因突变原理培育成青霉素高产菌株，A项正确；利用基因重组原理培育成生产人干扰素的酵母菌，B项错误；利用基因工程手段培育成生产人胰岛素的大肠杆菌，C项正确；利用基因工程手段培育出能抗除草剂的转基因玉米，D项正确。
22．基因芯片技术是近几年才发展起来的崭新技术，涉及生命科信息微电子材料学等众多的，固定在芯片上的各个探针是已知的单链DNA分子，而待测DNA分子用同位素或能发光的物质标记。如果这些待测的DNA分子中正好有能与芯片上的DNA配对的它们就会结合起来，并在结合的位置发出荧光或者射线，出现“反应信号”，下列说法中不正确的是（ ）
A．基因芯片的工作原理是碱基互补配对
B．待测的DNA分子首先要解旋变为单链，才可用基因芯片测序
C．待测的DNA分子可以直接用基因芯片测序
D．由于基因芯片技术可以检测未知DNA碱基序列，因而具有广泛的应用前景，好比能识别的“基因身份”
【答案】C
【解析】依据“待测的DNA分子中正好有能与芯片上的DNA配对的它们就会结合起来，并在结合的位置发出荧光或者射线，出现‘反应信号’”说明基因芯片的工作原理是碱基互补配对；待测的DNA分子首先要解旋变为单链，才可用基因芯片测序；具有广泛的应用前景，好比能识别的“基因身份”，A、B、D正确。待测的DNA分子必修先解旋成单链，才能用于基因芯片测序，C错误。
二、综合题
23．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

（1）限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有＿＿＿＿和＿＿＿＿＿＿。
（2）质粒运载体用EcRⅠ切割后产生的片段如图所示。为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
（3）按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即＿＿＿＿＿＿DNA连接酶和＿＿＿＿＿＿DNA连接酶。
（4）反转录作用的模板是＿＿＿＿＿＿，产物是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。若要在体外获得大量反转录产物，常采用＿＿＿＿＿＿技术。
（5）基因工程中除质粒外，＿＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿＿也可作为运载体。
（6）若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿。
【答案】（1）黏性末端 平末端
（2）切割产生的DNA片段末端与EcRⅠ切割产生的相同
（3）大肠杆菌（E.cli） T4
（4）mRNA（或RNA） cDNA（或DNA） PCR
（5）噬菌体 动植物病毒
（6）未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱
【解析】（1）限制性核酸内切酶（简称限制酶）切割DNA分子后，产生的片段末端类型有黏性末端和平末端。
（2）目的基因与运载体具有相同的黏性末端才能连接，若用包括EcRⅠ在内的两种限制酶切割目的基因，则另一种限制酶必须具有的特点是：切割产生的DNA片段末端与EcRⅠ切割产生的相同。
（3）按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即大肠杆菌DNA连接酶和T4 DNA连接酶。
（4）反转录的实质是以mRNA为模板合成DNA的过程，因此反转录作用的产物是cDNA（或DNA）。得到DNA可在体外，采用PCR技术进行大量扩增。
（5）由于未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA）的能力极弱，因此若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，而通常用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使其成为感受态细胞，此时细胞壁和细胞膜的通透性增大，容易吸收重组质粒。
24．P450是石油降解的关键酶。用SalI和NdeI联合酶切获得P450基因，与甲图所示的质粒重组后，导入大肠杆菌中获得基因工程菌。甲图中mel基因表达能使白色菌落变成黑色，aacCI是庆大霉素（抗生素）抗性基因。甲图中箭头位置是不同限制酶的切割位点，乙图表示几种限制酶对应的识别序列及切割位点。回答下列问题：

（l）甲图所示质粒中没有Sal I酶的切割位点，切割质粒时可用乙图中的______________酶代替，原因是_______________________________。酶切后的质粒与目的基因（P450基因）在___________________酶的作用下形成重组质粒。
（2）经测定图甲质粒长度为7.6kb（lkb为1000个碱基对），重组质粒经Nde I、SspI联合酶切后获得了6．0kb和1.2kb的两个片段，据此推测，目的基因的长度应为____________kb。基因表达载体中必须含有启动子，它的作用是_________________________。
（3）将重组质粒导人大肠杆菌时，常用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞处于一种___________的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。由于重组质粒导入受体细胞的成功率很低，需要接种到含有_______________的固体培养基上，选择颜色为________________的菌落扩大培养，进而筛选出所需的工程菌。
【答案】（1）Xh I Sal I和XhI作用于原质粒所产生的粘性末端相同 DNA连接
（2）1.4 RNA聚合酶识别并结合位点
（3）能吸收周围环境中DNA分子 庆大霉素 白色
【解析】（l）甲图所示质粒中没有SalI酶的切割位点，切割质粒时可用乙图中的Xh I酶代替，二者作用后可形成相同的黏性末端。酶切后的质粒与目的基因（P450基因）可在DNA连接酶的作用下形成重组质粒。
（2）图甲质粒长度为7.6kb（lkb为1000个碱基对），据图甲可知，用Xh I和NdeI联合酶切处理质粒，去除的片段应为1.8kb，剩余的DNA片段为5.8kb，重组质粒经Nde I、SspI联合酶切后获得了6．0kb和1.2kb的两个片段，说明重组质粒长度为6.0+1.2=7.2kb，则目的基因的长度应为7.2—5.8=1.4kb。基因表达载体中启动子是RNA聚合酶的结合部位，可以启动转录过程。
（3）将重组质粒导人大肠杆菌时，常用Ca2+处理大肠杆菌，使细胞壁的通透性增大，使之容易吸收周围环境中DNA分子。据图可知，目的基因的插入会破坏mel基因，但不会破坏庆大霉素（抗生素）抗性基因，因此可将受体细胞接种到含有庆大霉素的固体培养基上，含有重组质粒的大肠杆菌形成的菌落不会变成黑色，但具有庆大霉素抗性，选择颜色为白色的菌落扩大培养，可筛选出所需的工程菌。
25．镰刀型细胞贫血症是一种单基因遗传病，患者的血红蛋白β-肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，导致功能异常。请回答下列问题：
（1）异常血红蛋白的氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的_______________序列发生改变。
（2）将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，可以合成正常的血红蛋白达到治疗的目的，此操作______________（填“属于”或“不属于”）蛋白质工程，理由是该操作__________________________。
（3）用基因工程方法制备血红蛋白时，可先提取早期红细胞中的_____________，以其作为模板，在__________酶的作用下反转录合成cDNA。cDNA与载体需在限制酶和_________酶的作用下，拼接构建基因表达载体，导入受体菌后进行表达。
（4）检查受体菌是否已合成血红蛋白，可从受体菌中提取_____________，用相应的抗体进行______________杂交，若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。
【答案】（1）碱基对（脱氧核苷酸）
（2）不属于 没有对现有蛋白质进行改造（或没有对基因进行修饰）
（3）mRNA 逆转录 DNA连接
（4）蛋白质 抗原-抗体
【解析】（1）镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白β-肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸代替，其它氨基酸不变，说明氨基酸序列改变的根本原因是编码血红蛋白基因的碱基对（替换）序列发生改变。
（2）将正常的血红蛋白基因导入患者的骨髓造血干细胞中，合成的血红蛋白是正常人体原来就存在的，没有对现有蛋白质进行改造，故不属于蛋白质工程。
（3）用基因工程制备血红蛋白时，应先提取早期红细胞中的mRNA，并以其作为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA；基因表达载体构建时需要用到限制酶（形成相同的黏性末端）和DNA连接酶（连接两个DNA片段）。
（4）检测受体菌是否已合成血红蛋白，应用抗原-抗体杂交的方法，可从受体菌中提取蛋白质，用相应的抗体检测：若出现杂交带，则表明该受体菌已合成血红蛋白。
专题35 基因工程（提高）
一、单选题
1．下列有关基因工程技术的叙述，正确的是（ ）
A．基因工程又叫DNA拼接技术，所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和运载体
B．所有的限制性核酸内切酶识别同一种特定的核苷酸序列
C．形成重组质粒时，用DNA连接酶将碱基通过氢键连接
D．基因工程育种能克服生殖隔离且定向改变生物性状
【答案】D
【解析】基因工程的工具酶包括限制酶和DNA连接酶，而质粒等运载体不属于工具酶，A错误；限制性核酸内切酶具有特异性，一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列并在特定的位点进行切割，B错误；所有的DNA连接酶都只能“缝合”双链DNA片段之间形成磷酸二酯键，C错误；基因工程育种能克服生殖隔离，并且能定向改变生物性状，D正确。
2．下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是（ ）
A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得
B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原（起）点
C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
【答案】C
【解析】人肝细胞中胰岛素基因不表达，因而不存在胰岛素mRNA；A错误。复制原点是基因表达载体复制的起点，而胰岛素基因表达的起点是启动子；B错误。借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来；C正确。启动子与RNA聚合酶结合启动转录过程，终止密码子是翻译的终止信号；D错误。
3．“工欲善其事，必先利其器”。限制性内切酶、DNA连接酶的发现为DNA切割、连接、功能基因的获得以及表达载体的构建创造了条件，下列关于限制性内切酶和DNA连接酶的叙述，正确的是（ ）
A．两者都是从原核生物中分离纯化出来的
B．两者的催化都会导致磷酸二酯键数目的改变
C．限制性内切酶都能在在特定位点切割产生黏性末端
D．T4DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端
【答案】B
【解析】限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的，A错误；限制酶可以切割磷酸二酯键，DNA连接酶可以催化磷酸二酯键的形成，故两者的催化都会导致磷酸二酯键数目的改变，B正确；限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，形成黏性末端或平末端，C错误；T4DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，但连接平末端时的效率比较低，D错误。
4．基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据下图示判断下列操作正确的是（ ）

A．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
B．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
C．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
D．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
【答案】C
【解析】限制酶Ⅱ也能将限制酶Ⅰ识别序列切割，而限制酶Ⅰ不能将限制酶Ⅱ的识别序列切割。获得目的基因需将目的基因两端切割，所以用限制酶Ⅱ切割；切割质粒只能切出一个切口，所以用限制酶Ⅰ切割，故选C。
5．将某病毒的外壳蛋白（L1）基因与绿色荧光蛋白（GFP）基因连接，构建L-GFP融合基因，再将融合基因与质粒连接构建下图所示表达载体。图中限制酶E1~E4处理产生的黏性末端均不相同。下列叙述不正确的是（ ）

A．构建L1-GFP融合基因需要用到E1、E2、E4三种酶
B．E1、E4双酶切确保L1-GFP融合基因与载体的正确连接
C．GFP可用于检测受体细胞中目的基因是否表达
D．将表达载体转入乳腺细胞培育乳汁中含L1蛋白的转基因羊
【答案】D
【解析】构建L1-GFP融合基因需要先用内切酶处理获得L1基因和GFP基因，并将二者连接，故需要用到E1、E2、E4三种酶，A正确；图中限制酶E1~E4处理产生的黏性末端均不相同，E1、E4双酶切可以有效减少载体自身连接和融合基因自身连接，保证L1-GFP融合基因与载体准确连接，B正确；绿色荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达，C正确；为了获得L1蛋白，可将表达载体转入受精卵中而不是乳腺细胞，用于培育乳汁中含有L1蛋白的转基因羊，D错误。
6．下图表示蛋白质工程的操作过程，相关说法不正确的是（ ）

A．a、b过程分别是转录、翻译
B．蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作
C．蛋白质工程是完全摆脱基因工程技术的一项全新的生物工程技术
D．蛋白质工程中可能构建出一种全新的基因
【答案】C
【解析】a过程是以DNA的一条链为模板合成mRNA的转录过程，b过程是以mRNA为模板合成具有一定氨基酸顺序的多肽链的翻译过程，A正确；蛋白质工程是指以蛋白质分子结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活需求，因此蛋白质工程中对蛋白质分子结构的了解是非常关键的工作，B正确；蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，C错误；蛋白质工程中，可能根据已经明确的蛋白质的结构构建出一种全新的基因，D正确。
7．下列关于基因工程技术的叙述，错误的是（ ）
A．构建重组质粒时用两种限制性核酸内切酶酶切，可以防止目的基因的反向连接和质粒的自身环化
B．为提高重组质粒的形成率，需考虑目的基因浓度、质粒浓度及 DNA 连接酶含量等因素
C．农杆菌中携带目的基因的 Ti 质粒转移到植物细胞，并将目的基因整合到宿主细胞染色体上
D．运用不同的分子杂交技术，可以确定目的基因是否导入受体细胞和目的基因是否表达
【答案】C
【解析】构建重组质粒时用两种限制性核酸内切酶酶切，可以防止目的基因的反向连接和质粒的自身环化，A正确；为提高重组质粒的形成率，需考虑目的基因浓度、质粒浓度及 DNA 连接酶含量等因素，B正确；农杆菌中携带目的基因的 Ti 质粒转移到植物细胞，并将目的基因整合到宿主细胞染色体的DNA上，C错误；运用不同的分子杂交技术，可以确定目的基因是否导入受体细胞和目的基因是否表达，D正确。
8．某研究小组为了研制预防甲型H1N1流感病毒的疫苗，开展了前期研究工作，其简要的操作流程如图所示。下列有关叙述错误的是（ ）

A．步骤①所代表的过程是逆转录
B．步骤②需使用限制酶和DNA连接酶
C．步骤③可用CaCl2溶液处理大肠杆菌，使其处于感受态
D．步骤④表达出甲型H1N1流感病毒的抗体
【答案】D
【解析】步骤①的模板是RNA，产物是DNA，应为逆转录过程，A正确；步骤②为基因表达载体的构建过程，需使用限制酶切割目的基因和运载体并用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA，B正确；步骤③将外源基因导入受体细胞，可用CaCl2处理大肠杆菌，使其处于感受态，C正确；步骤④为目的基因的表达过程，由于目的基因携带的是病毒的遗传信息，故表达出的是甲型H1N1流感病毒的蛋白质，不是抗体，D错误。
9．目前研究混杂DNA群体中的特异DNA序列，一般基于两种不同的方法，即DNA克隆和分子杂交，如下图所示。下列有关叙述不正确的是（ ）

A．方法①需构建重组DNA并导入细胞
B．方法②需要DNA聚合酶和RNA聚合酶
C．方法③需要对探针进行特殊标记
D．方法①②③都遵循碱基互补配对原则
【答案】B
【解析】研究混杂DNA群体中的特异DNA序列，先要通过基因工程将该基因与运载体连接形成重组DNA，再导入细胞内进行克隆，A正确；方法②细胞外DNA克隆就是DNA复制，复制过程需要DNA聚合酶，RNA聚合酶用于转录过程，B错误；方法③为DNA分子杂交过程，要对已知基因的核酸序列制成荧光标记的DNA探针，C正确；方法①②过程中进行了DNA复制，方法③过程中会出现DNA链的结合成双链，因此①②③都遵循碱基互补配对原则，D正确。
10．水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中有三种氨基酸构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记。在转基因技术中，这种蛋白质的作用（ ）
A．促使目的基因导入宿主细胞中B．促使目的基因在宿主细胞中复制
C．使目的基因容易成功表达D．使目的基因容易被检测和选择
【答案】D
【解析】水母发光蛋白中有发光环，这有助于对该种蛋白质的追踪和检测，将这种蛋白质的基因所在的结构作为载体与目的基因连接，可根据是否出现发光环间接判断目的基因是否导入了受体细胞，故D符合题意，ABC不符合题意。
11．下列关于基因文库的叙述，不正确的是（ ）
A．玉米基因组文库中的基因与其cDNA文库中的基因相同
B．多肉植物珍珠吊兰的基因组文库包含了该生物所有的基因
C．利用cDNA文库可研究某个基因在不同组织中的表达情况
D．可以从小鼠肝脏细胞的cDNA文库中获取ATP合成酶基因
【答案】A
【解析】基因组文库中包含玉米的全部基因，而cDNA文库中只包含了一部分基因，A错误；多肉植物珍珠吊兰的基因组文库包含了该生物所有的基因，B正确；cDNA文库的建立，一般以某种生物发育的某个时期的mRNA为模板反转录产生多种互补cDNA片段，与载体连接后储存在受体菌群中，因此可用于研究某个基因在不同组织中的表达情况，C正确；小鼠肝脏细胞能合成ATP合成酶，因此含有相应的mRNA，所以可以从小鼠肝脏细胞的cDNA文库中获取ATP合成酶基因，D正确。
12．土壤农杆菌含有一个大型的Ti质粒（如下图所示），在侵染植物细胞的过程中，其中的T-DNA片段转入植物的基因组。若想用基因工程并通过土壤农杆菌向某种植物中导入抗旱基因，以下分析不合理的是（ ）

A．若用Ti质粒作为抗旱基因的载体，目的基因的插入位置应该在T-DNA片段内，且要保证复制起始点和用于转移T-DNA的基因片段不被破坏
B．将重组Ti质粒导入土壤农杆菌中时，可以用Ca2+处理细菌
C．用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌去感染植物细胞，可以通过植物组织培养成具有抗旱基因的植物
D．若能够在植物细胞中检测到抗旱目的基因，则说明该基因工程项目获得成功
【答案】D
【解析】土壤农杆菌含有一个大型的Ti质粒，在侵染植物细胞的过程中，其中的T-DNA片段可转入植物的基因组，所以若用Ti质粒作为抗旱基因的载体时，目的基因的插入位置应该在T-DNA片段内，且要保证复制起始点和用于转移T-DNA的基因片段不被破坏，A正确；将目的基因导入细菌时，需要用Ca2+处理细菌，使其成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态，B正确；用含有重组Ti质粒的土壤农杆菌去感染植物细胞，使其具有抗旱基因，然后再通过植物组织培养技术将受体细胞培养成具有抗旱基因的植物，C正确；能够在植物细胞中检测到抗旱目的基因，只能说明目的基因导入成功，不能说明该基因成功表达，即不能说明该基因工程项目获得成功，D错误。
13．人们试图利用基因工的方法，用乙种生物生产甲种生物的一种蛋白质。生产流程是（ ）

下列说法正确的是（ ）
A．①过程需要的酶是逆转录酶，原料是A、U、G、C
B．②要用限制性内切酶切断质粒DNA，再用DNA连接酶将目的基因与质粒连接在一起
C．如果受体细胞是动物细胞，③过程可用农杆菌转化法
D．④过程中用的原料不含有U
【答案】B
【解析】①为逆转录过程，需要逆转录酶的参与，原料是碱基组成为A、T、G、C的四种游离的脱氧核苷酸，A错误；②是基因表达载体的构建过程，要先用限制酶切割质粒，再用DNA连接酶把目的基因和质粒连接成重组质粒，B正确；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，农杆菌转化法的受体细胞是植物细胞，C错误；④过程包括转录和翻译，转录所用的原料包括四种含有A、U、G、C的核糖核苷酸，D错误。
14．下图是培育抗冻番茄的过程示意图。下列相关叙述正确的是（ ）

A．过程①和过程②所用的酶相同
B．转基因抗冻番茄植株的获得是定向变异的结果
C．重组质粒转入农杆菌的主要目的是筛选目的基因
D．可用DNA探针检测抗冻基因是否在番茄植株中表达
【答案】B
【解析】过程①获得抗冻基因（目的基因）的过程需要逆转录酶和DNA聚合酶参与，过程②构建重组质粒的过程中需要用到限制性核酸内切酶和DNA连接酶，A错误；转基因抗冻番茄植株的获得是借助基因工程导致定向变异的结果，B正确；重组质粒转入农杆菌的主要目的是将抗冻基因（目的基因）导入受体细胞，C错误；可用DNA探针检测抗冻基因是否插入番茄细胞的染色体的DNA上以及是否转录出mRNA，D错误。
15．下图为抗除草剂转基因烟草的构建过程，下列叙述错误的是（ ）

A．构建重组质粒时需要限制酶和DNA连接酶
B．③常采用农杆菌转化法将目的基因导入烟草细胞内
C．用含大量霉菌的培养基筛选转基因烟草细胞
D．④需经植物组织培养过程才能获得抗除草剂转基因烟草
【答案】C
【解析】构建重组质粒时，需要用限制酶切割质粒和含有抗除草剂基因的DNA，以获得目的基因，再用DNA连接酶将目的基因与切割后的质粒连接形成重组质粒，A正确；过程③是将目的基因导入烟草细胞内，常采用农杆菌转化法，B正确；用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞，C错误；过程④是借助植物组织培养技术、将含有抗除草剂基因的处于离体状态的烟草细胞培育成抗除草剂转基因烟草，所以需经植物组织培养过程才能获得，D正确。
二、综合题
16．某质粒载体的结构如图所示。现有BamHⅠ、MbⅠ、PalⅠ三种限制酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓GATCC、↓GATC、GG↓CC。已知目的基因的两端均有后两种限制酶的识别序列。

回答下列问题：
（1）从表达载体的组成上看，氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因属于____________。通常该结构必须具备的特性有：表达产物对细胞无害表达产物及产物的功能便于检测、表达产物及产物的功能在受体细胞中本身_____________（填“不存在”或“已存在”）。
（2）上述三种限制酶中，能切割产生平末端的酶是_____________，能切割产生相同黏性末端的酶是____________。
（3）若将质粒和目的基因通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，应选用的限制酶是___________（填“MbⅠ”或“PalⅠ”）。不选用另一种酶的原因是______________。
（4）同一种生物的cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是__________。
【答案】（1）标记基因 不存在
（2）PalⅠ BamHⅠ、MbⅠ
（3）PalⅠ 若用MbⅠ处理会破坏质粒中的两个标记基因，不利于重组质粒的筛选与鉴定
（4）cDNA文库中只含有该生物发育的某时期已转录得到的mRNA所对应的基因，而基因组文库中含有该生物的全部基因
【解析】（1）质粒上的氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因属于标记基因。标记基因必须具备的特性有：表达产物对细胞无害；表达产物及产物的功能便于检测；表达产物及产物的功能在受体细胞中本身不存在。
（2）根据上述三种限制酶的识别序列和切割位点可知，能切割产生平末端的酶是PalⅠ，能切割产生相同黏性末端的酶是BamHⅠ、MbⅠ。
（3）根据分析可知，目的基因的两端均有MbⅠ、PalⅠ限制酶的识别序列，而用限制酶MbⅠ切割会破坏两种抗生素的抗性基因，不利于重组质粒的筛选与鉴定，所以若将质粒和目的基因通过同种限制酶处理后进行连接，形成重组质粒，应选用的限制酶是PalⅠ。
（4）由于cDNA文库中只含有该生物发育的某时期已转录得到的mRNA所对应的基因，而基因组文库中含有该生物的全部基因，所以同一种生物的cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少。
17．普通番茄细胞中含有PG基因，能控制合成多聚半乳糖醛酸酶（简称PG），PG能破坏细胞壁，使番茄软化不耐贮藏。科学家将抗PG基因导入番茄细胞，培育出了抗软化、保鲜时间长的转基因番茄。下图表示抗PG基因的作用原理，回答下列问题：

（1）据图回答该转基因番茄具有抗软化、保鲜时间长的原理是________________。
（2）为培育抗软化番茄，应采用______________技术将抗PG基因进行体外扩增。在该技术的反应体系中除模板、引物、原料外，还需要加入______________。
（3）将抗PG基因插入Ti质粒的______________上构建基因表达载体，表达载体上必须插入抗PG基因的调控组件______________。通过农杆菌转化法将抗PG基因导入番茄细胞，为检验抗PG基因是否成功导入，在个体生物学水平上应检测__________________。
（4）为避免抗PG基因通过花粉传播进入其他植物而导致“基因污染”，应将抗PG基因导入______________（填“细胞核”或“细胞质”）。
【答案】（1）抗PG基因能阻止PG基因表达的翻译过程，使细胞不能合成PG
（2）PCR（多聚酶链式反应） 热稳定DNA聚合酶（Taq酶）
（3）T-DNA 启动子、终止子 转基因番茄是否抗软化以及保鲜时间的长短
（4）细胞质
【解析】（1）由图可知，抗PG基因转录出的mRNA通过与mRNA互补配对，阻止PG基因的翻译过程进而阻止PG基因的表达过程，使细胞不能合成PG，从而达到抗软化、保鲜时间长的目的。
（2）为培育抗软化番茄，应需将抗PG基因进行体外扩增。在PCR反应体系中加入了热稳定DNA聚合酶、引物等，这个基因的表达需要 启动子、终止子等不可缺少的调控组件。
（3）将抗PG基因插入Ti质粒的T-DNA上构建以构建基因表达载体，表达载体上必须插入抗PG基因的启动子、终止子，调控组件通过农杆菌的转化作用将抗PG基因导入番茄细胞，是否成功导入可在个体生物学水平上应检测转基因番茄是否抗软化以及保鲜时间的长短。
（4）为避免抗PG基因通过花粉传播进入其他植物，应将抗PG基因导入细胞质。
18．胰岛素是胰岛素基因控制合成的胰岛素原经加工、分类、包装而形成的一种分泌蛋白，是治疗糖尿病的特效药。科学家从人体内直接提取到控制合成人胰岛素的基因，拟采用基因工程的方法大量生产人胰岛素用于疾病治疗。结合所学知识回答下列问题：
（1）从人体直接提取的人胰岛素基因数量较少，科学家常采用PCR（多聚酶链式反应）技术对其进行快速扩增，该技术依据的原理是__________________，PCR技术扩增目的基因的前提是要有______________，以便据此合成引物。
（2）构建人胰岛素基因表达载体是基因工程的核心，其目的是________________。一个完整的基因表达载体除了含有启动子、终止子、目的基因外，还含有标记基因，标记基因的作用是_____________________。
（3）为能在山羊的乳汁中提取到人胰岛素，科学家将人胰岛素基因与______________等调控组件重组在一起，通过______________法导入山羊的受精卵中，最终得到乳汁中含有人胰岛素的转基因山羊，实现了人胰岛素的大量生产。
（4）依据单细胞生物繁殖快、代谢旺盛的特点，科学家选用酵母菌作为生产人胰岛素的转基因受体细胞，不选用大肠杆菌作为受体细胞的主要原因是____________________________。
【答案】（1）DNA双链复制 一段已知目的基因的核苷酸序列
（2）使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给下一代，同时能够表达和发挥作用 鉴别受体细胞是否含有目的基因并将含目的基因的受体细胞筛选出来
（3）山羊乳腺蛋白基因的启动子 显微注射
（4）大肠杆菌是原核生物，没有内质网和高尔基体，无法对胰岛素原进行加工、分类、包装和运输
【解析】（1）PCR是利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
（2）构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。标记基因的作用是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，并将含有目的基因的受体细胞筛选出来。
（3）含有人胰岛素基因的转基因山羊通过分泌乳汁来生产人胰岛素，为使目的基因正常表达，人胰岛素基因必需与山羊乳腺蛋白基因的启动子等调控原件重组在一起，通过显微注射法导入山羊的受精卵中，得到乳汁中含有人胰岛素的转基因山羊。
（4）酵母菌细胞为真核生物，含有内质网、高尔基体，大肠杆菌为原核生物，不含有内质网、高尔基体，因此选用酵母菌作为生产人胰岛素的转基因受体细胞，不选用大肠杆菌作为受体细胞的主要原因是在胰岛素原合成后，细胞无法对其进行加工、分类、包装和运输。
19．氮是植物生长必不可少的一种元素，为了让植物能够拥有固氮超能力，科学家一直在尝试用已经发现的固氮基因改造植物基因组，但目前还没有获得植物界固氮“超人”。2018某研究团队报道通过基因工程方法，将一种蓝细菌中20多个固氮基因，转移到另一种不能固氮但能进行光合作用的蓝细菌中，让后者获得了固氮能力。回答下列问题：
（1）1967年，罗思和海林斯基发现细菌拟核DNA之外的质粒具有__________特点，这一发现为基因转移找到一种运载工具。
（2）构建含固氮基因的重组质粒，需要用_________酶，并且将固氮基因置于_______和__________之间，其中后者位于基因的首端，它的作用是_____________。
（3）若将含固氮基因的重组质粒导入蓝细菌，一般情况下，蓝细菌应处于感受态，原因是___________________________________________。
（4）一些研究发现，某些转基因植物可以表达个别或全部固氮酶基因，但它们并没有表现出固氮能力。固氮酶基因在植物中是否翻译成蛋白质，检测的方法是________________。某些转基因植物没有表现出固氮能力，可能的原因是___________________。
【答案】（1）自我复制能力，可以在细菌细胞间转移
（2）限制酶、DNA连接酶 终止子 启动子（有先后顺序） RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA
（3）能够吸收周围环境中的DNA分子
（4）抗原—抗体杂交 固氮酶发挥作用的条件不满足（或固氮酶不具有正常的空间结构）
【解析】（1）在基因工程中质粒是常用的载体，质粒是常见于原核细胞中独立于拟核之外的小型环状DNA分子，其特点是可以进行自我复制，可以在细菌细胞之间转移。
（2）构建含固氮基因的重组质粒，需要用限制酶切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接起来，形成重组质粒。固氮基因是目的基因，应位于启动子和终止子之间，便于目的基因的表达。启动子位于目的基因的首端，启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。
（3）将目的基因导入微生物常采用钙离子转化法，因此用Ca2+处理蓝细菌，使蓝细菌处于感受态，处于感受态的蓝细菌容易吸收周围环境中的DNA分子。
（4）根据以上分析可知，固氮酶基因在植物中是否翻译成蛋白质，检测的方法是抗原—抗体杂交法。根据题意，某些转基因植物可以表达个别或全部固氮酶基因，但它们并没有表现出固氮能力，说明固氮酶发挥作用的条件不满足或固氮酶不具有正常的空间结构。
专题35 基因工程（挑战）
一、单选题
1．下列有关限制性核酸内切酶的叙述中错误的是（ ）
A．用限制酶从一个DNA分子中部获取一个目的基因时，4个磷酸二酯键断裂
B．限制酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越小
C．—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端碱基数相同
D．用不同的限制酶处理含目的基因的片段和质粒，也可能形成重组质粒
【答案】B
【解析】用限制酶从一个DNA分子中部获取一个目的基因时，需要对4个切割位点的2个核苷酸之间的磷酸二酯键切割，故4个磷酸二酯键断裂，A正确；酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的几率就越大，B错误；—CATG↓被限制酶切出的黏性末端是—CATG，—G↓GATCC—被限制酶切出的黏性末端是GATC—，黏性末端碱基数都是4个，故C正确；不同的限制酶切割也能形成相同的黏性末端，经DNA连接酶连接也能形成重组质粒，故D正确。
2．1972年，美国学者伯格和杰克逊等人成功将猿猴病毒SV40基因组DNA与大肠杆菌λ噬菌体基因以及大肠杆菌乳糖操纵子成功在体外拼接。下列说法正确的是（ ）
A．将目的基因与运载体结合时，应该将目的基因插入到启动子和终止子之间
B．不同的限制酶切割形成的黏性末端一定不相同
C．相同黏性末端连接形成的DNA片段，一定会被原限制酶识别
D．酵母菌作为受体细胞的原因是有高尔基体，能对脂质进行加工
【答案】A
【解析】只有将目的基因插入启动子和终止子之间，目的基因才能表达，A正确；限制酶甲识别GAATTC碱基序列，并在GA之间切割，限制酶乙识别CAATTG碱基序列，在C与A之间切割，形成的黏性末端是相同的， B错误；限制酶甲与限制酶乙形成的黏性末端连接后，形成的碱基序列为CAATTC，另一条链为GAATTG，不能被限制酶甲和乙识别，C错误；高尔基体不能加工脂质，脂质的加工车间为内质网， D错误。
3．对下图所示粘性末端的说法错误的是（ ）

A．甲、乙、丙粘性末端是由各自不同的限制性核酸内切酶催化产生的
B．甲、乙具相同的粘性末端可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能
C．DNA连接酶作用位点在b处，催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键
D．切割甲的限制性核酸内切酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子
【答案】C
【解析】甲、乙、丙粘性末是由各自不同的限制性核酸内切酶催化产生的，A正确；甲、乙的粘性末端虽然不完全相同，但是其露出来的碱基是配对的，所以可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能，B正确；DNA连接酶作用位点在a处，催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键，C错误；切出甲的限制酶识别的是GAATTC，在GA之间切割；切出乙的限制酶识别的是CAATTG，在CA之间切割；所以切出甲的限制性核酸内切酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。
4．下列关于基因工程的叙述，正确的是（ ）
A．若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定
B．抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关
C．抗除草剂基因转入某植物获得转基因植株，其DNA检测均含目的基因，抗性鉴定为抗除草剂和不抗除草剂。表明一定是前者表达了抗性蛋白而后者只表达抗性基因RNA
D．已知不同分子量DNA可分开成不同条带，相同分子量的为一条带。用某种限制性核酸内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带。表明该质粒上一定至少有3个被该酶切开的位置
【答案】D
【解析】若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性核酸内切酶，则该酶会对进入受体的重组质粒进行切割，不利于其保持结构稳定，A错误；抗除草剂基因转入抗盐植物，获得了抗除草剂抗盐品系和抗除草剂不抗盐品系，不抗盐品系的产生可能是转入的抗除草剂基因插入到抗盐基因内，影响其表达造成，B错误；转基因植物中均含抗除草剂基因，但存在抗除草剂和不抗除草剂两种植株，前者表达了抗性蛋白，后者可能抗除草剂基因未转录出mRNA，或转录出的mRNA未能翻译成蛋白质，C错误；某种限制性内切酶完全酶切环状质粒后，出现3条带，即3种不同分子量DNA，因此环状质粒上至少有3个酶切位点，D正确。
5．为增加玉米抗旱性，科研人员构建含有某微生物抗旱基因E的重组质粒，采用农杆菌转化法转入玉米幼胚组织细胞中，用E蛋白的抗体进行抗原－抗体杂交检测后，经进一步鉴定，筛选出抗旱的转基因玉米。下列叙述错误的是（ ）
A．提取该微生物mRNA反转录为cDNA，通过PCR可获得大量目的基因
B．将重组质粒置于经CaCl2处理的农杆菌悬液中，可获得转化的农杆菌
C．用农杆菌转化法将E基因转入玉米幼胚组织细胞需要严格无菌操作
D．用E蛋白的抗体进行抗原－抗体杂交，可在个体水平检测转基因玉米的抗旱性状
【答案】D
【解析】提取该微生物mRNA，在反转录酶的催化作用下，反转录为cDNA，再通过PCR可获得大量目的基因，A正确；农杆菌经钙离子处理后，成为感受态，使其易于吸收周围的DNA分子，所以将重组质粒置于经CaCl2处理的农杆菌悬液中，可获得转化的农杆菌，B正确；用农杆菌转化法将E基因转入玉米幼胚组织细胞需要严格无菌操作，防止杂菌污染，C正确；用E蛋白的抗体进行抗原－抗体杂交，可在分子水平检测转基因玉米的抗旱性状，D错误。
6．科学家构建了含有大洋鳕鱼抗冻蛋白基因启动子和大鳞鲑鱼生长激素基因的表达载体，并将其导入了大西洋鲑的细胞中，获得了生长速度加快的转基因大西洋鲑。相关叙述正确的是（ ）
A．转基因大西洋鲑体内抗冻蛋白明显增加
B．构建基因表达载体需要限制酶和DNA聚合酶
C．大鳞鲑鱼生长激素基因不能通过PCR技术扩增获得
D．转基因大西洋鲑生长激素含量增加导致生长速度加快
【答案】D
【解析】转基因大西洋鲑体内抗冻蛋白有所增加，但是不会明显增加，A错误；构建基因表达载体需要限制酶和DNA连接酶，B错误；大鳞鲑鱼生长激素基因能通过PCR技术扩增获得，C错误；转基因大西洋鲑生长激素含量增加导致生长速度加快，D正确。
7．为使玉米获得抗除草剂性状， 需进行如图所示的操作。报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色。转化过程中，愈伤组织表面常残留农杆菌，导致未转化的愈伤组织也可能在选择培养基上生长。下列叙述不正确的是（ ）

A．筛选1需要用含有氨苄青霉素的培养基筛选出成功导入表达载体的农杆菌
B．筛选2需要用无色物质K处理愈伤组织并筛选出呈现蓝色的组织
C．为使除草剂抗性基因G在农杆菌中高效表达，需要把目的基因片段插入到表达载体的复制原点和启动子之间
D．为从个体水平上检测图中玉米植株A是否具有抗除草剂性状，可采用的方法是用相应除草剂喷洒待测玉米植株
【答案】C
【解析】分析图解可知，该基因工程的标记基因为氨苄青霉素抗性基因，因此筛选1需要用氨苄青霉素培养基筛选出成功导入表达载体的农杆菌，A正确；根据题意可知，报告基因的产物能催化无色物质K呈现蓝色，因此筛选2需要用无色物质K处理愈伤组织并筛选出呈现蓝色的组织，B正确；为使除草剂抗性基因G在农杆菌中高效表达，需要把目的基因片段插入到表达载体的启动子、终止子之间，C错误；为从个体水平上检测图中玉米植株A是否具有抗除草剂性状，可采用的方法是用相应除草剂喷洒待测玉米植株，D正确。
8．研究发现，未经人工转基因操作的番薯都含有农杆菌的部分基因，而其遗传效应促使番薯根部膨大形成可食用部分，因此番薯被人类选育并种植。下列叙述错误的是（ ）
A．农杆菌这些特定的基因可以在番薯细胞内复制
B．农杆菌和番薯的基因都是4种碱基对的随机排列
C．农杆菌和番薯的基因都是有遗传效应的DNA片段
D．农杆菌这些特定的基因可能在自然条件下转入了番薯细胞
【答案】B
【解析】根据以上分析已知，转入番薯的部分农杆菌的基因可以通过复制遗传给下一代，即农杆菌这些特定的基因可以在番薯细胞内复制，A正确；农杆菌和番薯的基因的化学本质都是DNA，都是由4种脱氧核苷酸（或碱基）组成的，但是有特定的脱氧核苷酸排列顺序，B错误；农杆菌和番薯的基因都是有遗传效应的DNA片段，C正确；根据题干信息可知，该过程未经人工转基因操作，说明农杆菌这些特定的基因可能在自然条件下转入了番薯细胞，D正确。
9．利用人胰岛B细胞构建cDNA文库，然后通过核酸分子杂交技术从中筛选目的基因，筛选过程如下图所示。下列说法错误的是（ ）

A．cDNA文库的构建需要用到逆转录酶
B．cDNA文库的基因数目比基因组文库的基因数目少
C．核酸分子杂交的原理是碱基互补配对
D．从该文库中可筛选到胰高血糖素基因
【答案】D
【解析】cDNA是以mRNA为模板，经逆转录酶催化形成的，故cDNA文库的构建需要用到逆转录酶，A正确；由于cDNA文库中只含有叶细胞已转录（或已表达）的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因，故两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，B正确；核酸分子杂交的原理是碱基互补配对，C正确；胰岛B细胞内的胰高血糖素基因不表达，所以从胰岛B细胞内提取不到胰高血糖素基因的mRNA，无法逆转录形成胰高血糖素基因的cDNA，故不能从利用人胰岛B细胞构建的cDNA文库中筛选到胰高血糖素基因，D错误。
10．我国科学家运用基因工程技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达， 培育出了抗虫棉。下列叙述不正确的是（ ）
A．抗虫基因的提取和运输都需要专用的工具和运载体
B．重组DNA分子中增加一个碱基对，不一定导致毒蛋白的毒性丧失
C．抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递到近缘作物，从而造成基因污染
D．转基因棉花是否具有抗虫特性是通过检测棉花对抗生素抗性来确定的
【答案】D
【解析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体由启动子、目的基因、标记基因和终止子等部分组成，可见启动子、终止子等调控序列对于抗虫基因在棉花细胞中的表达是不可缺少的，A正确；重组DNA分子中增加一个碱基对，会引起基因突变，但由于密码子的简并性等原因，基因突变不一定会导致毒蛋白的毒性丧失，B正确；抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递至近缘物种，从而造成近缘物种也有抗虫基因，该近缘物种再通过授粉会造成基因进一步扩散和污染，C正确；转基因棉花是否具有抗虫特性是通过检测棉花对棉铃虫的抗性来确定的，D错误。
11．下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，正确的是（ ）

A．②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与
B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
【答案】D
【解析】构建载体需要限制酶和DNA连接酶，A错误；③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T－DNA不是整合到染色体上，而是整合到DNA分子上，B错误；染色体上含有目的基因，但目的基因也可能不能转录或者不能翻译，或者表达的蛋白质不具有生物活性，C错误；植株表现出抗虫性状，说明含有目的基因，属于基因重组，为可遗传变异，D正确。
12．利用基因工程技术生产羧酸酯酶（CarE）制剂，用于降解某种农药的残留，基本流程如下图所示。下列叙述正确的是（ ）
A．过程①的反应体系中需要加入逆转录酶和核糖核苷酸
B．过程②需使用限制酶、Taq酶以及DNA连接酶
C．过程③需要使用NaCl溶液制备感受态的大肠杆菌细胞
D．过程④可利用DNA分子杂交技术鉴定CarE基因是否成功导入受体细胞
【答案】D
【解析】过程①表示通过反转录法合成目的基因，该过程需要逆转录酶和脱氧核糖核苷酸，A错误；过程②是PCR技术扩增目的基因，需要使用Taq酶，B错误；过程③常用Ca2+处理大肠杆菌使其成为易于吸收DNA的感受态细胞，C错误；过程④可利用DNA分子杂交技术鉴定CarE基因是否成功导入受体细胞，D正确。
二、综合题
13．某种RNA病毒M表面的S蛋白是主要的病毒抗原，如图表示培育转基因动物的部分流程。已知该转基因动物体内一些细胞表达的S蛋白会释放到内环境。回答下列问题。

（1）图中①过程与________________（填序号）过程都会形成DNA与RNA的杂交链。
（2）选择性扩增S基因，常用技术的原理及其该技术使用的酶分别是______________。
（3）图中②过程得到的重组表达载体上，除了目的基因外，还应有________________（答出2点即可）等特殊的DNA片段。
（4）③过程常用的方法是_____________________，将目的基因导入植物和细菌细胞不采用该方法的原因可能是____________________________________________。
（5）培育该转基因动物需用到的生物技术有_______________（答出2点即可）。该转基因动物具有“天生”特异性抵抗病毒M的能力，原因是________________________________。
【答案】（1）④
（2）DNA双链复制、Taq酶（或热稳定性DNA聚合酶）
（3）启动子、终止子、标记基因
（4）显微注射法 该流程用的动物细胞一般是受精卵，受精卵较大，显微操作方便，而植物和细菌细胞比较小，显微操作不方便（或植物和细菌细胞有细胞壁影响注射操作）
（5）PCR技术、基因工程、早期胚胎培养、胚胎移植等 该转基因动物体内一些细胞表达的S蛋白释放到内环境，会引起体液免疫，产生相应的抗体和记忆细胞，进而有了“天生“特异性抵抗病毒M的能力
【解析】（1）图中①过程为逆转录过程，④过程包含转录过程，在逆转录和转录都会形成DNA与RNA的杂交链。
（2）在体外选择性扩增目的基因（S基因）常用的技术为PCR技术，该技术的原理是DNA双链复制、PCR技术使用的酶是Taq酶。
（3）重组表达载体应包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等特殊的DNA片段。
（4）将目的基因导入动物细胞的常用方法是显微注射法，该流程用的动物细胞一般是受精卵，受精卵较大，显微操作方便，而植物和细菌细胞比较小，显微操作不方便（或植物和细菌细胞有细胞壁影响注射操作）。
（5）培育该转基因动物需用到的生物技术有PCR技术、基因工程、早期胚胎培养、胚胎移植等。该转基因动物体内一些细胞表达的S蛋白释放到内环境会引起体液免疫，产生相应的抗体和记忆细胞，进而有了“天生”特异性抵抗病毒M的能力。
14．严重联合性免疫缺陷症是一种T淋巴细胞缺乏腺苷脱氨酶（ADA）引起的疾病，通过基因工程的方法将正常ADA基因导入患者细胞中进行治疗。如图分别表示正常ADA基因、金属硫蛋白基因（含有该基因的细胞能在含重金属镉的培养基中生长）和质粒（总长为3.8kb，lkb=1000对碱基），ClaⅠ、XbaⅠ和SacⅠ均为限制酶。

（1）尝试写出基因工程的两点主要理论依据____________、____________。
（2）为了筛选含有目的基因的受体细胞，需要先将目的基因和标记基因连接形成融合基因。首先用限制酶____________切割正常腺苷脱氨酶基因与金属硫蛋白基因，然后用________酶将它们连接形成融合基因。
（3）将上述融合基因与图的质粒构建成重组质粒时，应选用的限制酶是______________。
（4）若该融合基因长1.9kb，据图分析，此重组质粒大小为__________kb。
（5）重组质粒应导入的受体细胞是病人的____________细胞。为筛选出含重组质粒的受体细胞，需在培养基中添加的物质是________________。
【答案】（1）不同生物DNA结构相似 共用同一套遗传密码（答案合理即可）
（2）ClaⅠ、XbaⅠ和SacⅠ DNA连接
（3）SacⅠ和XbaⅠ
（4）5.3
（5）T淋巴 重金属镉
【解析】（1）基因工程的理论依据是不同生物DNA结构相似，密码子具有通用性即所有共用同一套遗传密码。
（2）根据以上分析已知，将正常ADA基因与金属硫蛋白基因形成融合基因时，应该选择ClaⅠ、XbaⅠ和SacⅠ，然后用DNA连接酶将两者连接起来。
（3）根据以上分析已知，将融合基因与质粒重组时，应该选择的限制酶是SacⅠ和XbaⅠ。
（4）质粒长度为3.8kb，经过限制酶切割后长度=3.8－0.4=3.4 kb，融合基因长度为1.9kb，因此重组质粒长度=3.4+1.9=5.3kb。
（5）本实验的目的是治疗T淋巴细胞缺乏腺苷脱氨酶（ADA）引起的疾病，所以需要将重组质粒导入病人的T淋巴细胞；金属硫蛋白基因作为标记基因，所以为筛选出含重组质粒的受体细胞，需在培养基中添加的物质是重金属镉。
15．某课题组用生物技术制备转基因小鼠的过程，如图所示。

回答下列问题。
（1）通常把目的基因转入雄原核而不是雌原核，从两者形态差异上分析，原因是_____________________。
（2）把桑椹胚植入假孕母鼠子宫前，需要对胚胎进行性别鉴定，目前最有效的方法是SRY－PCR法。操作的基本程序是：先从被测胚胎中取出几个细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体的性别决定基因，即SRY基因的一段碱基设计________________，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，最后用SRY特异性探针检测扩增产物。出现阳性反应者，胚胎为_______________；出现阴性反应者，胚胎为_________________。
（3）若目的基因的表达产物是某种特定的蛋白质，检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是______________，检测的基本思路是_________________。
【答案】（1）雄性原核较大，更容易容纳外源DNA
（2）引物 雄性小鼠 雌性小鼠
（3）抗原－抗体杂交技术 从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗体进行同位素标记）进行抗原抗体杂交，如果出现杂交带，表明目的基因已经表达成功
【解析】（1）通常来自精子的雄性原核较大，更容易容纳外源DNA，，因此外源基因能够容易整合到精子的染色体上，这是提高转化率的关键。
（2）目前，对胚胎的性别进行鉴定的最有效最准确的方法是SRY －PCR法，操作的基本程序是：从被测的囊胚中取出几个滋养层细胞，提取DNA，然后用位于Y染色体上的性别决定基因（即SRY基因）的一段碱基作引物，在热稳定DNA聚合酶（Taq酶）催化作用下，以胚胎细胞中的DNA作为模板，进行PCR扩增，再用SRY特异性探针检测扩增产物，与SRY特异性探针出现阳性反应者，说明其含有Y染色体，胚胎为雄性；出现阴性反应者，说明其不含Y染色体，胚胎为雌性。
（3）检测目的基因在子代转基因小鼠中是否成功表达，常用的分子检测方法是利用抗原抗体杂交技术，基本步骤：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体（对抗体进行同位素标记）进行抗原抗体杂交，如果出现杂交带，表明目的基因已形成蛋白质产品。
常用类型
E•cli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
来源
__________
T4噬菌体
功能
只“缝合”_________
“缝合”黏性末端和平末端，连接______末端的效率更高
结果
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的____________
特 点
意 义
稳定并能复制
使目的基因稳定存在并复制
有___________限制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的_____基因
便于重组DNA的鉴定和选择
比较项目
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
解旋酶
作用底物
DNA分子
DNA分子片段
脱氧核苷酸
DNA分子
作用部位
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对间的氢键
比较项目
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
解旋酶
生物种类
植物
动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
感受态细胞法
受体细胞
_______________
_______
_________
转化过程
将目的基因插入______________上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞_____________上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→_________→受精卵发育→获得具有_______的动物
Ca2+处理细胞→_______细胞→重组表达载体DNA分子与___________混合→感受态细胞吸收DNA分子
体内DNA复制
PCR技术
解旋
在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开
加热至90 ℃以上，双链全部解开，不需要解旋酶
引物
一小段RNA
可以是RNA或单链DNA分子片段
合成子链
在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成
分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72 ℃
特点
边解旋边复制，半保留复制
体外迅速扩增
Taq DNA聚合酶
不需要
需要
相同点
生物体内的DNA复制和PCR体外DNA扩增都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中进行
原理
操作过程
进展
基因治疗
基因表达
利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗（疾病）
临床试验
基因诊断
碱基互补配对
制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况
临床应用