2019三维设计高考生物一轮复习教师用书：选修1 生物技术实践



第一讲传统发酵技术的应用



[基础知识·系统化]
知识点一　果酒和果醋的制作
1． 制作原理



菌种
反应
果酒
酵母菌
有氧条件，大量繁殖：C6H12O6＋6O26CO2＋6H2O　
无氧条件，产生酒精：C6H12O62C2H5OH＋2CO2　　　　　　　　
果醋
醋酸菌
氧气、糖源都充足时：糖→醋酸
缺少糖源时：乙醇→乙醛→醋酸
C2H5OH＋O2CH3COOH＋H2O
2.实验设计与操作

知识点二　腐乳的制作
1．制作原理

2．实验流程及影响因素

知识点三　泡菜的制作


[基本技能·问题化]

1．据图完成下列有关问题
(1)完善果酒、果醋的制作流程：

(2)据制作果酒和果醋的发酵装置填空：

①装置中a为充气口，用于向装置内通气；b为排气口，用于排出CO2；c为出料口，用于取样检测。
②b长而弯曲，目的是防止空气中微生物的污染。
③葡萄汁装入发酵瓶时，要留出约1/3空间，目的是：先让酵母菌进行有氧呼吸快速繁殖，耗尽O2后再进行酒精发酵；防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出。
④使用该装置制作果酒时，应关闭充气口a，制果醋时，应将充气口a连接气泵，输入氧气。
2．据几种发酵食品制作方法填空
表中甲～丁为腐乳、泡菜、果醋、果酒等发酵食品制作装置图，回答下列问题：
食品
①
②
③
④
主要微生物
⑤
⑥
⑦
⑧
制作
装置





(1)请填出①～④食品名称：①果酒，②果醋，③腐乳，④泡菜。
(2)请填出⑤～⑧菌种名称：⑤酵母菌，⑥醋酸菌，⑦毛霉，⑧乳酸菌，其中酵母菌、毛霉为真核生物，醋酸菌、乳酸菌为原核生物。
(3)甲～丁装置是否存在缺陷，试具体分析指出，并说明丁装置中“放水”的作用。
提示：甲、丙装置有缺陷：甲装置中排气管下端不应插入到发酵液内，丙装置接种菌种应在“加盐”之前；丁装置中“放水”的作用是为泡菜坛营造“厌氧”环境。

考点一果酒和果醋的制作
命题点(一)　果酒、果醋制作的发酵装置
1．(2017·江苏高考)如图是探究果酒与果醋发酵的装置示意图。下列相关叙述正确的是(多选)(　　)
A．改变通入气体种类，可以研究呼吸作用类型对发酵的影响
B．果酒发酵中期通入氮气，酵母菌将从有氧呼吸转变为无氧呼吸
C．果醋的发酵周期与实验设定的温度密切相关
D．气体入口与气体出口可以交换使用
解析：选ABC　改变通入气体的种类，例如分别通入氮气和氧气，可研究无氧呼吸和有氧呼吸对发酵的影响；果酒发酵中期通入氮气，更利于创造无氧条件，酵母菌将从有氧呼吸转变为无氧呼吸；果醋发酵的菌种是醋酸杆菌，其生长的适宜温度是30～35 ℃，温度能影响醋酸杆菌的代谢，从而影响果醋的发酵周期；气体的入口必须伸入培养液中，气体出口不能伸入培养液中，如果气体的入口和出口交换，会导致发酵液喷出。
[重难点拨]
制作果酒和果醋的发酵装置分析

该装置的使用方法：使用该装置制作果酒时，应该关闭充气口，制作果醋时，应将充气口连接充气泵，输入空气

命题点(二)　果酒、果醋制作的原理和过程
2．(2016·全国卷Ⅱ)苹果醋是以苹果汁为原料经发酵而成的。回答下列问题：
(1)酵母菌的呼吸代谢途径如图所示。图中过程①和②是苹果醋生产的第一阶段，在酵母菌细胞的__________中进行，其产物乙醇与__________试剂反应呈现灰绿色，这一反应可用于乙醇的检验；过程③在酵母菌细胞的________________中进行。与无氧条件相比，在有氧条件下，酵母菌的增殖速度__________。
(2)第二阶段是在醋酸杆菌的作用下将第一阶段产生的乙醇转变为醋酸的过程，根据醋酸杆菌的呼吸作用类型，该过程需要在____________条件下才能完成。
(3)在生产过程中，第一阶段和第二阶段的发酵温度不同，第一阶段的温度__________(填“低于”或“高于”)第二阶段的。
(4)醋酸杆菌属于__________核生物，其细胞结构中______(填“含有”或“不含有”)线粒体。
解析：(1)图中过程①和②是酵母菌进行无氧呼吸产生乙醇的过程，无氧呼吸的场所是细胞质基质。乙醇可用酸性重铬酸钾试剂检测，颜色由橙色变为灰绿色。过程③为有氧呼吸的第二和第三阶段，场所为线粒体。在有氧条件下酵母菌进行有氧呼吸，产生更多的能量供酵母菌繁殖利用，故有氧条件下酵母菌的繁殖速度更快。(2)醋酸杆菌是好氧型细菌，在有氧条件下才能将乙醇转变为醋酸。(3)在生产过程中，第一阶段酵母菌产生乙醇的适宜温度为18～25 ℃，第二阶段醋酸杆菌产生醋酸的适宜温度为30～35 ℃，第一阶段的温度低于第二阶段的。(4)醋酸杆菌属于原核生物，原核细胞中的细胞器只有核糖体一种，不含线粒体。
答案：(1)细胞质基质　酸性重铬酸钾　线粒体　快
(2)有氧　(3)低于　(4)原　不含有
[重难点拨]
1．果酒和果醋制作成功的关键点
项目
说明
材料的选
择与处理
选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗，再除去枝梗，以防葡萄汁流失及污染
防止发酵
液被污染
①榨汁机和发酵瓶等都需清洗干净，且发酵瓶要进行消毒
②清洗葡萄时要先清洗后除枝梗
③发酵瓶排气管用曲颈管不用直管

2．果酒、果醋发酵条件的控制
(1)葡萄汁装入发酵瓶时，要留约1/3空间，目的是先让酵母菌进行有氧呼吸快速繁殖，耗尽O2后再进行酒精发酵，防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出。
(2)严格控制温度：18～25 ℃利于酵母菌的繁殖和酒精发酵，30～35 ℃利于醋酸菌的繁殖和醋酸发酵。
(3)充气：酒精发酵为无氧发酵，需封闭充气口；醋酸发酵为有氧发酵，需适时通过充气口充气。

考点二腐乳的制作
命题点(一)　腐乳制作的原理
1．(2012·海南高考)回答下列关于腐乳制作的问题：
(1)腐乳是豆腐经微生物发酵后制成的食品。多种微生物参与了该发酵过程，其中起主要作用的微生物是________，其产生的蛋白酶可将豆腐中的蛋白质水解为____________和________；其产生的________能将豆腐中的脂肪水解为________和________。
(2)发酵完成后需加盐腌制，加盐还可以抑制________生长。
(3)腐乳制作的后期可加入由酒和多种香辛料配制而成的卤汤。卤汤除具有一定的防腐作用外，还能使腐乳具有独特的________。
解析：(1)腐乳制作发酵过程中起作用的微生物有多种，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉，毛霉产生的蛋白酶可将豆腐中的蛋白质水解成(多)肽和氨基酸，产生的脂肪酶能够将豆腐中的脂肪水解为甘油和脂肪酸。(2)发酵过程中加盐腌制，不仅可以调制风味，而且能够抑制杂菌等其他微生物的生长。(3)腐乳制作后期加入卤汤，卤汤不仅可以防腐，还可以使腐乳具有独特的风味(或香味)。
答案：(1)毛霉　(多)肽　氨基酸　脂肪酶　甘油　脂肪酸(2)微生物　(3)风味
命题点(二)　发酵条件的控制及影响因素
2．(2017·郑州模拟)腐乳是我国独特的传统发酵食品，是用豆腐发酵制成的，民间传统方法生产腐乳均为自然发酵，现代腐乳生产多采用优良的毛霉菌种进行发酵。现代化生产流程如下：

(1)毛霉的生长需要豆腐提供水、无机盐、________和________等四大类基本营养物质。此外，还需要一定的温度、湿度等环境条件。
(2)传统方法制作腐乳时________(填“需要”或“不需要”)灭菌，发酵好的豆腐上布满了菌落，这些菌落________(填“属于”或“不属于”)同一物种。
(3)流程中扩大培养时使用的培养基与毛霉菌种分离时使用的培养基最大的区别是后者培养基中加入了________。
(4)当豆腐上长出毛霉后，对豆腐要进行________。腐乳制作的后期要加入酒精和多种香辛料配制的卤汤，酒精的浓度要控制在12%左右，原因是______________________________

________________________________________________________________________。
答案：(1)碳源　氮源　(2)不需要　不属于　(3)琼脂(凝固剂)　(4)加盐腌制　酒精浓度过高，则腐乳的成熟时间将会延长；酒精浓度过低，不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败
[重难点拨]
影响腐乳品质的因素
项目
说明
水的控制
含水量约70%，用含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形
盐的控制
盐浓度过高会影响腐乳的口味；盐浓度过低，腐乳易腐败变质
酒的控制
酒的含量一般控制在12%左右。酒精含量过高，使腐乳成熟期延长。酒精含量过低，杂菌繁殖快，豆腐易腐败
温度控制
温度为15～18 ℃，适合毛霉生长
香辛料
具有调味和杀菌的作用，也会影响腐乳的风味或质量

考点三泡菜的制作

命题点(一)　泡菜制作的原理和过程
1．(2013·全国卷Ⅱ)回答下列有关泡菜制作的问题：
(1)制作泡菜时，所用盐水需煮沸，其目的是___________________________________。
为了缩短制作时间，有人还会在冷却后的盐水中加入少量陈泡菜液，加入陈泡菜液的作用是________________________________________________________________________。
(2)泡菜制作过程中，乳酸发酵的过程即为乳酸菌进行____________的过程。该过程发生在乳酸菌细胞的________中。
(3)泡菜制作过程中影响亚硝酸盐含量的因素有________、____________和____________等。
(4)从开始制作到泡菜品质最佳这段时间内，泡菜液逐渐变酸。这段时间内泡菜坛中乳酸菌和其他杂菌的消长规律是
________________________________________________________________________，
原因是___________________________________________________________。
解析：(1)细菌分布广泛，制作泡菜时，需要乳酸菌进行发酵，为防止杂菌污染，所需盐水需要煮沸；加入陈泡菜液，可以增加乳酸菌数量，加速乳酸产生。(2)乳酸菌为原核生物，可进行无氧呼吸将葡萄糖分解为乳酸，其无氧呼吸的过程发生在乳酸菌的细胞质中。(3)在泡菜制作过程中，要注意控制腌制的时间、温度和食盐的用量等。(4)由于乳酸菌比杂菌更为耐酸，所以在酸性环境中，乳酸菌能够正常地增殖，而其他杂菌繁殖将受到抑制，所以在此过程中，乳酸菌数量增多，杂菌数量减少。
答案：(1)杀灭杂菌　增加乳酸菌数量　(2)无氧呼吸　细胞质　(3)温度　腌制时间　食盐用量　(4)乳酸菌数量增多，杂菌数量减少　乳酸菌比杂菌更为耐酸
[重难点拨]
泡菜制作的注意事项
(1)材料的选择及用量：
①蔬菜应新鲜，若放置时间过长，蔬菜中的硝酸盐易被还原成亚硝酸盐。
②清水和盐的质量比为4∶1，盐水要煮沸后冷却。煮沸有两大作用，一是除去水中的氧气，二是杀灭盐水中的细菌。
(2)防止杂菌污染：每次取样用具要洗净，要迅速封口。
(3)氧气需求：
①泡菜坛要选择透气性差的容器，以创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵，防止蔬菜腐烂。
②泡菜坛坛盖边沿的水槽内注满水，以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境，并注意在发酵过程中经常补水。
(4)控制适宜的温度：以18～20 ℃为宜，温度偏高有害菌活动能力强，温度偏低不利于乳酸发酵。
命题点(二)　亚硝酸盐含量的测定
2．(2014·海南高考)已知泡菜中亚硝酸盐含量与泡制时间有关。为了测定不同泡制天数泡菜中亚硝酸盐的含量，某同学设计了一个实验，实验材料、试剂及用具包括：刻度移液管、比色管、不同浓度的亚硝酸钠标准溶液、亚硝酸盐的显色剂、不同泡制天数的泡菜滤液等。
回答相关问题：
(1)请完善下列实验步骤。
①标准管的制备：用________________________________和显色剂制成颜色深浅不同的系列标准管。
②样品管的制备：用刻度移液管分别吸取一定量的__________________________，加到不同的比色管中，然后在各个比色管中加入等量的显色剂进行显色，得到样品管。
③将每个____________分别与系列标准管进行比较，找出与样品管颜色深浅____________的标准管，该管中亚硝酸钠含量即代表样品管中的亚硝酸盐含量，记录各样品管亚硝酸盐的含量。
(2)右图表示的是泡菜中____________________________趋势。
(3)泡菜制作过程中产酸的细菌主要是____________(填“醋酸菌”或“乳酸菌”)。
解析：(1)①在亚硝酸盐的含量测定中，用不同浓度亚硝酸钠标准溶液和显色剂制成颜色深浅不同的系列标准管；②用刻度移液管分别吸取一定量的不同泡制天数的泡菜滤液，加到不同的比色管中，然后在各个比色管中加入等量的显色剂进行显色，得到样品管；③将每个样品管分别与系列标准管进行比较，找出与样品管颜色深浅相近的标准管，该管中亚硝酸钠含量即代表样品管中的亚硝酸盐含量，记录各样品管中的亚硝酸盐含量。(2)据图可知，该图表示亚硝酸盐含量随发酵时间的变化曲线。(3)制作泡菜时产酸的微生物主要是乳酸菌。
答案：(1)①不同浓度亚硝酸钠标准溶液　②不同泡制天数的泡菜滤液　③样品管　相同(相近)　(2)亚硝酸盐含量的变化　(3)乳酸菌

[重难点拨]
泡菜腌制中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化

发酵时期
乳酸菌
乳酸
亚硝酸盐
发酵
初期
少(有O2，乳酸菌
活动受抑制)
少
增加(硝酸盐还
原菌的作用)
发酵
中期
最多(乳酸抑制
其他菌活动)
积累、增多、pH下降
下降(硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解)
发酵
后期
减少(乳酸继续积累，pH继续下降，抑制其活动)
继续增多，pH继续下降
下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制)
变化曲线



注意
亚硝酸盐是硝酸盐还原菌促进硝酸盐还原形成的，而不是硝化细菌氧化氨形成的



[真题集训——验能力]
1．(2017·江苏高考)下列关于“腐乳的制作”实验，叙述正确的是(　　)
A．控制发酵温度的主要目的是腐乳调味
B．腐乳制作后期加入香辛料和料酒有防腐作用
C．毛霉的主要作用是分解脂肪和淀粉
D．成品腐乳表面的粘性物质主要由细菌产生
解析：选B　控制发酵温度的主要目的是利于菌种繁殖和代谢；腐乳制作后期加入香辛料和料酒有防腐作用；毛霉的作用主要是分解蛋白质和脂肪；成品腐乳表面的粘性物质主要是毛霉产生的菌丝。
2．(2014·广东高考)下列叙述错误的是(　　)
A．醋酸菌在无氧条件下利用乙醇产生醋酸
B．酵母菌在无氧条件下利用葡萄汁产生酒精
C．泡菜腌制利用了乳酸菌的乳酸发酵
D．腐乳制作利用了毛霉等微生物的蛋白酶和脂肪酶
解析：选A　醋酸菌是好氧细菌，只有当氧气充足时，才能利用乙醇发酵产生醋酸；酵母菌是兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行无氧呼吸产生酒精；泡菜制作利用的原理是乳酸菌在无氧条件下可将葡萄糖分解成乳酸；毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。
3．(2012·北京高考)高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是(　　)
A．将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中
B．将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上
C．将转基因植物叶片接种到无菌培养基上
D．将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上
解析：选C　将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中进行酿酒时，在缺氧、酸性环境下其他杂菌不能生长，故不严格灭菌对其影响不大；腐乳制作中将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上，毛霉生长繁殖快且抗杂菌能力强，故不严格灭菌对实验结果影响不大；进行植物组织培养时，植物材料体积小、抗性差，而微生物繁殖快、生长迅速、会争夺培养基中的营养，产生的代谢废物还会毒害培养材料，故培养材料一旦被微生物(如细菌)污染，将严重影响实验结果；选择培养基中已经加入了某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物生长，另外土壤浸出液本身也含多种微生物，因此将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上时不进行严格的无菌操作，对实验结果影响不大。
4．(2017·全国卷Ⅱ)豆豉是大豆经过发酵制成的一种食品。为了研究影响豆豉发酵效果的因素，某小组将等量的甲、乙两菌种分别接入等量的A、B两桶煮熟大豆中并混匀，再将两者置于适宜条件下进行发酵，并在32 h内定期取样观测发酵效果。回答下列问题：
(1)该实验的自变量是________、________。
(2)如果发现发酵容器内上层大豆的发酵效果比底层的好，说明该发酵菌是________。
(3)如果在实验后，发现32 h内的发酵效果越来越好，且随发酵时间呈直线上升关系，则无法确定发酵的最佳时间；若要确定最佳发酵时间，还需要做的事情是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)从大豆到豆豉，大豆中的成分会发生一定的变化，其中，蛋白质转变为__________，脂肪转变为__________。
解析：(1)实验使用甲、乙两种菌种，并在32 h内定期取样观测发酵效果，所以该实验的自变量是菌种和发酵时间。(2)如果发现发酵容器内上层大豆的发酵效果比底层的好，说明该发酵菌是好氧型微生物。(3)因“32 h内的发酵效果越来越好，且随发酵时间呈直线上升关系”，说明发酵的最佳时间可能超过32 h，故需继续延长发酵时间，定期取样观测发酵效果，以确定最好的发酵效果所对应的时间，此时间即为最佳发酵时间。(4)从大豆到豆豉，在相关微生物的作用下，大豆中的蛋白质转变为肽和氨基酸，脂肪转变为甘油和脂肪酸。
答案：(1)菌种　发酵时间　(2)好氧菌　(3)延长发酵时间，观测发酵效果，最好的发酵效果所对应的时间即为最佳发酵时间　(4)氨基酸和肽　脂肪酸和甘油
5．(2016·天津高考)天津独流老醋历史悠久、独具风味，其生产工艺流程如下图。

(1)在糖化阶段添加酶制剂需要控制反应温度，这是因为酶
________________________________________________________________________。
(2)在酒精发酵阶段，需添加酵母菌。在操作过程中，发酵罐先通气，后密闭。通气能提高________的数量，有利于密闭时获得更多的酒精产物。
(3)在醋酸发酵阶段，独流老醋采用独特的分层固体发酵法，发酵30天。工艺如下：

①发酵过程中，定期取样测定醋酸杆菌密度变化，趋势如右图。据图分析，与颠倒前相比，B层醋酸杆菌在颠倒后密度变化的特点是________________________，由此推测，影响醋酸杆菌密度变化的主要环境因素是________________________________。
②乳酸含量高是独流老醋风味独特的重要成因。发酵过程中，发酵缸中____________________________层的醋醅有利于乳酸菌繁殖，积累乳酸。
③成熟醋醅中乳酸菌的种类明显减少，主要原因是发酵后期营养物质消耗等环境因素的改变，加剧了不同种类乳酸菌的____________，淘汰了部分乳酸菌种类。
解析：(1)酶的活性受温度的影响，在最适温度下酶的催化能力最强。(2)发酵过程中先通气的目的是让酵母菌大量繁殖，使发酵液中的酵母菌总数达到一定程度，有利于发酵的进行。(3)①醋酸杆菌是好氧菌，据图分析，第15天将A、B层颠倒，颠倒后使原来处于下层缺氧状态的醋酸杆菌分布在上层有氧的环境，醋酸杆菌大量繁殖，其数量上升，后来因为培养液中营养物质被逐渐消耗以及呼吸产物对pH的影响，导致其数量不再增长而趋于稳定。由此推测影响醋酸杆菌密度变化的主要因素是氧气、营养物质、pH。②因为乳酸菌是厌氧菌，故下层(未颠倒前B层处于下层，颠倒后A层处于下层)有利于乳酸菌繁殖。③由题目信息可知，由于营养物质消耗、发酵环境发生改变等，生物个体之间的斗争、不同种类之间的竞争会加剧。
答案：(1)在最适温度条件下催化能力最强　(2)酵母菌
(3)①先快速增长后趋于稳定　氧气、营养物质、pH　②颠倒前的B层和颠倒后的A(或不翻动，或下)　③种间竞争(或竞争)
6．(2015·广东高考)泡菜是我国的传统食品之一，但制作过程中产生的亚硝酸盐对人体健康有潜在危害。某兴趣小组准备参加“科技创新大赛”，查阅资料得到下图。

(1)制作泡菜时，泡菜坛一般用水密封，目的是_________________________________。乳酸菌发酵第一阶段的产物有___________________________________________________。
(2)据图，与第3天相比，第8天后的泡菜更适于食用，因为后者_____________________；pH呈下降趋势，原因是________________________________________________________。
(3)该小组得到一株“优选”乳酸菌(亚硝酸盐还原酶活力比普通乳酸菌高5倍)，拟参照资料的实验方案和食盐浓度(4%～10%)，探究与普通乳酸菌相比用“优选”乳酸菌制作泡菜过程中亚硝酸盐含量的高低，并确定其最适条件。请你设计一个实验结果记录表，并推测实验结论。
解析：(1)制作泡菜时，泡菜坛要选择密封性好的容器，一般用水密封，以创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵，防止蔬菜腐烂。乳酸菌发酵第一阶段的产物有丙酮酸、[H]和少量ATP。(2)第3天时，泡菜中亚硝酸盐含量达到最高，在第8天后的泡菜中亚硝酸盐含量降到最低，故第8天后的泡菜更适于食用。乳酸菌无氧呼吸产生的乳酸会导致pH下降。(3)设计的记录表中要包含乳酸菌类型、食盐浓度和发酵时间等自变量，因变量为亚硝酸盐的含量。通过相互对照确定用“优选”乳酸菌制作泡菜过程中亚硝酸盐含量的高低，并确定最适发酵条件。
答案：(1)创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵　丙酮酸、[H](少量ATP)　(2)亚硝酸盐含量低　乳酸菌无氧呼吸产生了乳酸
(3)两种乳酸菌在泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量变化表







　　　①
②
③　　
普通乳酸菌
“优选”乳酸菌
4%
5%
6%
……
9%
10%
4%
5%
6%
……
9%
10%
1












2












3












……












10


























注：①乳酸菌类型及食盐浓度；②亚硝酸盐含量(mg/kg)；③发酵时间(d)。
推测实验结论：与普通乳酸菌相比，“优选”乳酸菌制作泡菜时，相同条件下产生的亚硝酸盐含量低。

[课下检测——查缺漏]
一、基础题点练
1．如图表示果酒和果醋制作过程中的物质变化过程，下列叙述正确的是(　　)

A．过程①和②都只能发生在缺氧条件下
B．过程①和③都发生在酵母细胞的线粒体中
C．过程③和④都需要氧气的参与
D．过程①～④所需的最适温度基本相同
解析：选C　据图分析可知：①是细胞呼吸的第一阶段；②是无氧呼吸的第二阶段；③是有氧呼吸的第二、三阶段；④是果醋制作中乙醇氧化为醋酸的阶段。①过程在有氧或无氧的条件下都可以进行；①过程是在细胞质基质中进行的；③和④都必须在有氧的条件下才可以进行；①②(③)是果酒制作的阶段，其适宜的温度为18～25 ℃，④是果醋制作的阶段，其适宜的温度为30～35 ℃。
2．下列关于制作果酒、果醋和腐乳的叙述，错误的是(　　)
A．在果酒发酵后期拧松瓶盖的间隔时间可延长
B．条件适宜时醋酸菌可将葡萄汁中的糖分解成醋酸
C．果酒发酵过程中发酵液密度会逐渐减小
D．将长满毛霉的豆腐装瓶腌制时，底层和近瓶口处需加大用盐量
解析：选D　果酒发酵的后期，营养物质减少，酵母菌代谢减慢，产生的CO2量减少，可以间隔较长的时间再拧松瓶盖；糖源和氧气充足时，醋酸菌可以将葡萄糖分解成醋酸，糖源不足时，则将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸；果酒发酵过程中，葡萄糖分解会产生水，因此发酵液的密度逐渐减小；制作腐乳时，在摆放豆腐的同时，应逐层加盐，随层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。
3.若利用如图所示的装置直接制作果醋，将葡萄汁放入已灭菌的发酵装置后，下列做法不合理的是(　　)
A．加入适量的醋酸菌
B．一直打开阀a和阀b进行通气
C．严格进行无菌操作
D．把发酵装置放到15 ℃的恒温箱中进行发酵
解析：选D　醋酸菌产生醋酸时，最适宜的发酵温度是30～35 ℃。
4．下列关于腐乳制作的叙述，错误的是(　　)
A．毛霉可利用其体内的酶将豆腐中的蛋白质分解成小分子肽和氨基酸
B．卤汤中酒的含量越高，杂菌繁殖越快，豆腐越易腐败
C．用盐腌制腐乳的过程中，要控制盐的用量，盐的浓度过高会影响口味，过低则不足以抑制杂菌的生长，导致豆腐腐败
D．其制作过程可以表示为：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制
解析：选B　豆类中含量最多的有机物是蛋白质，毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸。卤汤中酒的含量过高，腐乳成熟的时间将会延长；卤汤中酒的含量过低，杂菌繁殖快，可能导致豆腐腐败。
5．家庭制作果酒、果醋和腐乳三种传统发酵食品的共同点是(　　)
A．菌种均可来自自然环境
B．均需在相同温度下进行发酵
C．均需在无氧环境下发酵
D．发酵过程中微生物的种群密度不断增大
解析：选A　参与果酒制作的微生物是酵母菌，参与果醋制作的微生物是醋酸菌，参与腐乳制作的微生物主要是毛霉，家庭制作果酒、果醋和腐乳的菌种均可来自自然环境；果酒制作的适宜温度是18～25 ℃，果醋制作的适宜温度是30～35 ℃，腐乳制作的适宜温度是15～18 ℃；参与果醋制作的醋酸菌是好氧菌，因此果醋发酵过程是有氧条件；发酵过程中，微生物的种群密度先增大，后保持相对稳定，最后减小。
6．将少量的酵母提取液加入到足量的葡萄汁中进行果酒制作，15 ℃条件下密封保温一段时间之后，检测到反应体系含有少量的酒精。如对上述实验的某个因子进行改动，实验的结果也会发生相应的变化。以下分析正确的是(　　)
A．增加酵母提取液的量，则产生相同酒精所需的时间延长
B．增加葡萄汁量，则相同时间内酒精浓度升高
C．保温温度提高到23 ℃，则相同时间内酒精浓度升高
D．连续通入无菌空气，则相同时间内酒精浓度升高
解析：选C　葡萄汁足量，增加酵母提取液的量，则产生相同酒精所需的时间缩短；由于葡萄汁已经足量，而酵母提取液的量一定，故增加葡萄汁的量，酒精浓度不会升高；酵母菌进行无氧呼吸产生酒精，连续通入无菌空气不会产生酒精；制葡萄酒时，酒精发酵控制的温度为18～25 ℃，升高温度到23 ℃，相同时间内酒精浓度升高。
二、高考题型练
7．(2018·柳州质检)下面是果酒和果醋制作的实验流程和发酵装置。根据图示回答下列问题：

(1)完成图1中的实验流程_________________________________________________。
(2)图2装置中的充气口在________过程中要关闭，否则可能发生使发酵液变酸的反应________________________________________________________________________
________________________________________________________________________(写出该反应式)，
而排气口在该过程中应开放，排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接，目的是________________________________________________________________________。
(3)葡萄酒呈现红色的原因是________________，重铬酸钾在酸性条件下与酒精反应呈______色。
(4)果酒和果醋的制作分别利用了酵母菌和____________两种微生物的发酵原理，后者在结构上的主要特点是________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：在酒精发酵阶段，充气口应关闭，否则醋酸菌会将乙醇氧化为醋酸，从而使发酵液变酸。酵母菌为真菌，属于真核生物，醋酸菌为细菌，属于原核生物，两者在结构上的主要区别是有无以核膜为界限的细胞核。
答案：(1)醋酸发酵
(2)酒精发酵　C2H5OH＋O2―→CH3COOH＋H2O　避免空气中其他微生物进入发酵装置(防止空气中的微生物污染)
(3)红色葡萄皮中的色素溶解在发酵液中　灰绿
(4)醋酸菌　无以核膜为界限的细胞核
8．(2018·泉州一模)请回答下列有关发酵食品制作的问题：
(1)在泡菜腌制的过程中，要注意控制腌制的时间、______和食盐的用量；最后要向坛盖边沿的水槽中注满水，这一操作的目的是________________________________________。
(2)在制作腐乳过程中，所需的微生物来源于____________________；而现代的腐乳生产是在________条件下，将优良的菌种直接接种在豆腐上，这样可以避免其他菌种的污染。
(3)某同学制作蓝莓果醋时，定时通过充气口充气，原因是
________________________________________________________________________。
另一位同学在蓝莓果汁中直接加入某品牌活性酵母，之后先向发酵罐中通入一段时间的无菌空气，通入无菌空气的目的是_____________________________________________。
(4)在蓝莓果酒制作过程中，在变酸的酒的表面观察到的菌膜是由________大量繁殖而形成的，其可在缺少糖源时将乙醇变为________，然后变为醋酸。
解析：(1)在泡菜腌制的过程中，要注意控制腌制的时间、温度和食盐的用量；最后要向坛盖边沿的水槽中注满水，其目的是保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境。(2)在制作腐乳过程中，所需的微生物来源于空气中的毛霉孢子；现代的腐乳生产是在无菌条件下进行的。(3)果醋的制作，使用的微生物是醋酸菌；醋酸菌是一种好氧菌，在氧气充足的条件下才能进行旺盛的生命活动，当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将果汁中的糖分解成醋酸，当氧气充足、缺少糖源时，醋酸菌可以先将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。由此可知：制作蓝莓果醋时，定时通过充气口充气的原因是醋酸菌是好氧细菌，将乙醇变为醋酸时需要氧气参与。在蓝莓果汁中直接加入某品牌活性酵母后，向发酵罐中通入一段时间的无菌空气，其目的是在有氧条件下，使酵母菌迅速繁殖，数量增加。(4)在蓝莓果酒制作过程中，在变酸的酒的表面观察到的菌膜是由醋酸菌大量繁殖而形成的，其可在缺少糖源时将乙醇变为乙醛。
答案：(1)温度　保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境
(2)空气中的毛霉孢子　无菌
(3)醋酸菌是好氧细菌，将酒精变为醋酸时需要氧气参与　在有氧条件下，使酵母菌迅速繁殖，数量增加
(4)醋酸菌　乙醛
9．(2018·武昌模拟)鸭梨醋饮属于绿色健康饮品，既保存了鸭梨中的多种氨基酸、维生素、矿物质、有机酸等营养成分，又兼具果醋醒酒护肝、助消化、降低血脂、软化血管等的养生保健功能，深受广大消费者的青睐。下面为鸭梨醋饮的制作流程图，请据图回答问题：
―→
(1)果酒的酿造原理是先使酵母菌进行__________，以增加酵母菌的数量，然后再通过__________________获得果酒。
(2)在果酒的自然发酵过程中，起主要作用的是附着在__________上的野生型酵母菌。
(3)酒精发酵时一般将温度控制在18～25 ℃，温度过高时，酵母菌代谢减慢甚至死亡，原因是__________________________________________________。
(4)果醋发酵过程中，适宜的温度为_____________，较高的酒精度通常不适宜进行醋酸发酵，原因是_________________________________________________________________。
(5)酒精发酵后转入醋酸发酵前，除改变温度外，还需调整的发酵条件是____________。
解析：(1)果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌在氧气充足时进行有氧呼吸，大量繁殖，在无氧条件下，进行无氧呼吸产生酒精。(2)在果酒的自然发酵过程中，起主要作用的是附着在鸭梨皮上的野生型酵母菌。(3)温度主要影响酶的活性。(4)醋酸菌的最适生长温度为30～35 ℃。酒精浓度过高会抑制醋酸菌的生长和代谢，影响产酸量。(5)醋酸菌是需氧型细菌，发酵时需要通入无菌空气。
答案：(1)有氧呼吸　无氧呼吸　(2)鸭梨皮　(3)温度过高，酶的活性降低或失活　(4)30～35 ℃　较高浓度的酒精会抑制醋酸菌的生长和代谢，使产酸量下降　(5)通入无菌空气
10．以下是有关泡菜发酵过程中的相关问题，请回答：
(1)蔬菜刚入坛时，其表面带有不抗酸的大肠杆菌和酵母菌等微生物。其中的酵母菌最初的呼吸作用方式是__________，请写出相关反应式：________________________________________________________________________。
(2)到发酵中期，无氧环境形成，乳酸菌开始活跃，并产生大量乳酸，使乳酸积累量达到0.6%～0.8%，pH为3.5～3.8，试分析此时坛内其他微生物的活动情况及原因：________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)发酵后期，乳酸含量继续增加，当达到1.2%以上时，发酵速度逐渐变缓甚至停止，主要原因是___________________________________________。
(4)请在下列坐标图中画出该过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐含量的变化趋势。

解析：蔬菜入坛的初期，坛内氧气充足，酵母菌主要进行有氧呼吸产生CO2和H2O。发酵后期发酵速度变缓甚至停止的主要原因是过多的乳酸使pH过低，抑制了乳酸菌的生长。
答案：(1)有氧呼吸　C6H12O6＋6O2＋6H2O6CO2＋12H2O＋能量　(2)其他微生物活动减慢甚至停止，因为pH不适宜　(3)pH过低抑制了乳酸菌的生长　(4)如图所示：

11．(2018·泰安模拟)利用不同微生物的发酵作用制作食品，历史悠久、惠及民生。请分析回答下列问题：
(1)腐乳制作的流程是：让豆腐上长出__________→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制。用盐腌制时，应注意控制____________；配制卤汤时，要使卤汤中酒的含量控制在________%左右。
(2)制作泡菜的原理是___________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)蔬菜在腌制过程中，会产生亚硝酸盐。在__________条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生____________反应后，与N­1­萘基乙二胺盐酸盐结合形成____________色染料。将显色反应后的样品与已知浓度的标准液进行目测比较，估算出的亚硝酸盐含量如下图曲线所示，据图可以得出的结论是____________________________________________________
________________________________________________________________________。

解析：(1)腐乳制作的流程是：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制。腐乳制作过程中有多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。用盐腌制时，应注意控制盐的用量；配制卤汤时，要使卤汤中酒的含量控制在12%左右。(2)泡菜的制作离不开乳酸菌，乳酸菌是厌氧细菌，在无氧的环境下大量繁殖，将葡萄糖分解成乳酸。(3)蔬菜在腌制过程中，会产生亚硝酸盐。测定亚硝酸盐含量的原理是在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N­1­萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料。由绘制出的亚硝酸盐含量曲线图分析可知，泡菜封坛后亚硝酸盐含量不断增加，至第4 d含量最高，以后逐渐减少。
答案：(1)毛霉　盐的用量　12　(2)乳酸菌在无氧的环境下大量繁殖，将葡萄糖分解成乳酸　(3)盐酸酸化　重氮化　玫瑰红　泡菜封坛一段时间后亚硝酸盐含量不断增加，至第4 d含量最高，以后逐渐减少
12．蓝莓果实中富含花青素等营养成分，具有保护视力、防止脑神经老化、强心、抗癌、软化血管、增强机体免疫等功能。下面是获取蓝莓花青素、蓝莓酒和蓝莓醋的流程。结合所学知识，回答下列问题：

(1)获取蓝莓果汁时加入果胶酶能将果胶分解成可溶性的____________，使浑浊的果汁变得澄清。蓝莓花青素(在中性或碱性溶液中不稳定，在60 ℃以下热稳定性较好)的提取可用溶剂萃取法，考虑到色素提取液作为食品添加剂的安全性问题，在下述方案中，你认为较好的方案是________(填字母)。
A．清水＋甲醇　　　　　 B．盐酸＋乙醇
C．柠檬酸＋丙酮 D．柠檬酸＋乙醇
含花青素的粗品经真空干燥(可使水的沸点降至40 ℃)制成成品，采用该方法的主要原因是________________________________________________________________________。
(2)酿制蓝莓酒时，一般要先通气的目的是________________________________。通常不需要对蓝莓进行严格的消毒处理，是因为在缺氧、呈酸性的发酵液中________________________________________。醋酸菌将乙醇变为醋酸的环境条件是糖源________(填“充足”或“缺少”)。酿制成功的蓝莓果酒如果暴露在空气中会逐渐出现醋酸味，气温高的夏天更易如此，其原因是_____________________________________________
　。
(3)若蓝莓果汁中已含有醋酸菌，在蓝莓果酒发酵旺盛时，醋酸菌能否将果汁中的糖发酵为醋酸？__________，说明原因：_______________________________________________。
为鉴定蓝莓果醋是否酿制成功，除可以通过观察菌膜、尝、嗅之外，还可以通过检测____________________作进一步的鉴定。
解析：(1)果胶酶可将蓝莓果汁中的果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸，使浑浊的果汁变得澄清。根据题干信息，蓝莓花青素在中性或碱性溶液中不稳定，故应用酸性溶液提取，考虑到食品添加剂的安全性问题，适宜选用柠檬酸＋乙醇作为提取剂；花青素在60 ℃以下热稳定性较好，真空干燥可使水的沸点降低，从而避免温度过高导致花青素分解。(2)酿制蓝莓酒时先通气有利于酵母菌大量繁殖。通常不需对蓝莓进行严格的消毒处理，是因为绝大多数微生物在缺氧、酸性环境中生长受抑制。在糖源不足的情况下，醋酸菌在有氧条件下可以将果酒发酵成果醋。醋酸菌是好氧细菌，最适生长温度为30～35 ℃，所以酿制成功的蓝莓果酒如果暴露在空气中会导致醋酸菌大量生长而逐渐出现醋酸味。(3)如果果汁中已含有醋酸菌，在果酒发酵旺盛时，醋酸菌不能将果汁中的糖发酵为醋酸，因为果酒发酵是在缺氧环境中进行的，而醋酸菌是好氧菌，果酒发酵时的缺氧环境能抑制醋酸菌生长。果醋是否酿制成功可以通过观察菌膜、尝、嗅，以及检测发酵前后的pH进行判断。
答案：(1)半乳糖醛酸　D　避免干燥时温度过高导致花青素分解　(2)让酵母菌在有氧条件下大量繁殖　绝大多数微生物无法适应这一环境而受抑制　缺少　醋酸菌是好氧细菌，最适生长温度为30～35 ℃(夏天温度较高)，导致醋酸菌大量生长产生醋酸　(3)不能　果酒发酵时的缺氧环境能抑制醋酸菌生长　发酵前后的pH

第二讲微生物的培养与应用


[基础知识·系统化]

知识点一　微生物的实验室培养
1．培养基

2．无菌技术

3．大肠杆菌的纯化培养

知识点二　土壤中分解尿素的细菌的分离

知识点三　分解纤维素的微生物的分离
1．实验原理

2．实验流程

[基本技能·问题化]

1．据某微生物培养基的配方表回答下列问题

编号
①
②
③
④
⑤
成分
(NH4)2SO4
KH2PO4
FeSO4
CaCl2
H2O
含量
0.4 g
4.0 g
0.5 g
0.5 g
100 mL

(1)此培养基按物理性质划分属于液体培养基，因为没有凝固剂(如琼脂)；按功能划分属于选择培养基，因为没有碳源，只有自养型微生物才能生长(利用空气中的CO2)。
(2)此培养基含有的微生物的营养成分包括水、无机盐和氮源三类，若加入氨基酸，则它可充当的营养成分包括碳源、氮源和生长因子。
(3)若要观察微生物的菌落特征，培养基中应添加的成分是凝固剂(琼脂)。
(4)若用该培养基来分离尿素分解菌，应除去表中①成分(填表中序号)，加入尿素和不含氮元素的有机物。
2．下图是倒平板的操作，请据图填空

(1)请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：丙→乙→甲→丁。
(2)甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。
(3)丁中的操作需要等待平板冷却凝固后才能进行。
3．据两种接种方法产生的培养效果图完成下列问题

(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是稀释涂布平板法、平板划线法。
(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象。
提示：最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灭菌。采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灭菌。
4．连线以下几种选择培养基和鉴别培养基及其应用




考点一培养基及微生物的纯化培养技术

命题点(一)　培养基的成分、功能和制备
1．(2016·全国卷Ⅰ)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：
①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；
②制作无菌平板；
③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；
④将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题：
(1)该培养基中微生物所需的氮来源于______________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是____________。
(2)步骤③中，实验组的操作是_______________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了__________现象。若将30(即36－6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法______________(填“正确”或“不正确”)。
解析：(1)牛肉膏和蛋白胨中均含有氮元素，因此微生物所需的氮来源于牛肉膏和蛋白胨。若要完成步骤②，需要进行倒平板操作，用到的是固体培养基，所以培养基中要有琼脂。(2)该实验的空白对照组为不进行处理的无菌平板，实验组的操作为将各无菌平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露相同时间。(3)若空白对照组的平板上出现了菌落，说明实验过程中出现了污染现象。空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，导致实验变量不唯一，不能确定实验组平板上的菌落是否仅由教室内不同高度空气中的微生物形成，因此不能求出实验组的菌落平均值。
答案：(1)牛肉膏、蛋白胨　琼脂　(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间
(3)污染　不正确
2．(2016·全国卷 Ⅲ )某同学用新鲜的泡菜滤液为实验材料分离纯化乳酸菌。分离纯化所用固体培养基中因含有碳酸钙而不透明，乳酸菌产生的乳酸能溶解培养基中的碳酸钙。回答下列问题：
(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用__________对泡菜滤液进行梯度稀释，进行梯度稀释的理由是______________________________________________。
(2)推测在分离纯化所用的培养基中加入碳酸钙的作用有______________________和____________________。分离纯化时应挑选出________________的菌落作为候选菌。
(3)乳酸菌在－20 ℃长期保存时，菌液中常需要加入一定量的________________(填“蒸馏水”“甘油”或“碳酸钙”)。
解析：(1)分离纯化乳酸菌时，首先需要用无菌水对泡菜滤液进行梯度稀释，这样既可避免杂菌污染，又可将乳酸菌分散成单个细胞，以便在培养基表面形成单个菌落。(2)乳酸的积累影响乳酸菌的增殖，加入碳酸钙可以中和乳酸菌代谢(无氧呼吸)过程中产生的乳酸，另外，乳酸和碳酸钙反应，进而导致碳酸钙分解形成透明圈，有利于乳酸菌的鉴别和分离。(3)对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。在3 mL的甘油瓶中，装入1 mL甘油后灭菌。将1 mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20 ℃的冷冻箱中保存。
答案：(1)无菌水　泡菜滤液中菌的浓度高，直接培养很难分离得到单菌落　(2)鉴别乳酸菌　中和产生的乳酸(或酸)　具有透明圈　(3)甘油

[重难点拨]
常用选择培养基与鉴别培养基实例归纳
类型
实例
选择培养基
培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
培养基中加入高浓度的食盐用于分离得到金黄色葡萄球菌
以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌
不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物
石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的
培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物
鉴别培养基
伊红—美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌(菌落呈黑色)

命题点(二)　无菌技术的操作
3．(2014·江苏高考节选)为了获得β ­胡萝卜素产品，某小组开展了产β ­胡萝卜素酵母的筛选与色素提取实验。请回答下列问题：
(1)实验用的培养皿常用的两种灭菌方法是________________________________；为了减少灭菌后器皿被污染，灭菌前应该______________________。
(2)为了筛选出酵母菌，培养基中添加了青霉素，其目的是______________。
(3)右图是灭菌锅及其局部剖面示意图，图中甲、乙、丙指示的依次是__________。 (填序号)
①安全阀、放气阀、压力表
②放气阀、安全阀、压力表
③安全阀、放气阀、温度表
④放气阀、安全阀、温度表
(4)为了将分离到的菌株纯化，挑取了菌落在3块相同平板上划线，结果其中一块平板的各划线区均未见菌生长，最可能的原因是_____________________________________。
解析：(1)实验室常用的灭菌方法是干热灭菌和湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)，在实验前应用牛皮纸或干净的报纸包扎器皿。(2)酵母菌是真菌，对青霉素具有抵抗能力，青霉素主要抑制细菌、放线菌的生长。(3)图中甲为安全阀，乙为放气阀，丙为压力表。(4)接种的平板上未见菌落生长，说明接种不成功，原因可能是接种环灼烧后未冷却，使菌株因温度过高而被杀死。
答案：(1)干热灭菌和湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)　用牛皮纸(报纸)包扎器皿　(2)抑制细菌(放线菌)的生长　(3)①
(4)接种环温度过高，菌种被杀死
[重难点拨]
全面比较消毒和灭菌

条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部的部分微生物
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药剂
消毒法
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属用具
高压蒸汽
灭菌法
培养基及容器

命题点(三)　微生物的培养与纯化
4．(2017·江苏高考)苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据如图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：

(1)酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有____________。
(2)将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐________，以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步____________，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加________。
(3)右图为连续划线法示意图，在图中____________(填图中序号)区域更易获得单菌落。
(4)采用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5号比色管的苯酚浓度应分别为____________。
管号
1
2
3
4
5
6
苯酚浓度(mg/L)





1
如果废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释________(填序号：①5　②10　③20)倍后，再进行比色。
解析：(1)富集培养基中蛋白胨、苯酚都是含碳的有机物，可作为碳源。(2)欲富集酚降解菌，随转接次数的增加，应逐渐增加培养基中苯酚的含量；若接种培养后平板上菌落过于密集，则应进一步稀释后再进行涂布，以降低平板上菌落密度，便于菌落计数与分离；平板培养基是固体培养基，除含有水、营养物质(碳源、氮源、无机盐等)外，还需添加琼脂作为凝固剂。(3)利用连续划线法接种时，最后的划线区域(③)中，菌体的密度较小，容易获得单菌落。(4)因系列浓度梯度中6号比色管中苯酚浓度为1 mg/L，故1～5号比色管中的苯酚浓度应分别为0 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L；根据题意，废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，要使稀释后的苯酚残留液浓度介于0～1 mg/L，需将残留液稀释20倍左右。
答案：(1)蛋白胨、苯酚　(2)增加　稀释涂布　凝固剂　(3)③　(4)0、0.2、0.4、0.6、0.8　③
5．(2014·全国卷Ⅱ)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：
(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是__________________________；然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为________个。
(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过________灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线。这样做的目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)示意图A和B中，________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液中____________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高______________的利用率。
解析：(1)为了检测培养基平板灭菌是否合格，可在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间。0.1 mL 稀释液中平均有38个活菌，可推测每升水样中的活菌数＝38×10×100×1 000＝3.8×107(个)。(2)接种环、接种针或其他金属用具直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，其目的是将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落。(3)比较两图可以看出，A是用平板划线法接种培养后得到的结果，B是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。(4)由于振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，还可以使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率，因此振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。
答案：(1)检测培养基平板灭菌是否合格　3.8×107
(2)灼烧　将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落
(3)B　(4)溶解氧　营养物质
[重难点拨]
平板划线法和稀释涂布平板法的比较
比较项目
平板划线法
稀释涂布平板法
关键操作
接种环在固体平板培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释
②涂布平板法操作
注意事项
每次划线前后均需灼烧接种环
稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围
菌体获取
在具有显著的菌落特征的区域菌落中挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
适用范围
适用于好氧菌
适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
优点
可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落
既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点
不能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板

考点二微生物的筛选与计数
命题点(一)　土壤中分解尿素细菌的分离与计数
1．(2017·全国卷Ⅰ)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：
(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生__________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是__________________________________________。但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是__________________________________________________________(答出两点即可)。
(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是____________________________________________________。
(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________________(答出两点即可)。
解析：(1)土壤中的某些细菌之所以能够分解尿素，是因为它们能产生脲酶。尿素分解菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物，必须利用现成的有机物(如葡萄糖)作为碳源；葡萄糖通过呼吸作用被分解时，能为细胞生命活动提供能量，同时，葡萄糖还可以转化成脂肪、某些氨基酸等物质，所以进入细菌体内的葡萄糖能为其他有机物的合成提供原料。(2)选择培养基只是允许特定种类的微生物(目的微生物)生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。本实验的目的菌是可分解尿素的细菌，因此配制的培养基应只允许尿素分解菌生长，NH4NO3可以作为所有细菌的氮源，培养基中如含有NH4NO3，将不能起到筛选作用。(3)KH2PO4和Na2HPO4能为细菌生长提供钾盐、钠盐和磷酸盐，而H2PO/HPO可作为缓冲剂，使培养基中pH保持相对稳定。
答案：(1)脲酶　分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物　为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料　(2)尿素　其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用　(3)为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
2．(2016·四川高考)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。

(1)图中选择培养基应以________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。
(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。
该过程采取的接种方法是__________________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。
(3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为________，突变基因表达的蛋白含________个氨基酸。
解析：(1)脲酶能够催化尿素分解释放出氨和二氧化碳，因此选择培养基中应以尿素为唯一氮源。挑取单菌落接种到加有酚红指示剂的鉴别培养基中，培养一段时间后，菌落周围的氨增加，pH升高，酚红指示剂将变红。(2)该过程采取的接种方法为稀释涂布平板法。利用稀释涂布平板计数法对细菌进行计数时，应选择菌落数在30～300的平板，因此平板上长出的细菌菌落平均数为(156＋178＋191)÷3＝175个。每克土壤样品中的细菌数为175÷0.1×105＝1.75×108个。血细胞计数板计数法能将死细胞计算在内，而稀释涂布平板计数法只能计数活细胞(只有活细胞才能在平板上生长)，故一般血细胞计数板计数法要比稀释涂布平板计数法的结果大。(3)箭头处插入70个核苷酸，箭头后密码子的解读方式为*AG，UGA，GAA……对比3种终止密码可发现，此处的终止密码为UGA。从起始密码到终止密码之前共有273＋72个碱基，因此突变基因表达的蛋白质含115个氨基酸。
答案：(1)尿素　酚红　红　(2)稀释涂布平板法　1.75　少　(3)UGA　115
[重难点拨]
统计菌落数目的两种方法
(1)显微镜直接计数法：
原理
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
方法
用计数板计数
缺点
不能区分死菌与活菌

(2)间接计数法(活菌计数法)：
原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
计算公式
每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数
操作
设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数

命题点(二)　分解纤维素的微生物的分离
3．(2014·全国卷Ⅰ)植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题：
(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将__________分解成________。
(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。
(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：

酵母膏
无机盐
淀粉
纤维素粉
琼脂
CR溶液
水
培养基甲
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
培养基乙
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
注：“＋”表示有，“－”表示无。
据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是________________________；培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是____________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)纤维素酶至少包括3种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，C1酶、CX酶催化纤维素分解成纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解成葡萄糖。(2)CR能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，CR­纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌的菌落为中心的透明圈。(3)培养基甲中未添加琼脂，为液体培养基，液体培养基上不能形成单菌落，故不能用于分离和鉴别纤维素分解菌。培养基乙中未添加纤维素，不能和CR形成红色复合物，即使出现单菌落也不能确定为纤维素分解菌。
答案：(1)纤维二糖　葡萄糖　(2)红　透明圈　(3)不能　液体培养基不能用于分离单菌落　不能　培养基中没有纤维素，不会形成CR­纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌

[重难点拨]
微生物的筛选与鉴别方法
(1)微生物的筛选方法：
单菌落挑取法
利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物
选择培养法
利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物
鉴定培养法
利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物

(2)微生物的鉴别方法：
菌落特征鉴别法
根据微生物在固体平板培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别
指示剂鉴别法
如培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素
染色鉴别法
如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物


[真题集训——验能力]
1．(2015·全国卷Ⅰ)已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。回答有关问题：
(1)显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用________染色。微生物A产生的油脂不易挥发，可选用__________(填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”)从菌体中提取。
(2)为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以________为碳源的固体培养基进行培养。
(3)若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用________________直接计数；若要测定其活菌数量，可选用______________法进行计数。
(4)为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35 ℃、40 ℃、45 ℃下降解10 g油脂所需酶量依次为4 mg、1 mg、6 mg，则上述三个温度中，______ ℃条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕________ ℃设计后续实验。
解析：(1)油脂可被苏丹Ⅲ染液染成橘黄色，被苏丹Ⅳ染液染成红色，因此油脂通常用苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染色。不易挥发的物质大多采用萃取法进行提取，水蒸气蒸馏法一般用来提取易挥发的物质。(2)能产生脂肪酶的微生物B能利用脂肪(油脂)作为碳源，所以在制备选择微生物B的培养基时，应将油脂作为唯一的碳源。(3)用显微镜直接对微生物进行计数，需要用血细胞计数板。如果对活菌进行计数，则要用稀释涂布平板法涂布平板，培养后统计菌落数目，然后计算出活菌数量。(4)降解等量的油脂，需要的酶量越多，说明此温度下的酶的活力越小。所以三种温度中45 ℃下酶的活力最小。从三种温度下的实验结果可知，40 ℃下酶的活力最大，所以要想测定该酶的最适温度，应围绕该温度设计不同温度梯度，进行后续实验。
答案：(1)苏丹Ⅲ(或苏丹Ⅳ)　萃取法　(2)油脂　(3)血细胞计数板　稀释涂布平板　(4)45　40
2．(2015·江苏高考)人工瘤胃模仿了牛羊等反刍动物的胃，可用来发酵处理秸秆，提高秸秆的营养价值。为了增强发酵效果，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素能力进行了研究。请回答下列问题：
(1)在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是________(填序号)。
①酒精灯　②培养皿　③显微镜　④无菌水
(2)在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是________________________________________________________________________
________________________。
(3)向试管内分装含琼脂的培养基时，若试管口粘附有培养基，需要用酒精棉球擦净的原因是________________________________________________________________________
________________________。
(4)刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。研究人员在刚果红培养基平板上，筛到了几株有透明降解圈的菌落(见图)。图中降解圈大小与纤维素酶的____________有关。图中降解纤维素能力最强的菌株是______(填图中序号)。
(5)研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4，在不同温度和pH条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果见下图，推测菌株________更适合用于人工瘤胃发酵，理由是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。

解析：(1)在样品稀释和涂布平板过程中，需要在酒精灯火焰附近进行操作，培养皿用于盛放培养基并培养细菌，无菌水做稀释的溶剂，此处唯一用不到的是显微镜。(2)在涂布平板时，要取少量菌悬液滴加到培养基表面，因为如果滴加菌悬液量过多，菌悬液就会堆积在培养基表面，影响分离效果。(3)在向试管内分装含琼脂的培养基时，如果试管口粘附有培养基，就很容易使棉塞受到污染，因此，需要用无菌的酒精棉球将试管口擦拭干净。(4)因为刚果红可以与纤维素形成红色复合物，且不与纤维素降解产物反应。所以在刚果红培养基平板上，菌落周围有透明降解圈是纤维素被降解的结果，降解圈大小由纤维素酶的活性和量决定。图中菌落①周围的降解圈最大，因此其降解纤维素的能力最强。(5)考虑到人工瘤胃的发酵过程会使发酵液酸性增加，温度升高，在这个前提下，观察不同温度和pH条件下测得的发酵液中酶活性的结果图，从图中可以看出，在高温和低pH条件下都是J4菌株中的纤维素酶的活性较高，因而该菌株更适合用于人工瘤胃发酵。
答案：(1)③　(2)培养基表面的菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果　(3)避免培养基污染棉塞
(4)量与活性　①　(5)J4　发酵过程会产热和产酸，J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高
3．(2014·四川高考节选)有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污染环境。研究发现，苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分离降解苯磺隆的菌株和探索其降解机制的实验过程如图甲、乙所示。

(1)微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、________________四类，该实验所用的选择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，其原因是________________________________________________________________________。
(2)纯化菌株时，通常使用的划线工具是________。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有____________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)为探究苯磺隆的降解机制，将该菌种的培养液过滤离心，取上清液做图乙所示实验。该实验的假设是___________________________________，该实验设计是否合理？为什么？________________________________________________________________________。
解析：(1)微生物生长繁殖需要的主要营养物质包括碳源、氮源、水和无机盐四类。根据题意可知，土壤中某些微生物有降解苯磺隆的能力，该实验的目的是探索其降解机制，因此，需要分离出有降解苯磺隆能力的土壤中的某些微生物，故选择培养时为了排除其他碳源的干扰，培养基中唯一碳源只能是苯磺隆。(2)纯化菌株时，通常使用的划线工具是无菌接种环。据题意分析知，造成此现象的原因可能有两个：一是接种环灼烧后未冷却，菌种接触到高温的接种环而死亡；二是划第二划线区域的第一条线时未从第一区域末端开始。(3)根据图乙所示实验中的上清液加入蛋白酶溶液推测，实验目的是探究目的菌株是否能分泌降解苯磺隆的蛋白质，实验设计不合理之处是缺少不加蛋白酶溶液、其他条件同图乙的空白对照。
答案：(1)氮源和无机盐　只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长繁殖　(2)接种环　①接种环灼烧后未冷却；②划线未从第一区域末端开始　(3)目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质　不合理，缺少空白对照
4．(2013·全国卷Ⅱ)临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。回答下列问题：
(1)为了从样本中获取致病菌单菌落，可用__________法或________法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。
(2)取该单菌落适当稀释，用________法接种于固体培养基表面，在37 ℃培养箱中培养24 h，使其均匀生长，布满平板。
(3)为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A________；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B__________；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明________________________________________；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的________。
(4)根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好选用抗生素________。
解析：(1)微生物的常用接种方法为平板划线法和稀释涂布平板法。(2)能够使菌落均匀生长、布满平板的接种方法为稀释涂布平板法。(3)含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A敏感；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B不敏感；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明该致病菌对C的敏感性比对A的弱；含D的滤纸片周围的透明圈比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落(排除杂菌污染)，说明该致病菌可能对抗生素D产生了抗药性。
答案：(1)平板划线　稀释涂布平板(或涂布)　(2)涂布　(3)敏感　不敏感　该致病菌对C的敏感性比对A的弱　耐药菌　(4)A
[课下检测——查缺漏]
一、基础题点练
1．下列有关微生物培养的叙述，错误的是(　　)
A．测定土壤样品中的细菌数目，常用稀释涂布平板法进行菌落计数
B．在对微生物进行培养前，需要对微生物和培养基进行灭菌
C．酵母菌发酵过程产生的酒精，对其他微生物生长有一定的抑制作用
D．分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源
解析：选B　在对微生物进行培养前，需要对培养基进行灭菌，不能对所培养的微生物进行灭菌。
2．做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是(　　)
A．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖
B．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
C．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
D．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
解析：选D　在高压灭菌的操作过程中，加热结束后应让灭菌锅内温度自然下降，待压力表的指针指到零时，打开放气阀，旋松螺栓，打开盖子。倒平板时，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不是完全取下放到一边。接种环经火焰灼烧灭菌后应在火焰旁冷却后，再用其挑取菌落。在微生物的培养中，一般将培养皿倒置，在皿底上用记号笔做标记。
3．下列关于统计菌落数目方法的叙述，错误的是(　　)
A．采用平板计数法获得的菌落数往往少于实际的菌落数
B．当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落
C．为了保证结果准确，一般采用密度较大的平板进行计数
D．在某一浓度下涂布三个平板，若三个平板统计的菌落数差别不大，则应以它们的平均值作为统计结果
解析：选C　当两个或多个活菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。一般选择菌落数在30～300的平板计数，密度过大会使计数结果偏小，影响结果的准确性。至少涂布3个平板，作为重复组，取其平均值计数能增强实验的说服力和准确性。
4.在涂布有大肠杆菌的培养基上进行抑菌实验，在a、b、c处分别贴浸有不同抗生素(浓度相同)的无菌滤纸片，d处滤纸片浸有无菌水。培养后的结果如图所示。以下判断错误的是(　　)
A．a处抑菌效果小于b处
B．b处的滤纸片没有沥干
C．c处抗生素无效
D．d为对照
解析：选A　培养皿中不同滤纸片四周透明圈的大小不同，透明圈越大，说明浸有的抗生素抑菌效果越好。a处的透明圈大于b处；b处不是圆形的透明圈，可能是滤纸片没有沥干，抗生素流出滤纸片；c处无透明圈，说明c处抗生素对大肠杆菌无效；d为空白对照。
5．(2016·江苏高考)漆酶属于木质素降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。如图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述正确的是(多选)(　　)

A．生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品
B．筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落
C．在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化
D．斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株
解析：选BC　生活污水中含木质素的物质相对较少，产漆酶菌株也较少，不宜作为分离产漆酶菌株的样品；产漆酶菌株可降解木质素，在筛选培养基中加入木质素可筛选产漆酶的菌株，筛选时可通过菌落特征挑出产漆酶的菌落；在涂布平板上生长的菌落可能还有其他杂菌，可再通过平板划线法进一步纯化；对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法，即在－20 ℃的冷冻箱中保存。
二、高考题型练
6．回答与微生物实验室培养有关的问题：
(1)在制备固体培养基时需加入的常用凝固剂是________。若培养基需调节pH，则应在灭菌之________(填“前”或“后”)调节。
(2)为防止外来杂菌入侵，对________________________等可采用干热灭菌法进行灭菌。

(3)右图为平板划线法接种后的示意图。在划线接种的整个操作过程中，对接种环至少需进行________次灼烧灭菌。接种后盖上皿盖，将平板________放入恒温箱中培养，这样放置的目的是_______________________________________________________________。
(4)用稀释涂布平板法统计活菌数目时，每隔一个“时间间隔”统计一次菌落数目，最后选取________________________________________________________________________
作为结果，这样可以防止因培养时间不足而遗漏菌落的数目。
解析：(1)制备固体培养基通常加入的凝固剂是琼脂。培养基若在灭菌后调pH，可造成污染，故培养基调pH应在灭菌前进行。(2)灭菌的方法通常有高压蒸汽灭菌、干热灭菌和灼烧灭菌三种。采用干热灭菌的通常有玻璃器皿和金属用具。(3)平板划线接种过程中需在接种前、每次划线后对接种环进行灼烧灭菌。图中共接种5个区域，故接种环至少需要进行6次灼烧灭菌处理。微生物培养过程中，易产生冷凝水，为防止水珠滴在培养基表面造成污染，培养时需将平板倒置。(4)用稀释涂布平板法统计活菌数目时，要以菌落数目稳定时的记录为最终结果，这样可以防止因遗漏而导致统计结果偏小。
答案：(1)琼脂　前　(2)玻璃器皿和金属用具　(3)6　倒置　避免培养基被污染和防止培养基水分过快挥发
(4)菌落数目稳定时的记录
7．(2018·郴州质检)分解尿素的微生物广泛存在于农田等土壤中，某生物实验小组尝试对分解尿素的微生物进行分离与计数。请回答下列问题：
(1)分解尿素的微生物能产生________酶；配制培养基时应以________作为唯一氮源。
(2)培养基中添加________作为指示剂，培养后，培养基pH会________(填“升高”或“降低”)，可使指示剂变红色。
(3)对尿素溶液进行灭菌的最适方法是__________。
(4)该小组在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，这样做的目的是________________________________________________________________________；
然后将1 mL样液稀释10 000倍，在3个平板上用涂布法分别涂布0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板的菌落数分别为39、42和45。据此可得出每毫升样液中分解尿素的微生物活菌数为________个。
解析：(1)分解尿素的微生物能产生脲酶；配制培养基时应以尿素作为唯一氮源。(2)在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶分解尿素可产生氨，氨会使培养基的pH升高，进而使酚红指示剂变红。(3)对尿素溶液进行灭菌的最适方法是过滤法。(4)在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，其目的是检测培养基平板灭菌是否合格。每毫升样液中分解尿素的微生物活菌数＝(C÷V)×M＝[(39＋42＋45)÷3]÷0.1×10 000＝4.2×106(个)
答案：(1)脲　尿素　(2)酚红　升高　(3)过滤法　
(4)检测培养基平板灭菌是否合格　4.2×106
8．(2018·桂林调研)有机磷农药是用于防治植物病虫害的含磷有机化合物，广泛应用于农业生产中，有时会造成瓜果蔬菜等食品农药残留超标，不少品种对人、畜的毒性很强，人误食后如不及时医治就会危及生命，某班同学欲从土壤中分离高效降解有机磷农药的微生物。请回答下列问题：
(1)为了获得能降解有机磷农药的微生物菌种，可在被有机磷农药污染的土壤中取样，并在含有碳源、氮源及________等的选择培养基上添加__________进行选择培养。
(2)将获得的3种待选微生物菌种甲、乙、丙分别接种在1 L含20 mg有机磷农药的相同培养液中培养(培养液中其他营养物质充裕、条件适宜)，观察实验开始到微生物停止生长所用的时间，甲、乙、丙分别为32小时、45小时、16小时，则应选择微生物________(填“甲”“乙”或“丙”)作为菌种进行后续培养，理由是________________________________________________________________________。
(3)制备固体培养基的基本步骤是计算→________→溶化→分装→加棉塞→包扎→____________→倒平板。
(4)若要测定培养液中选定菌种的菌体数，既可在显微镜下用____________直接计数，也可选用________________法统计活菌数目。
解析：(1)微生物生长所需要的营养一般包括水、无机盐、碳源和氮源。因筛选能降解有机磷农药的微生物，故培养基中需添加适量的有机磷农药。(2)从观察实验开始到微生物停止生长，丙所用时间最短，说明其对有机磷农药的降解能力较甲、乙强。(3)制备固体培养基的基本步骤是计算→称量→溶化→分装→加棉塞→包扎→高压蒸汽灭菌→倒平板。(4)菌体数测定可通过显微镜利用血细胞计数板直接计数，也可以利用稀释涂布平板法统计活菌数量。
答案：(1)水和无机盐　有机磷农药
(2)丙　微生物丙分解有机磷农药的能力比甲、乙强
(3)称量　高压蒸汽灭菌
(4)血细胞计数板　稀释涂布平板
9．(2018·河南六市联考)微生物强化采油(MEOR)是利用某些微生物能降解石油，增大石油的乳化度，降低石油黏度的原理，通过向油井中注入含微生物的水来提高采油率的新技术。以下是人们筛选、纯化和扩大培养该类微生物的实验操作。请回答下列问题：
(1)土壤是微生物的大本营，该类微生物应取自______________的土壤。
(2)为筛选和纯化该类微生物，从功能上分，应选用______培养基。常用的接种方法是__________和______________。
(3)接种后，应密封培养的原因是___________________________________________，
培养一段时间后在培养基上形成降油圈，此时选取______________就可获得高效菌株。
(4)扩大培养过程中需要对微生物进行计数。取0.2 mL样品，用固体培养基对其培养，最后统计三个平板，菌落数分别是200、180、220。则样品中微生物的数量为________个/mL。该统计结果________(填“低于”或“高于”)实际值。
解析：(1)在长期被石油污染的土壤中生存下来的微生物，能降解石油，所以取样时应从含石油多的土壤中采集。(2)从功能上分，应选用特定的选择培养基进行筛选和纯化该类微生物；常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。(3)该类微生物是厌氧微生物，接种后应密封培养；培养一段时间后在培养基上可形成降油圈，降油圈越大，说明该处的微生物降解石油的能力越强，所以应选择降油圈大的菌落进行培养以获得高效菌株。(4)计算微生物的数量应取三个平板的平均值，即[(200＋180＋220)÷3]÷0.2＝1 000(个/mL)，该结果会低于实际值，因为当两个或多个菌落连在一起时，平板上观察到的只是单个菌落数。
答案：(1)长期被石油污染(含石油多的)
(2)选择　平板划线法　稀释涂布平板法
(3)该类微生物是厌氧型的　降油圈大的菌落
(4)1 000　低于
10．欲从腐乳中分离筛选出产蛋白酶活力高的毛霉菌株，设计了如下实验流程：

回答下列问题：
(1)毛霉属于________(填“真核”或“原核”)生物。在腐乳制作中，主要利用毛霉等微生物产生的____________酶将豆腐中的蛋白质和脂肪分解为小分子物质。
(2)步骤②进行涂布前，需将孢子悬浮液进行梯度稀释，进行梯度稀释的目的是________________________________________________________________________
__________。若进行10倍稀释，一般吸取1 mL悬浮液注入__________中，混匀。
(3)孟加拉红培养基常用于分离霉菌及酵母菌，在孟加拉红培养基中加入氯霉素可以抑制细菌的生长。从功能上看，孟加拉红培养基属于__________培养基。
(4)毛霉产生的酶能将酪蛋白分解而产生透明圈，在酪蛋白培养基中筛选到三个单菌落甲、乙、丙，其菌落直径分别为3.2 cm、2.8 cm、2.9 cm，其菌落与透明圈一起的直径分别为3.7 cm、3.5 cm、3.3 cm。应选择菌落________作为产蛋白酶活力高的毛霉候选菌。
解析：(1)毛霉属于真核生物。在腐乳制作中，主要利用毛霉等微生物产生的蛋白酶和脂肪酶将豆腐中的蛋白质和脂肪分解为小分子物质。(2)将孢子悬浮液进行梯度稀释的目的是增加悬浮液的稀释度，涂布培养能分离到单菌落。若进行10倍稀释，一般吸取1 mL悬浮液注入9 mL无菌水中，混匀。(3)孟加拉红培养基常用于分离霉菌及酵母菌，据此可知：从功能上看，孟加拉红培养基属于选择培养基。(4)毛霉产生的酶能将酪蛋白分解而产生透明圈，透明圈与菌落直径的比值反映了毛霉菌株产蛋白酶活力的能力，因此应挑选透明圈与菌落直径比值最大的菌体，即应选择菌落乙作为产蛋白酶活力高的毛霉候选菌。
答案：(1)真核　蛋白酶和脂肪　(2)增加悬浮液的稀释度，涂布培养能分离到单菌落　9 mL无菌水　(3)选择　(4)乙
11．(2017·长春二模)下面是筛选抗链霉素大肠杆菌的实验步骤及相关图解。

实验步骤：
①把大量对链霉素敏感的大肠杆菌接种在不含链霉素的培养基1的表面，进行培养。
②待其长出密集的小菌落后，用影印法接种到不含链霉素的培养基2上，随即再影印到含有链霉素的培养基3上，进行培养。
③在培养基3上出现了个别抗链霉素的菌落，将其挑选出。
请回答：
(1)配制培养基时除了满足基本的营养条件外，还需满足微生物生长对特殊营养物质、________、________的要求。
(2)从功能上看，含有链霉素的培养基属于________培养基。若在培养基中加入伊红和美蓝，则培养皿中长出的菌落颜色为________。由图可知，1号培养基接种的方法为________________。
(3)对2和3进行比较，在2上找到与3上相应的菌落，挑取其中一个菌落接种到____________(填“含链霉素”或“不含链霉素”)的培养基上，如果有较多的菌落出现，则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之__________(填“前”或“后”)。
(4)3中的菌落比1、2中的菌落少很多，这说明了基因突变具有__________的特点。
解析：(1)配制培养基时在提供几种基本营养条件的基础上，还需满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。(2)链霉素是抗生素，对大肠杆菌具有选择作用。在伊红和美蓝培养基上，大肠杆菌菌落颜色为黑色。由题图可知，1号培养基接种的方法为稀释涂布平板法。(3)培养基2和培养基3上相同的菌落，是具有相同性状的大肠杆菌形成的，在培养基2上找到与3上相应的菌落，挑取其中一个菌落接种到含链霉素的培养基上，若出现较多的菌落，则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之前。(4)抗链霉素性状是大肠杆菌基因突变后获得的性状，3号培养皿中的菌落比1号、2号中的菌落少很多，说明了基因突变频率很低。
答案：(1)pH　氧气　(2)选择　黑色　稀释涂布平板法　(3)含链霉素　前　(4)频率低(低频性)
12．(2017·惠州模拟)日前微博传言手机细菌比马桶按钮多。如图，央视和北京卫视通过实验展示调查结果。回答下列相关问题：

(1)该实验需制备培养基，培养基一般都含有水、碳源、__________________。
(2)据图，两电视台均采用________法接种，该方法需要________(多选)。
A．接种环 B．酒精灯　C．移液管　D．涂布器　E．无菌水
(3)通过观察菌落的________，可知手机屏幕和马桶按钮都存在多种微生物。两电视台实验操作均正确且完全一致，但报道结果截然不同，你认为原因是：________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)按图操作取样面积，实验员测定某手机屏幕的细菌数量，将10 mL菌悬液进行梯度稀释，分别取0.1 mL稀释倍数为102的样品液接种到三个培养基上，培养一段时间后，统计菌落数分别为48、50、52，则该手机屏幕的细菌数为________个/cm2。该实验对照组该如何设置______________________。
解析：(1)微生物培养基的成分一般包括水、碳源、氮源和无机盐。(2)据图分析可知，该实验的接种方法为稀释涂布平板法，用到的工具有酒精灯、移液管、涂布器、无菌水等。(3)不同的菌落形态、大小不同，图示两个电视台调查的手机屏幕和马桶按钮都有多种形态的菌落，即存在多种微生物。两电视台实验操作均正确且完全一致，但报道结果截然不同，原因可能是手机的取样和马桶按钮的取样都不相同。(4)根据提供的数据进行计算，某手机屏幕的细菌数＝(48＋50＋52)÷3×102÷0.1×10÷(5×5)＝2×104(个/cm2)。
答案：(1)氮源和无机盐
(2)稀释涂布平板　BCDE
(3)形态、大小　手机的取样和马桶按钮的取样都不相同
(4)2×104　取培养基涂布0.1 mL无菌水进行培养

第三讲生物技术在其他方面的应用


[基础知识·系统化]
知识点一　DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理

2．实验流程

知识点二　植物有效成分的提取
1．玫瑰精油的提取

2．橘皮精油的提取

3．胡萝卜素的提取


[基本技能·问题化]
1．下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作，请仔细观察并分析①～④操作的目的分别是什么

①________________________________________________________________________，
②________________________________________________________________________，
③________________________________________________________________________，
④________________________________________________________________________。
提示：①是使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质；②是析出DNA，去除溶于酒精的杂质；③是使DNA溶解在2 mol/L NaCl溶液中；④是稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14 mol/L，去除溶于低浓度NaCl溶液的杂质。
2．分析提取玫瑰精油的实验流程，回答下列问题

(1)填写图中序号代表的含义：
①为水蒸气蒸馏，②为NaCl，③为无水Na2SO4，④为过滤。
(2)图中加入②的目的是增大盐水的浓度，有利于玫瑰精油与水的分层；加入③的目的是吸收精油中残留的水分；④的目的是除去固体Na2SO4。
3.据胡萝卜素的纸层析结果示意图回答下列问题
(1)在A、B、C、D四点中，A和D是标准样品原点，B和C是提取样品原点。
(2)图中甲代表的物质是胡萝卜素，乙代表的物质是其他色素和杂质。


考点一DNA的粗提取与鉴定
1．(2014·江苏高考)下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A．酵母和菜花均可作为提取DNA的材料
B．DNA既溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸馏水
C．向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻棒上有白色絮状物
D．DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝
解析：选C　含DNA的生物材料都可用来提取DNA，只是选用DNA含量高的生物组织，成功的可能性更大；DNA在2 mol/L NaCl溶液和蒸馏水中溶解度都较大；向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，鸡血细胞会吸水破裂，但在蒸馏水中不会析出DNA；DNA溶液加入二苯胺试剂后需沸水浴加热，待冷却后溶液变蓝。
2．下面为“DNA的粗提取与鉴定”实验的一些重要操作示意图，据图回答下列有关该实验的问题：

(1)正确的操作顺序是______________________________。
(2)上图C、E步骤都加入蒸馏水，但其目的不同，分别是____________和__________________________________。
(3)图A步骤中所用酒精必须经过____________才能使用，该步骤的目的是______________________________。
(4)为鉴定A中所得到的丝状物的主要成分为DNA，可滴加____________试剂，沸水浴，如果出现________，则该丝状物的主要成分为DNA。
解析：两次加入蒸馏水的作用：第一次是使鸡血细胞吸水涨破，DNA从细胞中释放出来进入滤液；第二次是使溶解于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中的DNA析出，与杂质分离。本题还涉及DNA的鉴定，DNA可在沸水浴条件下与二苯胺试剂作用，被染成蓝色。
答案：(1)C→B→E→D→A　(2)加速鸡血细胞的破裂　降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出　(3)充分冷却　提取含杂质少的DNA　(4)二苯胺　蓝色
[重难点拨]
DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、3、4”
(1)加蒸馏水2次：
①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；
②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的浓度下降到0.14 mol/L，使DNA析出。
(2)用纱布过滤3次：
①过滤鸡血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；
②滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；
③过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液。
(3)用NaCl溶液4次：
①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；
②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；
③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；
④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA。

考点二植物有效成分的提取
命题点(一)　植物芳香油的提取
1．(2017·全国卷Ⅲ)绿色植物甲含有物质W，该物质为无色针状晶体，易溶于极性有机溶剂，难溶于水，且受热、受潮易分解。其提取流程为：植物甲→粉碎→加溶剂→振荡→收集提取液→活性炭处理→过滤去除活性炭→蒸馏(含回收溶剂)→重结晶→成品。回答下列问题：
(1)在提取物质W时，最好应选用的一种原料是_______(填“高温烘干”“晾干”或“新鲜”)的植物甲，不宜选用其他两种的原因是_______________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)提取物质W时，振荡的作用是__________________。
(3)活性炭具有很强的吸附能力，在提取过程中，用活性炭处理提取液的目的是__________________________。
(4)现有丙酮(沸点56 ℃)、乙醇(沸点约78 ℃)两种溶剂，在提取物质W时，应选用丙酮作为提取剂，理由是________________________________。
(5)该实验操作过程中应注意的事项是________________________________________(答出两点即可)。
解析：(1)依据题干信息，物质W受热、受潮易分解，因此不宜选择高温烘干，而新鲜的植物甲含水量高，用于提取的极性有机溶剂会被水稀释，进而降低对物质W的提取效果，故不应选用新鲜的植物甲。(2)提取物质W时，振荡可以使原料和所加有机溶剂充分混匀。(3)利用活性炭的吸附能力，可以去除提取液中植物甲所含的色素，从而得到较为纯净的物质W与有机溶剂的混合物。(4)丙酮沸点低于乙醇，蒸馏时物质W分解较少。(5)物质W容易受热分解，因此蒸馏操作适宜在较低的温度下进行，同时因实验中使用了有机溶剂，要注意防火。
答案：(1)晾干　高温烘干过程中，植物甲中的物质W易被破坏；新鲜的植物甲含水量高，用于提取的极性有机溶剂会被水稀释，进而降低对物质W的提取效果　(2)使原料和溶剂充分混匀　(3)去除提取液中的色素
(4)丙酮沸点低于乙醇，蒸馏时物质W分解较少
(5)在温度较低的情况下操作，防火
[重难点拨]
植物有效成分提取方法归纳
提取方法
方法步骤
适用范围
水蒸气蒸馏
水蒸气蒸馏→分离油层→除水过滤
适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油
压榨
石灰水浸泡→漂洗→压榨、过滤、静置→再次过滤
适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取
有机溶剂萃取
粉碎、干燥→萃取、过滤→浓缩
适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能细小，能充分浸泡在有机溶剂中

命题点(二)　胡萝卜素的提取
2．(2015·全国卷Ⅱ)回答与胡萝卜素有关的问题：
(1)胡萝卜含有的胡萝卜素中，最主要的是______________(填“α­胡萝卜素”“β­胡萝卜素”或“γ­胡萝卜素”)，该胡萝卜素在人体内可以转变成两分子____________，后者缺乏会引起人在弱光下视物不清的病症，该疾病称为________，胡萝卜素是________(填“挥发性”或“非挥发性”)物质。
(2)工业生产上，用养殖的岩藻作为原料提取胡萝卜素时，________(填“需要”或“不需要”)将新鲜的岩藻干燥。
(3)现有乙醇和乙酸乙酯两种溶剂，应选用其中的________作为胡萝卜素的萃取剂，不选用另外一种的理由是________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)胡萝卜含有的胡萝卜素有三类，其中最主要的是β­胡萝卜素，β­胡萝卜素在人体内可以转变成维生素A，维生素A缺乏会导致夜盲症。胡萝卜素是非挥发性物质。(2)胡萝卜素的提取一般采用萃取法，萃取前需要对材料进行干燥处理，以提高萃取的效率。(3)萃取胡萝卜素的有机溶剂应该具有很高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶，如乙酸乙酯。乙醇是水溶性有机溶剂，因萃取过程中能与水混溶而影响萃取效果，所以不用它作萃取剂。
答案：(1)β­胡萝卜素　维生素A　夜盲症　非挥发性
(2)需要　(3)乙酸乙酯　萃取胡萝卜素的有机溶剂应不与水混溶，而乙醇为水溶性有机溶剂(其他合理答案也可)
[重难点拨]
影响胡萝卜素萃取的因素及解决措施
影响因素
解决措施
萃取剂的性质
用水不溶性有机溶剂
原料的颗粒大小、紧密程度
粉碎
材料的含水量
干燥
萃取温度
探索最佳萃取温度，严格控制温度
萃取时间
适当延长萃取时间


[真题集训——验能力]
1．(2015·广东高考)关于DNA的实验，叙述正确的是(　　)
A．用兔的成熟红细胞可提取DNA
B．PCR的每个循环一般依次经过变性—延伸—复性三步
C．DNA溶液与二苯胺试剂混合，沸水浴后生成蓝色产物
D．用甲基绿对人的口腔上皮细胞染色，细胞核呈绿色，细胞质呈红色
解析：选C　兔属于哺乳动物，其成熟的红细胞中无细胞核，不适合作为提取DNA的材料。PCR技术的每个循环一般依次经过变性—复性—延伸三步。DNA溶液在沸水浴条件下，遇二苯胺呈蓝色。用甲基绿吡罗红混合染色剂对细胞进行染色时，细胞核(含DNA)呈绿色，细胞质(含RNA)呈红色，仅用甲基绿无法对细胞质进行染色。
2．(2013·江苏高考)某同学用洋葱进行DNA粗提取和鉴定实验，操作错误的是 (　　)
A．加入洗涤剂后用力进行快速、充分的研磨
B．用蛋白酶纯化过滤后的研磨液中的DNA
C．加入酒精后用玻璃棒轻缓搅拌
D．加二苯胺试剂摇匀后沸水浴加热
解析：选A　加入洗涤剂后研磨动作要轻缓、柔和，否则会产生许多泡沫，不利于后续步骤的操作；蛋白酶能够分解蛋白质，因此能起到纯化DNA的目的；加入酒精后用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免引起DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀；DNA可与二苯胺试剂在沸水浴条件下作用显蓝色。
3．(2014·山东高考节选)玉米是重要的粮食作物，经深加工可生产酒精、玉米胚芽油和果糖等。流程如下：

(1)玉米秸秆中的纤维素经充分水解后的产物可被酵母菌利用发酵生产酒精。培养酵母菌时，该水解产物为酵母菌的生长提供________。发酵过程中检测酵母菌数量可采用______________法或稀释涂布平板法计数。
(2)玉米胚芽油不易挥发，宜选用________法或______法从玉米胚芽中提取。
解析：(1)纤维素的水解产物是葡萄糖，可为酵母菌提供碳源。发酵过程中可用显微镜直接计数法对酵母菌进行计数。(2)玉米胚芽油不易挥发，不能利用蒸馏法提取，可利用萃取法或压榨法提取。
答案：(1)碳源　显微镜直接计数　(2)压榨　萃取

[课下检测——查缺漏]
一、基础题点练
1．下列是提取植物芳香油时所选取的原料及提取方法的对应关系，其中错误的是(　　)
选项
原料
提取精油的名称
提取方法
A
玫瑰花
玫瑰精油
压榨法
B
橘皮
橘皮精油
压榨法
C
茉莉花
茉莉油
蒸馏法
D
薄荷叶
薄荷油
蒸馏法
解析：选A　蒸馏法一般适用于提取玫瑰精油、薄荷油、茉莉油等芳香油；压榨法一般适用于橘皮精油、柠檬芳香油等的提取。
2．在植物有效成分的提取过程中，常用萃取法、蒸馏法和压榨法，下列关于这三种方法的叙述错误的是(　　)
A．蒸馏法和萃取法都需要水浴加热
B．压榨法适用于易焦糊原料的提取，如柑橘、柠檬等
C．萃取法适用范围较广，一般来说，原料颗粒小、萃取温度高、时间长，萃取效果好
D．蒸馏法适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油
解析：选A　蒸馏法适用于提取挥发性强的芳香油，其操作过程中不需要水浴加热，萃取法需要水浴加热。压榨法适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取。萃取法适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能细小，能充分浸泡在有机溶剂中。
3．胡萝卜素可用于治疗因缺乏维生素A而引起的各种疾病，下图是提取胡萝卜素的实验流程示意图，相关说法正确的是(　　)

A．图中干燥处理时的温度越高、时间越长越利于胡萝卜素提取
B．图中甲过程表示萃取，此过程用到的有机溶剂具有较低的沸点
C．图中乙过程表示浓缩，浓缩之前进行过滤的目的是除去萃取液中的不溶物
D．只能从植物中提取天然β­胡萝卜素
解析：选C　新鲜胡萝卜素含大量水分，提取时应干燥，但要控制干燥时间和温度，若温度太高、干燥时间太长会导致胡萝卜素分解。图中甲是萃取，所用萃取剂应具有较高的沸点，并能充分溶解胡萝卜素。工业生产上，β­胡萝卜素的提取方法主要有三种：一是从植物中提取，二是从岩藻中获得，三是利用微生物的发酵生产。
4．在DNA粗提取与鉴定实验中，将第三次过滤获得的纱布上含有的DNA的黏稠物(含有较多杂质)分别处理如下：
序号
操作过程
①
放入2 mol/L的NaCl溶液，搅拌后过滤
②
再加0.14 mol/L的NaCl溶液，搅拌后过滤
③
再加入冷却的、同体积的95%酒精溶液，用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物

上述操作过程正确的是(　　)
A．①②　　　　　　　 B．①②③
C．①③ D．②③
解析：选C　第三次过滤后在纱布上的是粗提取的DNA样品，此样品还含有杂质，因此将其溶于2 mol/L的NaCl溶液中，再进行过滤，以除去不溶于2 mol/L的NaCl溶液的杂质。然后向滤液中加入同体积的、冷却的95%酒精即可析出DNA，最后挑出DNA进行鉴定。
5．某同学设计的提取玫瑰精油的实验流程如图所示，据图分析错误的是(　　)
→→→→→
A．在第二步中使用水气蒸馏更简便易行
B．在操作时可向蒸馏烧瓶中加入几片碎瓷片防止暴沸
C．提取精油时，向混合物中加入NaCl更利于油水分层
D．加入无水Na2SO4，再用过滤法可除去分离的油层中的水分
解析：选A　由于玫瑰精油难溶于水，易溶于有机溶剂，因此在第二步中使用水中蒸馏更简便易行；在操作时可向蒸馏烧瓶中加入几片碎瓷片，目的是防止暴沸；提取精油时，为了促进油水分层，要向油水混合物中加入NaCl；分离的油层还含有一定的水分，需加入无水Na2SO4，再用过滤方法将其除去。
二、高考题型练
6．植物芳香油具有抗菌、促进细胞新陈代谢及细胞再生功能，而某些芳香油能调节人体的生理及心理活动。请回答下列问题：
(1)植物芳香油的提取可采用的方法有________、________和________。
(2)玫瑰精油被称为“液体黄金”，多用于制造高级香水等化妆品。提取出的玫瑰精油不含有任何添加剂或化学原料，主要是通过________法提取。蒸馏时收集的蒸馏液不是纯玫瑰精油，原因是______________________________________________________________。
(3)用压榨法提取柚皮精油，得到的糊状液体可通过______除去其中的固体杂质。
(4)从胡萝卜中提取胡萝卜素时，干燥过程应控制好温度和________以防止胡萝卜素分解；萃取过程中宜采用______方式加热以防止温度过高。常用________法鉴定所提取的胡萝卜素。
解析：(1)蒸馏法、萃取法、压榨法是常用的提取植物芳香油的方法。(2)玫瑰精油的化学性质稳定，难溶于水，易溶于有机溶剂，可通过水蒸气蒸馏法提取；蒸馏法提取玫瑰精油的过程中玫瑰精油随水蒸气一起蒸馏出来，所收集的蒸馏液不是纯玫瑰精油而是油水混合物，要得到较纯的玫瑰精油还需将玫瑰油和水分开。(3)采用压榨法提取芳香油时获得的糊状液体，可先用普通布袋过滤除去固体残渣。(4)胡萝卜素不是很稳定，温度过高、干燥时间过长会导致其分解，所以在提取胡萝卜素时，干燥过程应控制好温度和时间以防止胡萝卜素分解；萃取剂一般属于易燃、易爆物，所以萃取过程中宜采用水浴方式加热以防止温度过高；常用纸层析法鉴定所提取的胡萝卜素。
答案：(1)蒸馏法　萃取法　压榨法　(2)水蒸气蒸馏　玫瑰精油随水蒸气一起蒸馏出来，所得到的是油水混合物　(3)过滤　(4)时间　水浴　纸层析
7．下列是与芳香油提取相关的问题，请回答：
(1)玫瑰精油适合用水蒸气蒸馏法提取，其理由是玫瑰精油具有______________________________________的性质。蒸馏时收集的蒸馏液__________(填“是”或“不是”)纯的玫瑰精油，原因是__________________________________________。
(2)当蒸馏瓶中的水和原料量一定时，蒸馏过程中，影响精油提取量的主要因素有蒸馏时间和_______________。当原料量等其他条件一定时，提取量随蒸馏时间的变化趋势是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)如果蒸馏过程中不进行冷却，则精油提取量会________，原因是________________________________________________________________________。
(4)密封不严的瓶装玫瑰精油保存时最好存放在温度________的地方，目的是________________。
(5)某植物花中精油的相对含量随花的不同生长发育时期的变化趋势如图所示。提取精油时采摘花的最合适时间为________d左右。

(6)从薄荷叶中提取薄荷油时________(填“能”或“不能”)采用从玫瑰花中提取玫瑰精油的方法，理由是_________________________________________________________
________________________。
解析：(1)水蒸气蒸馏法的原理是利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后，混合物又会重新分出油层和水层。玫瑰精油具有易挥发、难溶于水、化学性质稳定等性质，故适合用水蒸气蒸馏法提取，收集的蒸馏液为油水混合物。(2)蒸馏时许多因素都会影响产品的品质，如蒸馏温度、时间等。在一定范围内随着蒸馏时间的延长，精油的提取量会增加，但因原料量等条件一定，故超过一定时间后，提取量不再增加。(3)蒸馏过程中要进行冷却，让混合物重新分出油层和水层。若不冷却则会有部分玫瑰精油随水蒸气挥发而流失，使精油提取量下降。(4)因玫瑰精油易挥发，故密封不严的瓶装玫瑰精油应存放在温度较低的地方，以减少玫瑰精油的挥发。(5)提取精油时采摘花的最适时间为花中精油的相对含量最高的时间，即a d左右。(6)因薄荷油与玫瑰精油的化学性质相似：易挥发、难溶于水等，故也可用与玫瑰精油相同的方法提取。
答案：(1)易挥发、难溶于水、化学性质稳定　不是　玫瑰精油随水蒸气一起蒸馏出来，所得到的是油水混合物
(2)蒸馏温度　在一定的时间内提取量随蒸馏时间的延长而增加，一定时间后提取量不再增加
(3)下降　部分精油会随水蒸气挥发而流失
(4)较低　减少挥发　(5)a
(6)能　薄荷油与玫瑰精油的化学性质相似
8．(2017·洛阳三模)某校高中生物兴趣小组开展了针对洛阳牡丹产品开发的课题研究。下面是他们课题研究的几个方向。请分析回答：
(1)牡丹花精油的提取过程：鲜牡丹花＋清水→________→油水混合物→________→除水→牡丹花精油。要提高精油的品质，在操作中需要通过控制温度来实现____________的目的。
(2)牡丹籽油的提取：牡丹籽中含油率在20%～30%之间，不易挥发，可以采取________和________的方法进行提取。
(3)根据胡萝卜素______________的特点，常采用萃取的方法来提取。操作时，要采用沸点高的萃取剂，目的是________________。
解析：(1)牡丹花精油的提取过程：鲜牡丹花＋清水→水蒸气蒸馏→油水混合物→分离油层→除水→牡丹花精油。要提高精油的品质，在操作中需要通过控制温度来实现延长蒸馏时间的目的。(2)牡丹籽中含油率在20%～30%之间，牡丹籽油不易挥发，可以采取压榨和萃取的方法进行提取。(3)胡萝卜素易溶于石油醚等有机溶剂，所以一般采用萃取的方法来提取；操作时，要采用沸点高的萃取剂，目的是充分溶解胡萝卜素，并不与水混溶。
答案：(1)水蒸气蒸馏　分离油层　延长蒸馏时间　(2)压榨　萃取　(3)易溶于石油醚等有机溶剂　充分溶解胡萝卜素，并不与水混溶
9．(2017·衡阳二模)已知青蒿素为无色针状晶体，易溶于有机溶剂，不易挥发；而玫瑰精油化学性质稳定，难溶于水，易溶于有机溶剂，易挥发。根据生物相关知识，回答下列问题：
(1)从黄花蒿中提取青蒿素时，应采用萃取法，理由是____________________________________；并且通常在提取前将黄花蒿茎叶进行________和干燥，以提高效率；干燥过程应控制好____________和时间，以防止青蒿素分解。
(2)提取过程中宜采用水浴加热以防止燃烧、爆炸；所得液体浓缩前需进行________。
(3)玫瑰精油化学性质稳定，难溶于水，易溶于有机溶剂，简便易行的提取方法是水蒸气蒸馏中的__________法，在提取过程中分别加入NaCl(目的是__________________)、Na2SO4；要提高玫瑰精油的产品质量，应采用的措施是____________________。
解析：(1)青蒿素为非挥发性物质，不能随水蒸气蒸馏出，但易溶于有机溶剂，所以从黄花蒿中提取青蒿素时，应采用萃取法；为提高效率，在用萃取法提取青蒿素前，通常将黄花蒿茎叶进行粉碎和干燥处理；干燥过程应控制好温度和时间，以防止青蒿素分解。(2)提取过程中所得的液体浓缩前需进行过滤。(3)玫瑰精油化学性质稳定，难溶于水，易溶于有机溶剂，常用水蒸气蒸馏中的水中蒸馏法提取；为增加水的比重，使油水分层，可在提取过程中加入NaCl；要提高玫瑰精油的产品质量，应严格控制蒸馏温度，延长蒸馏时间。
答案：(1)青蒿素为非挥发性物质，不能随水蒸气蒸馏出，但易溶于有机溶剂　粉碎　温度　(2)过滤　(3)水中蒸馏　增加水的比重，使油水分层　(严格控制蒸馏温度)延长蒸馏时间
10．(2017·郑州三模)胡萝卜素是一种常用的备用色素，可分别从胡萝卜或产生胡萝卜素的微生物体中提取获得。请回答下列问题：
(1)胡萝卜素有易溶于有机溶剂的特点，可选用________(填“乙醇”或“乙酸乙酯”)作为胡萝卜素的萃取剂，不选用另外一种的理由是______________________________
________________________________________________________________________。
(2)碳源的种类对β­胡萝卜素的产量有着一定的影响，有关研究结果如下：
碳源
麦芽糖
蔗糖
淀粉
β­胡萝卜素含量(mg/L)
3.52
4.81
1.68
据表分析，最佳碳源是________。若要进一步探究最佳氮源，请简要写出实验设计思路：________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)有科研人员尝试利用紫外线处理红酵母，以获得高产菌株，使用这种育种方法的优点是________________________________________________。经定量分析后，若得到高产菌株，要对其进行长期保存，可采用__________的方法在－20 ℃的冷冻箱中保存。
解析：(1)胡萝卜素易溶于有机溶剂，但不溶于水，可用萃取法提取。用于萃取胡萝卜素的有机溶剂应有较高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，且不与水混溶，而乙醇是水溶性有机溶剂，萃取中能与水混溶而影响萃取效果，所以乙醇不能用于胡萝卜素的萃取。乙酸乙酯不能与水混溶，可作为提取胡萝卜素的萃取剂。(2)表中信息显示：以蔗糖为碳源的实验组，其β­胡萝卜素含量高于以麦芽糖和淀粉为碳源的实验组，因此最佳碳源是蔗糖。若要进一步探究最佳氮源，其自变量是不同的氮源，因变量是β­胡萝卜素含量，碳源等无关变量应控制相同且适宜，据此可推知其实验设计思路为：以蔗糖为碳源，分别用不同氮源进行实验，检测并比较β­胡萝卜素含量。(3)利用紫外线处理红酵母，以获得高产菌株，这种育种方法为人工诱变育种，诱变育种的优点是可以提高突变率，在较短时间内获得更多的变异类型。若要对得到的高产菌株进行长期保存，可采用甘油管藏的方法在－20 ℃的冷冻箱中保存。
答案：(1)乙酸乙酯　萃取胡萝卜素的有机溶剂应不与水混溶，而乙醇属于水溶性有机溶剂，影响萃取效果　(2)蔗糖　以蔗糖为碳源，分别用不同氮源进行实验，检测并比较β­胡萝卜素含量　(3)可以提高突变率，在较短时间内获得更多的变异类型　甘油管藏
11．(2017·南昌二模)请回答下列有关胡萝卜素提取的问题：
(1)从植物中提取胡萝卜素常用的方法是________，所用溶剂具有__________________________________的特点。
(2)萃取前，要将胡萝卜进行粉碎和干燥，新鲜的胡萝卜干燥处理时要注意控制____________。
(3)因为有机溶剂易燃，萃取时应采用__________方式加热。为了防止加热时有机溶剂挥发，还要在加热瓶口安装__________装置，而萃取液可进一步用蒸馏装置进行__________处理。
(4)鉴定胡萝卜素粗品的方法是__________________。在18 cm×30 cm滤纸下端距底边2 cm处做一基线，在基线上取A、B、C、D四点，用最细的注射器针头分别吸取0.1～0.4 mL溶解在石油醚中的________样品和提取样品，在A、D和B、C点上点样。点样液挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，置于装有1 cm深的石油醚的密封玻璃瓶中进行层析。
解析：(1)从植物中提取胡萝卜素常用的方法是萃取法，用于萃取胡萝卜素的萃取剂应具有较高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，且不与水混溶的特点。(2)新鲜的胡萝卜含有大量的水分，在干燥处理时要注意控制温度和时间，温度太高、干燥时间太长会导致胡萝卜素分解。(3)萃取剂为有机溶剂，有机溶剂易燃，因此萃取时应采用水浴方式加热。为了防止加热时有机溶剂挥发，还要在加热瓶口安装回流冷凝装置，而萃取液可直接使用蒸馏装置进行浓缩处理。(4)鉴定胡萝卜素粗品的方法是纸层析法。在18 cm×30 cm滤纸下端距底边2 cm处做一基线，在基线上取A、B、C、D四点，用最细的注射器针头分别吸取0.1～0.4 mL溶解在石油醚中的标准样品和提取样品，在A、D和B、C点上点样。点样液挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，置于装有1 cm深的石油醚的密封玻璃瓶中进行层析。
答案：(1)萃取法　较高的沸点，能充分溶解胡萝卜素，且不与水混溶　(2)温度和时间　(3)水浴　回流冷凝(冷凝管)　浓缩　(4)纸层析法　标准
12．(2013·山东高考)胡萝卜素是一种常用的食用色素，可分别从胡萝卜或产胡萝卜素的微生物菌体中提取获得，流程如下：

(1)筛选产胡萝卜素的酵母菌R时，可选用____________或平板划线法接种。采用平板划线法接种时需先灼烧接种环，其目的是________________________。
(2)培养酵母菌R时，培养基中的蔗糖和硝酸盐可分别为酵母菌R的生长提供________和________。
(3)从胡萝卜中提取胡萝卜素时，干燥过程应控制好温度和________以防止胡萝卜素分解；萃取过程中宜采用________方式加热以防止温度过高；萃取液浓缩前需进行过滤，其目的是________________________________________________________________________。
(4)纸层析法可用于鉴定所提取的胡萝卜素。鉴定过程中需用胡萝卜素标准品作为________。
解析：(1)接种微生物的方法主要是稀释涂布平板法和平板划线法；为了避免杂菌的污染，接种过程中要进行无菌操作，如对接种环进行灼烧处理。(2)蔗糖可作为碳源，硝酸盐含有氮元素，可作为氮源。(3)温度过高、干燥时间过长会导致胡萝卜素分解；由于萃取剂都是易燃物，直接使用明火加热易引起燃烧、爆炸，故应采用水浴加热。(4)鉴定胡萝卜素时，胡萝卜素标准样品主要起一个对照的作用。
答案：(1)稀释涂布平板法　灭菌(或防止杂菌污染)　
(2)碳源　氮源　(3)时间　水浴　滤去不溶物　
(4)(实验)对照