2020版高考一轮复习生物新课改省份专用讲义：第十二单元 第一讲 发酵工程

第一讲发酵工程
第1课时　微生物的培养与应用
考点一　培养基及微生物的纯化培养技术

一、培养基
1．概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。
2．种类
(1)按物理状态可分为液体培养基和固体培养基。
(2)按功能可分为选择培养基和鉴别培养基。
3．成分：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
二、无菌技术
1．关键：防止外来杂菌的入侵。
2．常用方法
项目
理化因素的作用强度
能否消灭芽孢和孢子
常用方法
消毒
较为温和
不能
煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法
灭菌
强烈
能
灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌

三、大肠杆菌的纯化培养
1．制备固体培养基的步骤
→→→→
2．纯化大肠杆菌：最常用的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法。
3．菌种的保存
(1)对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。
(2)对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
[基础自测]
1．判断下列叙述的正误
(1)斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株(×)
(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上(×)
(3)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落(×)
(4)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质(√)
(5)由于物理状态的不同，培养基只有液体培养基和固体培养基两种类型(×)
(6)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害(√)
(7)无菌操作的对象只要是没有生物活性的材料(如培养基、接种环等)都可采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌(×)
(8)配制培养基时应先灭菌再调pH(×)
(9)平板划线法中每一次划线后要将接种环灼烧(√)
(10)用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落(√)
2．连线无菌技术的常用方法及适用对象

3．据某微生物培养基的配方表回答下列问题
编号
①
②
③
④
⑤
成分
(NH4)2SO4
KH2PO4
FeSO4
CaCl2
H2O
含量
0.4 g
4.0 g
0.5 g
0.5 g
100 mL

(1)此培养基按物理性质划分属于液体培养基，因为没有凝固剂(如琼脂)；按功能划分属于选择培养基，因为没有碳源，只有自养型微生物才能生长(利用空气中的CO2)。
(2)此培养基含有的微生物的营养成分包括水、无机盐和氮源三类，若加入氨基酸，则它可充当的营养成分包括碳源、氮源和生长因子。
(3)若要观察微生物的菌落特征，培养基中应添加的成分是凝固剂(琼脂)。
(4)若用该培养基来分离尿素分解菌，应除去表中成分(填表中序号)，加入尿素和不含氮元素的有机物。
4．下图是倒平板的操作，请据图填空

(1)请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：丙→乙→甲→丁。
(2)甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。
(3)丁中的操作需要等待平板冷却凝固后才能进行。
5．学透教材、理清原因、规范答题用语专练

(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是________________、______________。
(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象。________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案：(1)稀释涂布平板法　平板划线法　(2)最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灭菌。采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灭菌

1.培养基的配制原则
(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
(3)pH要适宜：细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需的pH不同。
2．消毒与灭菌的比较

条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部的部分微生物
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药剂
消毒法
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属用具
高压蒸汽
灭菌法
培养基及容器

3．平板划线法和稀释涂布平板法的区别
比较项目
平板划线法
稀释涂布平板法
关键操作
接种环在固体培养基表面连续划线
①一系列的梯度稀释
②涂布平板操作
注意事项
每次划线前后均需灼烧接种环
稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围
菌体获取
在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
适用范围
适用于好氧菌
适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
优点
可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落
既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数
缺点
不能对微生物计数
操作复杂，需要涂布多个平板

4．平板划线操作的注意事项
(1)灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
(3)划线时最后一区不要与第一区相连。
(4)划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
(5)操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如下表：

第一次操作
每次划线之前
划线结束
目的
杀死接种环上原有的微生物
杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少
杀死接种环上残存的菌种，避免微生物污染环境和感染操作者

[对点落实]
1．(2018·全国卷Ⅱ)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是_______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能________________。在照射前，适量喷洒________，可强化消毒效果。
(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是______________________________________________________
____________________________。
解析：(1)干热灭菌是指将物品放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃条件下加热1～2 h。能耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等，可采用干热灭菌的方法。(2)巴氏消毒法是在70～75 ℃条件下煮30 min 或在80 ℃条件下煮15 min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养物质损失较少；高温瞬时消毒也能起到同样的效果。(3)接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30 min，紫外线能破坏微生物的DNA结构，从而杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以强化消毒效果。(4)自来水通常是用氯气进行消毒的。(5)在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是锅内原有的冷空气没有排尽。
答案：(1)可以　(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少　(3)破坏DNA结构　消毒液　(4)氯气　(5)未将锅内冷空气排尽
2．大肠杆菌是寄生于人和动物肠道中的细菌，其代谢产物能与染料伊红美蓝反应，使菌落呈黑色。如表是其培养基配方：
成分
蛋白胨
乳糖
磷酸二氢钾
琼脂
蒸馏水
2%伊红水溶液
0.5%美蓝水溶液
含量
10 g
10 g
2 g
20～30 g
1 000 mL
20 mL
13 mL

回答下列问题：
(1)该培养基中，蛋白胨为大肠杆菌提供的主要营养有____________和维生素。从物理性质来看，该培养基属于____________培养基。
(2)对该培养基进行灭菌时，可采用____________法。在接种大肠杆菌前，需先将灭菌后的空白培养基放在恒温箱中培养一段时间，观察是否有菌落生成，其目的是________________________________。
(3)为检测严重污染水体中大肠杆菌数量，将水样适当稀释后，取样涂布在上述平板培养基中，应选择颜色为________的菌落进行计数。该方法是通过统计平板上的菌落数来推测样品中的活菌数，其原理是________________________________________。
解析：(1)该培养基中，蛋白胨为大肠杆菌提供的主要营养有碳源、氮源和维生素。从物理性质来看，该培养基加入了琼脂作为凝固剂，因此属于固体培养基。(2)对该培养基进行灭菌时，可采用高压蒸汽灭菌法。在接种大肠杆菌前，需先将灭菌后的空白培养基放在恒温箱中培养一段时间，观察是否有菌落生成，其目的是检测培养基制备是否合格(灭菌是否彻底)。(3)大肠杆菌的代谢产物能与染料伊红美蓝反应，使菌落呈现黑色。为检测严重污染水体中大肠杆菌数量，将水样适当稀释后，取样涂布在上述平板培养基中，应选择颜色为黑色的菌落进行计数。通过统计平板上的菌落数来推测样品中的活菌数的原理是当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。
答案：(1)碳源、氮源　固体　(2)高压蒸汽灭菌　检测培养基制备是否合格(灭菌是否彻底)　(3)黑色　当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌
3．(2017·江苏高考)苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据如图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：

(1)酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有____________。
(2)将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐________，以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步____________，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加________。

(3)右图为连续划线法示意图，在图中____________(填图中序号)区域更易获得单菌落。
(4)采用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5号比色管的苯酚浓度应分别为________________________。
管号
1
2
3
4
5
6
苯酚浓度(mg/L)





1
如果废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释______(填序号：①5　②10　③20)倍后，再进行比色。
解析：(1)富集培养基中蛋白胨、苯酚都是含碳的有机物，可作为碳源。(2)欲富集酚降解菌，随转接次数的增加，应逐渐增加培养基中苯酚的含量；若接种培养后平板上菌落过于密集，则应进一步稀释后再进行涂布，以降低平板上菌落密度，便于菌落计数与分离；平板培养基是固体培养基，除含有水、营养物质(碳源、氮源、无机盐等)外，还需添加琼脂作为凝固剂。(3)利用连续划线法接种时，最后的划线区域(③)中，菌体的密度较小，容易获得单菌落。(4)因系列浓度梯度中6号比色管中苯酚浓度为1 mg/L，故1～5号比色管中的苯酚浓度应分别为0 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L；根据题意，废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，要使稀释后的苯酚残留液浓度介于0～1 mg/L，需将残留液稀释20倍左右。
答案：(1)蛋白胨、苯酚　(2)增加　稀释涂布　凝固剂　(3)③　(4)0、0.2、0.4、0.6、0.8　③
考点二　微生物的筛选与计数

一、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．筛选菌株的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2．统计菌落数目的方法：稀释涂布平板法和显微镜直接计数法。
3．实验流程
―→―→―→―→
4．尿素分解菌的鉴定
(1)原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为，使培养基的碱性增强。
(2)方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
二、分解纤维素的微生物的分离
1．纤维素酶
(1)组成：纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。
(2)作用：
纤维素纤维二糖葡萄糖苷酶,葡萄糖
2．纤维素分解菌的筛选
(1)原理：

(2)方法：刚果红染色法

3．实验流程

[基础自测]
1．判断下列叙述的正误
(1)纤维素酶只包括三种组分：C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶(×)
(2)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类(×)
(3)对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法(×)
(4)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素(√)
(5)筛选分解尿素的细菌应以尿素作为培养基中的唯一氮源(√)
(6)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低(×)
(7)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则说明筛选到分解尿素的细菌(×)
(8)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌(×)
(9)刚果红染色法只能在培养微生物的时候加入刚果红(×)
(10)在筛选能分解纤维素的细菌的实验中，选择培养的目的是增大样品中目的菌株的浓度(√)
2．学透教材、理清原因、规范答题用语专练
据某微生物培养基的配方表回答下列问题


成分
纤维素粉
NaNO3
Na2HPO4·7H2O
KH2PO4
含量
5 g
1 g
1.2 g
0.9 g

成分
MgSO4·7H2O
KCl
酵母膏
水解酪素
含量
0.5 g
0.5 g
0.5 g
0.5 g
将上述成分溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL

(1)该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？
提示：具有选择作用。纤维素为唯一碳源，只有能分解纤维素的微生物才能生长繁殖，而不能分解纤维素的微生物被抑制。
(2)你能否设计一个对照实验，说明选择培养的作用？
提示：用接种了的完全培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)作为对照。
(3)如果用该培养基来鉴别纤维素分解菌，需要加入的成分有哪些？
提示：需要加入的成分有凝固剂(琼脂)和染色剂(刚果红)。

1．两种微生物计数方法的比较

间接计数法
(稀释涂布平板法)
直接计数法
(显微计数法)
原理
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
公式
每克样品中的菌落数＝×M
C：某稀释度下平板上生长的平均菌落数；V：涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)；M：稀释倍数
每毫升原液所含细菌数：每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点
当两个或多个菌体连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
不能区分细胞死活
结果
比实际值偏小
比实际值偏大

2．微生物的筛选与鉴别方法
(1)微生物的筛选方法
单菌落挑取法
利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面，直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物
选择培养法
利用选择培养基对微生物进行选择培养，直接获得目的微生物
鉴定培养法
利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征，然后筛选目的微生物

(2)微生物的鉴别方法
菌落特征鉴别法
根据微生物在固体培养基表面形成的菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等特征进行鉴别
指示剂鉴别法
如培养基中加入酚红指示剂，培养某种微生物后，培养基变红说明该种微生物能够分解尿素
染色鉴别法
如利用刚果红染色法，根据培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈来筛选分解纤维素的微生物

[对点落实]
1．(2018·全国卷Ⅰ)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：
(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制________的生长，加入了链霉素的培养基属于________培养基。
(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有__________________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有________________(答出两点即可)。
(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是________，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：
甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；
乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。
有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)链霉素是抗生素，可抑制细菌生长，故在M培养基中加入链霉素作为选择培养基，可筛选出真菌。(2)培养基中的营养成分一般包括碳源、氮源、水和无机盐等。细胞中含有氮元素的生物大分子有蛋白质、核酸等，故加入的氮源可参与以上物质的合成。(3)能产生淀粉酶的微生物可将淀粉水解成麦芽糖，淀粉遇碘液变蓝，向加有淀粉的培养基中加入碘液后培养基呈现蓝色，产淀粉酶的菌落周围的淀粉被水解，形成透明圈，可根据透明圈的大小判断产生淀粉酶的量及活力。(4)统计菌落数时，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，甲同学统计的3个平板中的菌落数在正常范围内且差距不大，比较准确；乙同学统计的3个平板中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差。
答案：(1)细菌　选择　(2)碳源、无机盐　蛋白质、核酸　(3)碘液　淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈　(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差
2．在白酒发酵的窖池中，当培养液的pH≤4.5时，酵母菌的代谢活动逐渐受到抑制，甚至停止。耐酸性酵母菌能在pH≤3.5的环境下继续表现出较强发酵能力，适宜作白酒发酵生产用菌种，为选育适合白酒生产的耐酸性强的酵母菌，研究者进行了相关实验，请回答下列有关问题：
(1)在发酵过程中，窖池中培养液的pH会逐渐下降，原因是
________________________________________________________________________。
(2)通过如图所示________________法进行菌种纯化培养，取最终的酵母菌稀释液0.1 mL滴在培养基上进行涂布，要将涂布器________________后才能进行操作。在恒温培养箱中培养一段时间后，其中某组的3个平板上菌落数分别为99个、92个、94个，则可以推测酵母菌液中每毫升含菌数为________个。运用这种方法统计的结果往往较实际值偏小，原因是________________________________________________________________。

(3)实验获得了三个耐酸性较强的酵母菌菌株，特点如表。
菌株
A
B
C
特点
pH≤3.5时，生长代谢正常、优于其他常规菌种
pH≤3.5时，生长代谢正常，pH为4～6时不正常
pH为2.5～6时，生长代谢正常、优于其他常规菌种

依据菌株特点，研究者认为________菌株更适合作为白酒发酵菌株，做出这一判断的理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)酵母菌呼吸作用产生的二氧化碳溶于水，使溶液的pH降低。(2)图示纯化培养的方法为稀释涂布平板法；在培养基上进行涂布时，要将涂布器灼烧冷却后才能进行操作；根据图解可知菌液被稀释了106倍(M)，该稀释度下平板上生长的平均菌落数C＝(99＋92＋94)÷3＝95(个)，涂布平板时所用的稀释液的体积V＝0.1 mL，根据公式可知，酵母菌液中每毫升含菌数为(C÷V)×M＝(95÷0.1)×106＝9.5×108(个)；由于有的菌落可能是由两个或多个菌体形成的，所以运用这种方法统计的结果往往较实际值偏小。(3)根据表格分析可知，C菌对pH的耐受范围更大，发酵初期pH近中性，C菌株适合此环境，更易于形成优势菌群；发酵后期pH逐渐降低，C菌株依然能正常生长，所以C菌株更适合作为白酒发酵菌株。
答案：(1)无氧条件下，丙酮酸会被还原成酒精和二氧化碳
(2)稀释涂布平板　灼烧冷却　9.5×108　当两个或多个细胞连在一起时，平板上显示的只是一个菌落
(3)C　C菌株对pH的耐受范围更大，从发酵初期到后期pH逐渐降低的过程中，C菌株一直能正常生长
　[归纳拓展]
常用的选择培养基与鉴别培养基
类型
实例
选择培养基
培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
培养基中加入高浓度的食盐用于分离金黄色葡萄球菌
以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌
以纤维素作为唯一碳源的培养基用于分离纤维素分解菌
不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物
石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的
培养基放在高温环境中培养能得到耐高温的微生物
鉴别培养基
加入伊红美蓝可以鉴别大肠杆菌(菌落呈黑色)
加入酚红指示剂可以鉴别尿素分解菌
加入刚果红可以鉴别纤维素分解菌

　 　　　课堂一刻钟 研真题——知命题点·查薄弱点·清迷盲点
1．(2018·江苏高考)酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。下图所示为操作流程，请回答下列问题：

(1)配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的________，及时对培养基进行分装，并进行____________灭菌。
(2)取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约________(在25 ℃、50 ℃或80 ℃中选择)的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。
(3)挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线。下列叙述合理的有________。
a．为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌
b．划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落
c．挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量
d．可以通过逐步提高培养基中甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株
(4)步骤⑤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和_________供应。，将发酵液稀释1 000 倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用25×16型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，理论上　　　　色细胞的个数应不少于　　　　，才能达到每毫升3×109个活细胞的预期密度。
解题关键——技能应用
本小题考查利用血细胞计数板对微生物进行计数的技能。血细胞计数板统计的是酵母菌总数，但经台盼蓝染色后，活细胞不能被染色，可统计活酵母菌个数。若不明确原理，则不能准确回答问题。
解析：(1)配制培养基时，进行计算、称量、溶解、定容后，需先调pH再分装到锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌。(2)倒平板时的培养基温度约为50 ℃，冷凝后倒置培养。(3)平板划线时，接种针、接种环使用前和每次划线后都需要进行灼烧灭菌，以免造成杂菌污染；划线时不能划破培养基表面，否则不能形成正常菌落；挑取菌落时，应挑取多个不同的菌落，分别测定酵母细胞中蛋白质含量；逐步提高培养基中甲醇的浓度，能筛选出其中耐受高甲醇的菌株。(4)酵母菌是兼性厌氧型真菌，在有氧条件下可大量繁殖。酵母扩大培养时，需保证充足的营养和氧气等条件。由题中信息“经等体积台盼蓝染液染色”可知，计数室中培养液容积实际只有0.1÷2＝0.05 (mm3)。设5个中方格中无色(活细胞不能被台盼蓝染色)的细胞数目为x个，则3×109＝x/5×25×1 000×1 000÷0.05，解得x＝30(个)。
答案：(1)pH　高压蒸汽(湿热)　(2)50 ℃　(3)a、b、d
(4)氧气　无　30
2．(2017·全国卷Ⅰ)，
供植物吸收和利用。回答下列问题：
(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生__________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是__________________________________________。但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是______________________________________________(答出两点即可)。
(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是____________________________________________________。
(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________________(答出两点即可)。
能力解读——分析综合
本题考查微生物的分离和培养，要求考生结合培养基的基本成分、种类及功能，理解筛选分解尿素的细菌的原理。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　
解析：(1)土壤中的某些细菌之所以能够分解尿素，是因为它们能产生脲酶。尿素分解菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物，必须利用现成的有机物(如葡萄糖)作为碳源；葡萄糖通过呼吸作用被分解时，能为细胞生命活动提供能量，同时，葡萄糖还可以转化成脂肪、某些氨基酸等物质，所以进入细菌体内的葡萄糖能为其他有机物的合成提供原料。(2)选择培养基是只允许特定种类的微生物(目的微生物)生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。本实验的目的菌是可分解尿素的细菌，因此配制的培养基应只允许尿素分解菌生长，NH4NO3可以作为所有细菌的氮源，培养基中如含有NH4NO3，将不能起到筛选作用。(3)KH2PO4和Na2HPO4能为细菌生长提供钾盐、钠盐和磷酸盐，而H2PO/HPO可作为缓冲剂，使培养基中pH保持相对稳定。
答案：(1)脲酶　分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物　为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料　(2)尿素　其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用　(3)为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
3．(2016·四川高考)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。

(1)图中选择培养基应以________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。
(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是__________________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。
(3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，
解题关键——灵活迁移
本小题要迁移交汇到基因突变和基因表达的相关知识。利用必修的知识解答选修内容是高考常设置的命题形式。因此在复习时要多关注必修和选修内容的联系。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　
解析：(1)脲酶能够催化尿素水解释放出氨和二氧化碳，因此选择培养基中应以尿素为唯一氮源。挑取单菌落接种到加有酚红指示剂的鉴别培养基中，培养一段时间后，菌落周围的氨增加，pH升高，酚红指示剂将变红。(2)该过程采取的接种方法为稀释涂布平板法。利用稀释涂布平板计数法对细菌进行计数时，应选择菌落数在30～300的平板，因此平板上长出的细菌菌落平均数为(156＋178＋191)÷3＝175(个)。每克土壤样品中的细菌数为175÷0.1×105＝1.75×108(个)。血细胞计数板计数法能将死细胞计算在内，而稀释涂布平板计数法只能计数活细胞(只有活细胞才能在平板上生长)，故一般血细胞计数板计数法要比稀释涂布平板计数法的结果大。(3)箭头处插入70个核苷酸，箭头后密码子的解读方式为*AG，UGA，GAA……对比3种终止密码可发现，此处的终止密码为UGA。从起始密码到终止密码之前共有273＋72个碱基，因此突变基因表达的蛋白含115个氨基酸。
答案：(1)尿素　酚红　红　(2)稀释涂布平板法　1.75　少　(3)UGA　115
4．(2015·江苏高考)人工瘤胃模仿了牛羊等反刍动物的胃，可用来发酵处理秸秆，提高秸秆的营养价值。为了增强发酵效果，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素能力进行了研究。请回答下列问题：
(1)在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是________(填序号)。
①酒精灯　②培养皿　③显微镜　④无菌水
(2)在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是________________________________________________________________________
________________________。
(3)向试管内分装含琼脂的培养基时，若试管口粘附有培养基，需要用酒精棉球擦净的原因是________________________________________________________________________。

(4)刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。研究人员在刚果红培养基平板上，筛到了几株有透明降解圈的菌落(见右图)。图中降解圈大小与纤维素酶的____________有关。图中降解纤维素能力最强的菌株是________(填图中序号)。
(5)研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4，在不同温度和pH条件下进行发酵，，推测菌株________更适合用于人工瘤胃发酵，理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。

能力解读——读图能力
本题考查考生分析曲线获取信息的能力。在分析曲线时，应注意曲线的关键点和基本趋势，做到“读轴”、“明点”、“析线”。
解析：(1)在样品稀释和涂布平板过程中，需要在酒精灯火焰附近进行操作，涂布器在涂布前需在酒精灯上引燃灭菌；培养皿用于盛放培养基并培养细菌，无菌水做稀释的溶剂，此处唯一用不到的是显微镜。(2)在涂布平板时，要取少量菌悬液滴加到培养基表面，因为如果滴加菌悬液量过多，菌悬液就会堆积在培养基表面影响分离效果。(3)在向试管内分装含琼脂的培养基时，如果试管口粘附有培养基，就很容易使棉塞受到污染，因此，需要用无菌的酒精棉球将试管口擦拭干净。(4)因为刚果红可以与纤维素形成红色复合物，且不与纤维素降解产物反应。所以在刚果红培养基平板上，菌落周围有透明降解圈是纤维素被降解的结果，降解圈大小由纤维素酶的活性和量决定。图中菌落①周围的降解圈最大，因此其降解纤维素的能力最强。(5)考虑到人工瘤胃的发酵过程会使发酵液酸性增加，温度升高，在这个前提下观察在不同温度和pH条件下测得的发酵液中纤维素酶活性的结果图，从图中可以看出，在高温和低pH条件下都是J4菌株中的纤维素酶的活性较高，因而该菌株更适合用于人工瘤胃发酵。
答案：(1)③　(2)培养基表面的菌悬液会出现积液，导致菌体堆积，影响分离效果　(3)避免培养基污染棉塞　(4)量与活性　①　(5)J4　发酵过程会产热和产酸，J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高
[学情考情·了然于胸]
一、明考情·知能力——找准努力方向
考查知识
1.培养基的成分与配制、无菌技术、微生物的接种与培养等相关知识是常规考点，难度一般。
2.微生物分离与计数的原理及方法是高频考点，也是易错点。
考查能力
1.识记能力：主要考查对培养基的成分与配制、无菌技术、微生物的接种与培养等知识的记忆。
2.综合应用能力：如考查微生物的分离与计数等知识的理解与综合应用。
3.分析数据获取信息的能力。

二、记要点·背术语——汇总本节重点
(一)培养基及无菌技术
1．微生物培养基的成分一般包括水、无机盐、碳源、氮源及生长因子等。
2．制备固体培养基的步骤包括计算、称量、溶化、灭菌、倒平板等。
3．消毒指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
(二)微生物的分离与培养
1．纯化微生物常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。两种方法的异同：
(1)相同点：平板划线法和稀释涂布平板法都能获得单细胞菌落。
(2)不同点：平板划线法不能对微生物计数，而稀释涂布平板法能对微生物计数。
2．平板划线操作的三个易错点
(1)灼烧接种环之后，要冷却后再进行取种，以免温度太高杀死菌种。
(2)划线时最后一区域不要与第一区域相连。
(3)划线时用力要大小适当，防止用力过大将培养基划破。
3．接种后，在固体培养基上培养细菌时进行倒置培养的目的是防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。
4．用稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
(三)微生物的利用
1．纤维素酶是一种复合酶，它至少包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
2．尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都需使用选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。
3．鉴定尿素分解菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，鉴定纤维素分解菌的方法为刚果红染色法。
[课下达标检测]
一、基础题点练
1．关于实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作，下列说法正确的是(　　)
A．配培养基、倒平板、接种需要在酒精灯火焰旁进行
B．倒平板时，倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖
C．划线接种时，灼烧接种环后立即进行再次划线
D．划线接种结束后，需将平板倒置后放入培养箱中培养
解析：选D　倒平板、接种需要在酒精灯火焰旁进行，而配培养基不需要在酒精灯火焰旁进行；倒入培养基后立即盖上培养皿的皿盖，冷却后将平板倒过来放置；划线接种时，灼烧接种环后要等待其冷却后才能进行再次划线；划线接种结束后，需将平板倒置后放入培养箱中培养。
2．下列有关微生物分离、纯化及计数的叙述，错误的是(　　)
A．常用富含纤维素的培养基富集培养纤维素分解菌
B．平板划线法通过连续划线将聚集的菌种分散并计数
C．稀释涂布平板法通过系列梯度稀释可将微生物分散
D．用血细胞计数板计数微生物时，实验结果往往比稀释涂布平板法得到的结果偏大
解析：选B　纤维素是纤维素分解菌的碳源，因此常用富含纤维素的培养基富集培养纤维素分解菌；平板划线法通过连续划线将聚集的菌种分散，但不能用于微生物的计数；稀释涂布平板法通过系列梯度稀释可将微生物分散并计数；用血细胞计数板计数微生物时，会将死的微生物计数在内，因此导致实验结果往往偏大。
3．以下关于分离纤维素分解菌的实验操作错误的是(　　)
A．经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
B．选择培养这一步可省略，但得到的纤维素分解菌会较少
C．可通过定时测定葡萄糖产量的变化来衡量纤维素分解菌培养液中的纤维素酶产量
D．对照组可用等量的纤维素分解菌培养液涂布到含纤维素的培养基上
解析：选A　经选择培养后，再经梯度稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；富集培养可省略，但培养分离的纤维素分解菌较少；纤维素酶的测定方法一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定；实验组和对照组遵循单一变量原则，对照组可用等量的纤维素分解菌培养液涂布到含纤维素的培养基上，设置对照组能证明经“浓缩”培养的确得到了欲分离的微生物。
4．下表表示某培养基的配方，下列叙述正确的是(　　)
成分
蛋白胨
葡萄糖
KH2PO4
伊红
美蓝
蒸馏水
含量
10 g
10 g
2 g
0.4 g
0.065 g
1 000 mL

A．从物理性质看该培养基属于液体培养基，从用途看该培养基属于选择培养基
B．培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨
C．该培养基缺少提供生长因子的物质
D．该培养基调节合适的pH后就可以接种
解析：选B　从物理性质看该培养基属于液体培养基，从用途看该培养基属于鉴别培养基；微生物的营养物质主要包括氮源、碳源、水和无机盐等，培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨；生长因子主要包括维生素、氨基酸和碱基等，它们一般是酶和核酸的组成成分，蛋白胨可以提供生长因子；该培养基调节合适的pH后还需经灭菌后才可以接种使用。
5.如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为1→2→3→4→5，下列说法正确的是(　　)
A．操作前要将接种环用酒精消毒
B．划线操作须在酒精灯火焰上方进行
C．只有在5区才可以得到所需菌落
D．在12345区域中划线前后都要对接种环灭菌
解析：选D　在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，接种环的灭菌方法应是在酒精灯火焰上灼烧，不能用酒精消毒；接种时划线操作是在酒精灯火焰附近进行；在5个区域中，只要有单个活细菌，通过培养即可获得所需菌落；每次划线前都要灼烧接种环，目的是杀死接种环上原有的微生物(第一次划线前)和上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，划线结束后灼烧接种环以防止污染环境和感染操作者。
6．取9个洁净培养皿，均分为三组(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，各组分别加入等量的不同培养基，每个平板均用涂布法接种0.1 mL大肠杆菌菌液，37 ℃培养36 h后，统计 菌落数(见表)，以下相关叙述正确的是(　　)
组别
培养基
各平板的菌落数
1
2
3
Ⅰ
琼脂、C6H12O6、NH4NO3
30
31
27
Ⅱ
琼脂、C6H12O6、NH4NO3、维生素
169
178
193
Ⅲ
琼脂、NH4NO3、维生素
0
0
1

A．Ⅰ组和Ⅱ组说明维生素可以促进大肠杆菌生长
B．Ⅰ组和Ⅲ组说明大肠杆菌正常生长需要糖类物质
C．三组实验均使用了液体培养基，以方便菌落计数
D．三组实验所使用的培养基均需62 ℃、30 min消毒
解析：选A　由表格分析可知：Ⅰ组和Ⅱ组说明维生素可以促进大肠杆菌生长；Ⅱ组和Ⅲ组作对照，自变量是葡萄糖的有无，说明大肠杆菌正常生长需要葡萄糖；由题意知：每个平板都含有琼脂，属于固体培养基；三组实验所使用的培养基均需高压蒸汽灭菌。
二、高考题型练
7．(2019·济南一模)环境污染物多聚联苯难以降解，受到多聚联苯污染的土壤中，常有重金属污染同时存在。研究发现联苯降解菌内的联苯水解酶是催化多聚联苯降解的关键酶。为了从富含多聚联苯的环境中分离联苯降解菌，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见表)：

维生素
NH4NO3
MgCl2
多聚联苯
水
琼脂
培养基甲
＋
＋
＋
＋
＋
＋
培养基乙
＋
＋
＋
＋
＋
－

注：＋表示添加该物质，－表示没有添加该物质
(1)甲培养基中加入多聚联苯作为________用于培养联苯降解菌，该培养基属于________(填“选择”或“鉴别”)培养基。接种前需对甲培养基采用________________法进行灭菌。
(2)培养基乙________(填“能”或“不能”)用于测定联苯降解菌的数量，原因是__________________________________________________________。统计联苯降解菌数量时，应进行多组实验，再________。
(3)联苯降解菌在实验室里的降解率很高，但是实际污染环境的治理中降解率很低，这可能是因为________________________________(答出一种可能即可)。
解析：(1)分析表格，甲培养基中加入多聚联苯作为唯一碳源用于培养联苯降解菌，因此该培养基属于选择培养基。接种前需对甲培养基采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。(2)培养基乙没有加入琼脂，属于液体培养基，可以在其中培养联苯降解菌，采用显微计数法测量联苯降解菌数量。统计联苯降解菌数量时，应进行多组实验，再取平均值。(3)联苯降解菌在实验室里的降解率很高，但是实际污染环境的治理中降解率很低，这可能是因为实际污染环境中多聚联苯不是唯一碳源或其他污染物(如重金属)等导致联苯水解酶的数量或活性降低。
答案：(1)碳源　选择　高压蒸汽灭菌　(2)能　培养基乙为液体培养基，可以在其中培养联苯降解菌，采用显微计数法测量联苯降解菌数量　取平均值　(3)实际污染环境中多聚联苯不是唯一碳源或其他污染物(如重金属)等导致联苯水解酶的数量或活性降低(意思接近即可)
8．(2019·日照模拟)常见的酿酒酵母只能利用葡萄糖而不能利用木糖进行酒精发酵，自然界中某些酵母菌能分解木糖产生酒精，科学家欲从果园的葡萄上或土壤中分离这种酵母菌，操作如下：
(1)制备酵母菌培养基要进行倒平板操作，待平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是____________________________________。
(2)纯化菌株的过程中，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做的目的是________________________________。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误是____________________________________________。
(3)若要检测土样中的酵母菌数量，应采用____________法接种。在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板培养基先行培养了一段时间，这样做的目的是__________________________________。然后，将1 mL 土壤溶液分别稀释10倍和100倍，每种稀释度各3个平板，分别接入0.1 mL 稀释液，经适当培养后，6个平板上的菌落数分别为59、57、58、2、7和5，据此可得出每升土壤溶液中的活菌数为________个。
解析：(1)为了防止培养皿盖的冷凝水落入培养基造成污染，制备酵母菌培养基要进行倒平板操作，待平板冷凝后，要将平板倒置。(2)纯化菌株时，通常使用的划线工具是接种环。在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做可以将聚集的菌落逐步减少以获得单个菌落。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落，造成划线无菌落可能的操作失误是接种环灼烧后未冷却或划线未从第一区域末端开始。(3)若要检测土样中的酵母菌含量，应采用稀释涂布平板法。在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板培养基先行培养了一段时间，目的是检测培养基平板灭菌是否合格。稀释涂布平板法中，一般选用菌落数在30～300的平板进行计数，因此采用稀释10倍和菌落数分别为59、57、58的平板进行计算，据此可得出每升土壤溶液中的活菌数＝(59＋57＋58)÷3×10÷(0.1×10－3)＝5.8×106(个)。
答案：(1)防止培养皿盖的冷凝水落入培养基造成污染　(2)将聚集的菌体逐步分散以获得单个菌落　接种环灼烧后未冷却或划线未从第一区域末端开始　(3)稀释涂布平板　检测培养基灭菌是否合格　5.8×106
9．自生固氮菌可不与其他植物共生，独立完成固氮作用，在农业生产中具有广泛的用途。研究人员欲从土壤中筛选高效的自生固氮菌株进行研究。请回答下列问题：
(1)在配制含琼脂的培养基和倒平板的过程中，下列选项不需要的是________(填序号)。
①酒精灯　②接种环　③高压蒸汽灭菌锅　④棉塞
(2)要从土壤样品中分离出自生固氮菌，在获得土壤浸出悬液后，可以采用稀释涂布平板法将菌液涂布于________培养基上进行筛选。在如图所示的四种菌落分布图中，不可能是用该方法得到的是________。

(3)稀释涂布平板法还可用于检测土壤中自生固氮菌的含量，图中用该方法得到的菌落分布图中，最符合计数要求的是图中的________。用该方法统计样本菌落数时是否需要设置对照组？________。为什么？_________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)将1 g土样稀释103倍后分别取0.1 mL土壤浸出液，涂布到3个琼脂固体培养基的表面进行培养，记录到自生固氮菌的菌落平均数为130。则每克土样中自生固氮菌为____________。该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是____________________________________________________________________。
解析：(1)平板培养基配制的基本流程为：计算→称量→溶化(包括琼脂)→调节pH→分装→灭菌→倒平板→(冷却后)倒置平板，不需要接种环接种。(2)对微生物进行分离和计数，应该用稀释涂布平板法。自生固氮菌是指在土壤中能够独立进行固氮的细菌，所以培养基中不需要添加氮源。因为图D是平板划线法得到的平板，所以稀释涂布平板法接种不可能得到D的情况。(3)符合计数要求的平板中的菌落数应该在30～300之间，所以图中最符合要求的是平板C。由于需要判断培养基是否被污染，所以用该方法统计样本菌落数时需要设置对照组。(4)由于平板上自生固氮菌的菌落平均数为130，所以每克土样中自生固氮菌为130÷0.1×103＝1.3×106(个)。由于当两个或多个细胞连在一起时，在平板上形成的只是一个菌落，所以该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。
答案：(1)②　(2)缺氮　D　(3)C　需要　培养基制备不合格会导致菌落数増加　(4)1.3×106　当两个或多个细胞连在一起时，在平板上形成的只是一个菌落
10．在秋末，部分地区出现严重雾霾，这与秸秆野外焚烧有一定关系。为破解秸秆处理瓶颈，微生物专家力图通过微生物降解技术使秸秆尽快腐烂掉，增加土壤肥力并缓解环境污染。回答下列有关问题：
(1)专家研制的降解秸秆的催腐剂是十余种能分解纤维素的霉菌、细菌和酵母菌的组合。其中____________在细胞结构上与其他两者不同。
(2)纤维素酶是一种复合酶，其中的葡萄糖苷酶可以将______________分解为__________。
(3)微生物专家为从发黑的树干上分离出有分解纤维素能力的高产菌株，制备了选择培养基，将菌液进行一系列____________，从而得到单个菌落，再采用____________法进行鉴定。
(4)为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行__________________的实验，纤维素酶的测定方法一般是用______________(试剂)对纤维素分解产物进行定量测定。
解析：(1)霉菌和酵母菌属于真核生物，细菌属于原核生物，原核细胞和真核细胞在结构上最主要的区别是原核细胞没有核膜包被的成形的细胞核。(2)纤维素酶是一种复合酶，其中的葡萄糖苷酶可以将纤维二糖分解为葡萄糖。(3)微生物专家为从发黑的树干上分离出有分解纤维素能力的高产菌株，制备了选择培养基，将菌液进行一系列梯度稀释，从而得到单个菌落，再采用刚果红染色法进行鉴定。(4)为了确定是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶实验，纤维素酶的测定方法一般是用纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定，所以需要用到斐林试剂对纤维素分解产物进行定量测定。
答案：(1)细菌　(2)纤维二糖　葡萄糖　(3)梯度稀释　刚果红染色　(4)发酵产纤维素酶　斐林试剂
11．(2019·济南模拟)研究人员发现一种可以分解PET(聚对苯二甲酸乙二酯)塑料的细菌S，有望帮助解决塑料垃圾污染问题。细菌S在自然界中以PET塑料为营养源生存并繁殖，其能产生两种酶逐步分解PET塑料，最终产生CO2和水。回答下列问题：
(1)细菌S能分解PET塑料，有些细菌则不能，根本原因是____________________。细菌S不能以PET塑料的分解产物CO2作为碳源的原因是______________________________
________________________________________________________________________。
(2)研究人员将初步筛选的细菌S菌液稀释，稀释倍数分别为104、105和106，取0.1 mL涂布于培养基上，每个稀释倍数分别涂布三个平板，各平板的菌落数分别为(242、254、246)，(39、37、34)，(35、6、2)。以上三组不适合用于计数的为________倍数的稀释液，用另外两组稀释倍数进行计数得到的细菌数不一致的原因可能是______________________________
________________________________________________________________________。
(3)某同学认为为防止杂菌污染，可在培养基中加入青霉素，你认为该同学的观点________(填“正确”或“不正确”)，理由是__________________________________。
解析：(1)细菌S能分解PET塑料，有些细菌则不能，说明细菌S含有分解PET塑料的酶，根本原因是细菌S含有合成该酶的基因；细菌S不能以PET塑料的分解产物CO2作为碳源的原因是细菌S是异养型生物，只能摄取现成有机物，不能利用CO2合成有机物。(2)为了保证计数结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，故以上三组不适合用于计数的为106倍数的稀释液，用另外两组稀释倍数进行计数得到的细菌数不一致的原因可能是稀释倍数为104时，浓度较大，使得更多的菌落连在一起最终形成单菌落，导致结果小于稀释倍数为105的实验组。(3)青霉素抑制杂菌繁殖的同时，也会抑制细菌S的生长和繁殖，因此不能在培养基中加入青霉素来防止杂菌污染。
答案：(1)细菌S含有合成分解PET塑料酶的基因　细菌S是异养型生物，不能利用CO2合成有机物　(2)106　稀释倍数为104时，更多的菌落连在一起最终形成单菌落，导致结果小于稀释倍数为105的实验组　(3)不正确　青霉素抑制杂菌繁殖的同时，也会抑制细菌S的生长和繁殖
12．阿拉伯胶是一种植物多糖，用酶解法将其降解可得到阿拉伯糖等多种重要单糖。研究人员分离筛选到一株能合成阿拉伯胶降解酶的菌株ZHB。请回答下列问题：
(1)经初步筛选得到的ZHB菌落呈絮状突起，镜下观察发现其细胞核明显、菌丝白色致密、产生深褐色孢子。由上述特征初步推测ZHB属于________(填“细菌”或“霉菌”)。根据这一推测，培养该菌株的培养基pH应调至____________，培养温度一般应为________________。
(2)将ZHB的孢子制成悬液，应用________________法接种，可将培养得到的ZHB单菌落用于后续研究。在培养过程中，获得纯净培养物的关键是________________________________________________________________________。
(3)欲测定ZHB产生的阿拉伯胶降解酶的活力，应选用表中的____________培养液。不选用其他培养液的原因是________________________________________________。
培养液
阿拉伯胶(g/L)
阿拉伯胶酶(μg/L)
NaNO3(g/L)
KH2PO4 (g/L)
MgSO4·7H2O(g/L)
KCl (g/L)
FeSO4·7H2O(g/L)
甲
25
－
－
1
1
0.5
0.01
乙
25
1
3
1
1
0.5
0.01
丙
25
－
3
1
1
0.5
0.01

解析：(1)在显微镜下观察分离得到的菌株ZHB，发现其菌丝白色致密、细胞核明显，初步推测菌株ZHB属于霉菌。培养真菌的培养基pH应调至酸性，真菌的培养温度一般为25～28 ℃。(2)将液体菌种接种在固体培养基上一般需要使用稀释涂布平板法或平板划线法接种。在培养过程中，获得纯净培养物的关键是进行无菌操作，防止外来杂菌的干扰。(3)对菌株ZHB中阿拉伯胶降解酶的活力进行测定，则必须以阿拉伯胶为唯一碳源，同时需要加入氮源，因此应选用表中的丙配方。甲培养液缺少氮源，菌株ZHB不能很好生长；乙培养液有阿拉伯胶酶，会影响对菌株ZHB自身产生的酶活力的测定结果。
答案：(1)霉菌　酸性　25～28 ℃　(2)稀释涂布平板法或平板划线　防止外来杂菌的入侵　(3)丙　甲培养液缺少氮源、乙培养液有外源阿拉伯胶酶的干扰
第2课时　运用发酵技术制作食品
考点一　果酒和果醋的制作

1．制作原理

菌种
反应
果酒
酵母菌
有氧条件，大量繁殖：　　　　　　　　　　
C6H12O6＋6O2 6CO2＋6H2O
无氧条件，产生酒精：
C6H12O6 2C2H5OH＋2CO2
果醋
醋酸菌
氧气、糖源都充足时：糖→醋酸；
缺少糖源时：乙醇→乙醛→醋酸
C2H5OH＋O2 CH3COOH＋H2O

2．实验流程(将“”中的内容补充完整)

3．发酵条件

果酒制作
果醋制作
温度
18～25 ℃
30～35 ℃
空气
先通气后密封
全程通气
时间
10～12 d
7～8 d

[基础自测]
1．判断下列叙述的正误
(1)苹果酒的发酵过程中，若发酵液表面出现菌膜，最可能原因是发酵瓶漏气(√)
(2)酵母菌是嗜温菌，所以果酒发酵所需的最适温度高于果醋发酵温度(×)
(3)在葡萄酒制作中，采摘的葡萄应反复冲洗，且要先除枝梗再冲洗(×)
(4)红葡萄酒中的红色是红葡萄皮中的色素进入发酵液产生的(√)
(5)在家庭中用鲜葡萄制作果酒时，要向发酵装置通入空气(×)
(6)在果酒发酵后期，拧松瓶盖的间隔时间可延长(√)
(7)变酸的酒表面的菌膜是由酵母菌大量繁殖形成的(×)
(8)果醋发酵包括无氧发酵和有氧发酵(×)
(9)条件适宜时醋酸菌可将葡萄汁中的糖分解成醋酸(√)
(10)在利用葡萄发酵产生果酒的后期，加入醋酸菌即可产生醋酸(×)
2．学透教材、理清原因、规范答题用语专练
据制作果酒和果醋的发酵装置图回答问题：

(1)装置图中a、b、c分别指什么？其作用是什么？
提示：a为充气口，用于向装置内通气；b为排气管，用于排出CO2；c为出料口，用于取样检测。
(2)b需长而弯曲，其目的是什么？
提示：b长而弯曲，其目的是防止空气中微生物的污染。
(3)进行醋酸发酵和酒精发酵时，对图中哪一处操作有差异？请具体指明。
提示：使用该装置制果酒时，应该关闭充气口；制果醋时，应将充气口连接气泵，输入氧气(无菌空气)。
(4)图中发酵瓶中葡萄汁的量是否恰当？为什么？
提示：不恰当，因为葡萄汁的量不能超过发酵瓶体积的2/3，而且排气管口离发酵液应有一段距离。

1．制作果酒和果醋的发酵装置分析

该装置的使用方法：使用该装置制作果酒时，应该关闭充气口；制作果醋时，应将充气口连接充气泵，输入无菌空气。
2．果酒和果醋制作成功的关键
项目
说明
材料的选
择与处理
选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄进行冲洗，再除去枝梗，以防葡萄汁流失及污染。冲洗以洗去灰尘为目的，以防洗去野生型酵母菌
防止发酵
液被污染
①榨汁机和发酵瓶等都需清洗干净，且发酵瓶要进行消毒；
②清洗葡萄时要先清洗后除枝梗；
③发酵瓶排气管用曲颈管而不用直管
控制发
酵条件
①葡萄汁装入发酵瓶时，要留约1/3的空间，目的是先让酵母菌进行有氧呼吸，快速繁殖，耗尽O2后再进行酒精发酵，并防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液的溢出；
②严格控制温度：18～25 ℃利于酵母菌的繁殖和酒精发酵；30～35 ℃利于醋酸菌的繁殖和果醋的发酵；
③充气：酒精发酵为无氧发酵，需关闭充气口；醋酸发酵为有氧发酵，需经充气口充气

3.结果分析与评价

果酒的制作
果醋的制作
相同
嗅味、品尝、镜检相应的微生物等
不同
通过重铬酸钾检验酒精
通过pH试纸检测发酵前后发酵液的pH变化

[对点落实]
1．(2018·江苏高考)某高校采用右图所示的发酵罐进行葡萄酒主发酵过程的研究，下列叙述错误的是(　　)
A．夏季生产果酒时，常需对罐体进行降温处理
B．乙醇为挥发性物质，故发酵过程中空气的进气量不宜太大
C．正常发酵过程中罐内的压力不会低于大气压
D．可以通过监测发酵过程中残余糖的浓度来决定何时终止发酵
解析：选B　利用酵母菌进行酒精发酵时，一般将温度控制在18～25 ℃，因此夏季生产果酒时，需要对发酵罐体进行降温处理；发酵过程中，进气口阀门应该关闭，以保证发酵罐的无氧环境，使酵母菌进行无氧呼吸产生酒精；正常发酵过程中，由于酵母菌进行无氧呼吸产生CO2，所以发酵罐内的压力增大，高于大气压；葡萄酒的发酵过程消耗葡萄糖，所以可以通过监测发酵过程中残余糖的浓度来决定何时终止发酵。
2．(2017·浙江11月选考单科卷，节选)回答与酿酒和制醋有关的问题：
(1)为了获得优良的酿酒红曲霉菌株，将原菌株的孢子诱变处理后制成较稀浓度的单孢子悬液，这样做的目的是在培养时利于获得________。
(2)大米经蒸煮、红曲霉菌糖化后，用某酿酒酵母进行酒精发酵，发酵完毕后得到新鲜红曲酒，酒中乙醇浓度不超过15%。其主要原因是当发酵液中的乙醇浓度接近15%时，________。
A．乙醇氧化逐渐增强直至平衡
B．葡萄糖分解逐渐增强直至平衡
C．乙醇氧化逐渐减弱直至停止
D．葡萄糖分解逐渐减弱直至停止
(3)已知葡萄糖与蒽酮试剂反应能产生颜色。采用光电比色法测定红曲酒中的葡萄糖含量的步骤如下：第一步，标准曲线的制作。用蒸馏水配制________________________，与蒽酮试剂反应后，用比色计测定，并制作以________________________的标准曲线。第二步，样品处理。将待测酒样品通过活性炭脱色，其目的是____________________。第三步，样品测定与计算。
(4)影响红曲酒风味的主要因素，除了温度、pH、氧气等环境因素外，还有_________________________(答出2点即可)。
(5)在红曲醋生产工艺中，将适量的红曲酒、水和醋化醋杆菌等混合。再添加一定量谷壳糠等制成松散的发酵料，其主要目的是______________，以利于醋酸发酵。
解析：(1)在适当的稀释度下，可培养得到相互分开的菌落，即单菌落。(2)乙醇浓度接近15%时，抑制了酵母菌的活性，可推知葡萄糖的分解会逐渐减弱直至停止。(3)标准曲线的制作：用蒸馏水配制不同浓度葡萄糖标准溶液，与蒽酮试剂反应后，用比色计测定，并制作以葡萄糖浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标的标准曲线。样品处理：因为要用比色杯测光密度值，所以将待测酒样品通过活性炭脱色，其目的是防止酒样的颜色影响比色。(4)酿酒过程中，除了温度、pH、氧气等环境因素外，还有酿酒原料、菌种活性、糖含量、杂菌污染、次级代谢产物等都会影响酒的风味。(5)酿醋过程中，添加一定量谷壳糠等制成松散的发酵料，可在发酵过程中为醋酸菌积存氧气，有利于空气流通。
答案：(1)单菌落　(2)D　(3)一系列浓度的葡萄糖标准溶液　葡萄糖浓度与光密度值关系　排除酒原有颜色的干扰
(4)不同的菌株、不同的原料　(5)增加通气性
考点二　腐乳的制作

1．制作原理
(1)菌种：起主要作用的是毛霉。
(2)作用
①蛋白质小分子的和氨基酸
②脂肪甘油和脂肪酸
2．实验流程
―→―→―→
3．影响因素

[基础自测]
判断下列叙述的正误
(1)腐乳的制作实验加料酒主要是为了灭菌，避免腐败变质(×)
(2)将腐乳坯堆积起来会导致堆内温度升高，影响毛霉生长(√)
(3)将长满毛霉的豆腐装瓶腌制时，底层和近瓶口处需加大用盐量(×)
(4)在腐乳制作过程中加入香辛料既能调节风味，还具有防腐杀菌作用(√)
(5)在腐乳制作过程中，盐的用量要适宜，酒的含量一般控制在12%左右(√)
(6)果酒、果醋和腐乳的制作中，腐乳制作所需要的适宜温度最高(×)
(7)勤向腐乳坯表面喷水，有利于毛霉菌丝的生长(×)

1．影响腐乳品质的因素
项目
说明
水的控制
含水量约70%，用含水量过高的豆腐制腐乳，不易成形
盐的控制
盐浓度过高会影响腐乳的口味；盐浓度过低，腐乳易腐败变质
酒的控制
酒的含量一般控制在12%左右。酒精含量过高，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，杂菌繁殖快，豆腐易腐败
温度控制
温度为15～18 ℃，适合毛霉生长
香辛料
具有调味和杀菌的作用，也会影响腐乳的风味或质量

2．防止杂菌污染的方法
(1)前期发酵条件的控制：提供有利于毛霉生长的温度、水分，形成毛霉的生长优势，抑制杂菌的生长。
(2)后期发酵条件的控制
①用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。
②装瓶腌制时，操作要迅速小心，且要逐层加盐，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。
③加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。
[对点落实]
1．(2019·淄博期末)下图为腐乳制作过程的流程图，下列说法错误的是(　　)
―→―→―→
A．毛霉为好氧型真菌，为避免缺氧，码放豆腐时要留出一定缝隙
B．加盐腌制的目的是析出豆腐中的水分使之变硬，同时能抑制微生物的生长
C．加卤汤、密封腌制中，毛霉不断增殖，并产生大量的酶，分解蛋白质
D．用胶条密封瓶口时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，以防止瓶口污染
解析：选C　毛霉是异养需氧型微生物，所以为避免缺氧，码放豆腐时要留出一定缝隙；加盐可以析出豆腐中的水分使之变硬，同时能抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质；加卤汤、密封腌制，具有防腐杀菌的作用，同时使腐乳具有一定的香味，在此条件下毛霉不能生长增殖；用胶条密封瓶口时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，以防止瓶口污染。
2．腐乳是中国流传数千年的传统民间美食，通常分为青方、红方、糟方三大类。请结合相关知识回答问题：
(1)在制作果酒、果醋、泡菜、腐乳的过程中全程需要氧气的是________。毛霉能在豆腐块上生长，是因为豆腐块能为其提供水、无机盐、________和________等四大类基本营养物质。
(2)腐乳的发酵过程中能起到防腐作用的物质有________________三类。青方、红方和糟方三类腐乳中，________类没有加入辅料。现代工业生产腐乳，必须严格控制无菌条件，对豆腐灭菌宜采用的方法是________________。
(3)科学家研究了食盐用量对豆腐乳品质及发酵周期的影响，结果如图：

由图可知，随食盐用量的增加，豆腐乳品质的综合评分总体上呈现______________趋势，选择食盐用量为________较为适宜。发酵周期与食盐的用量呈________相关，原因可能是__________________________________________________________________。
解析：(1)在制作果酒、果醋、泡菜、腐乳的过程中全程需要氧气的是果醋，果酒和腐乳的制作过程中都是先供气后密封，泡菜制作过程全程需要密封。毛霉能在豆腐块上生长，是因为豆腐块能为其提供无机盐、碳源、氮源、水等四大类基本营养物质。(2)腐乳的发酵过程中能起到防腐作用的物质有酒、香辛料、盐三类。青方、红方和糟方三类腐乳中，青方类没有加入辅料。现代工业生产腐乳，必须严格控制无菌条件，对豆腐灭菌宜采用高压蒸汽灭菌。(3)由图可知，随食盐用量的增加，豆腐乳品质的综合评分总体上呈现先上升后下降趋势，选择食盐用量为10%较为适宜。随食盐浓度的增加，对发酵微生物的抑制作用增强，因此发酵周期与食盐的用量呈正相关。
答案：(1)果醋　碳源　氮源　(2)酒、香辛料、盐　青方　高压蒸汽灭菌　(3)先上升后下降　10%　正　随食盐浓度的增加，对发酵微生物的抑制作用增强(或随食盐浓度的增加，对脂肪酶和蛋白酶活性的抑制作用增强)
考点三　泡菜的制作

1．制作原理
(1)菌种：乳酸菌。
(2)原理：在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。反应式：C6H12O6―→2C3H6O3。
2．实验流程

3.实验操作
(1)选择气密性好的泡菜坛，以保证无氧条件。
(2)注意控制腌制时间、温度和食盐的用量。
4．测定亚硝酸盐含量
(1)测定原理
亚硝酸盐＋对氨基苯磺酸→反应物
反应物＋N­1­萘基乙二胺盐酸盐→玫瑰红色染料
(2)判断方法：比色法。即用显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液进行对比，并估算泡菜中亚硝酸盐的含量。亚硝酸盐溶液的浓度越高，颜色越；浓度越低，颜色越。
(3)操作步骤
→→→
[基础自测]
1．判断下列叙述的正误
(1)泡菜制作的菌种主要是醋酸菌(×)
(2)与人工接种的发酵相比，自然发酵获得的产品品质更好(×)
(3)配制泡菜盐水时，盐与水的质量比为4∶1(×)
(4)制备泡菜时，盐水煮沸后可以立即使用(×)
(5)发酵过程中坛沿注满水有利于泡菜的无氧发酵(√)
(6)影响泡菜腌制的因素包括时间、温度和食盐的用量等(√)
(7)泡菜的制作前期需要通入氧气，后期应严格保持无氧条件(×)
(8)测定亚硝酸盐的含量时，样品中亚硝酸盐含量不同则会形成不同深度的玫瑰红(√)
2．学透教材、理清原因、规范答题用语专练
表中甲～丁为腐乳、泡菜、果醋、果酒等发酵食品制作装置图，回答下列问题：
食品
①
②
③
④
主要微生物
a
b
c
d
制作装置





(1)请填出①～④食品名称：①__________，②__________，③________，④________。
(2)请填出a～d菌种名称：a、______，b、________，c、________，d、________，其中______________为真核生物，____________________为原核生物。
(3)甲～丁装置是否存在缺陷，试具体分析指出，并说明丁装置中“放水”的作用。________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案：(1)果酒　果醋　腐乳　泡菜　(2)酵母菌　醋酸菌　毛霉　乳酸菌　酵母菌、毛霉　醋酸菌、乳酸菌　(3)甲、丙装置有缺陷：甲装置中排气管下端不应插入发酵液内，丙装置接种菌种应在加盐腌制之前；丁装置中放水的作用是为泡菜坛营造无氧环境

1．传统发酵技术中常用菌种的比较
微生物
酵母菌
醋酸菌
毛霉
乳酸菌
分类
真核生物
原核生物
真核生物
原核生物
代谢类型
异养兼性厌氧
异养需氧
异养需氧
异养厌氧
适宜温度
18～25 ℃
30～35 ℃
15～18 ℃
室温
发酵条件
前期需氧；
后期不需氧
一直需氧
一直需氧
无氧
生殖方式
孢子生殖，适宜条件下进行出芽生殖
二分裂生殖
孢子生殖
二分裂生殖
生产应用
酿酒、发面
酿醋
制作腐乳
制作酸
奶、泡菜

2．泡菜制作的注意事项
(1)材料的选择及用量
①蔬菜应新鲜，若放置时间过长，蔬菜中的硝酸盐易被还原成亚硝酸盐。
②清水和盐的质量比为4∶1，盐水要煮沸后冷却。煮沸有两大作用，一是除去水中的氧气，二是杀灭盐水中的细菌。
(2)防止杂菌污染：每次取样用具要洗净，取样后要迅速封口。
(3)控制严格的无氧条件
①泡菜坛要选择气密性好的容器，以创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵，防止蔬菜腐烂。
②泡菜坛坛盖边沿的水槽内注满水，以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境，并注意在发酵过程中经常补水。
(4)控制适宜的温度：以18～20 ℃为宜，温度偏高有害菌活动能力强，温度偏低不利于乳酸发酵。
[对点落实]
1．在《魅力中国城》初赛竞演的“城市味道”环节中，黔东南以家乡的味道为主题，通过酸汤鱼、五彩姐妹饭等十几道特色农家菜，展示了黔东南州最具特色的家乡美食，回答下列问题。
(1)“酸汤”是通过天然发酵而成，参与该发酵过程的主要微生物是____________。
(2)制作酸汤常用到煮沸的水和米汤，将水煮沸的目的是：________________________。
(3)酸汤发酵初期，亚硝酸盐的含量逐渐增加，亚硝酸盐在______________________和一定的微生物作用等特定条件下，才会转变成致癌物——________。
(4)出坛后的酸汤，若不及时食用，一段时间后会在其表面出现一层白膜，这是____________(填微生物名称)繁殖引起的，与进行酸汤发酵的主要微生物相比，该微生物在结构上的最主要区别是________________________________。
(5)在酸汤制作时，密封之前向发酵液中加入少许优质的酸汤母液，这样做有什么好处？________________。
解析：(1)酸汤是通过乳酸菌的无氧呼吸(发酵)形成的。(2)制作酸汤时，将水煮沸的目的是除去水中的氧气并消毒；米汤相当于乳酸菌的培养液，可以为其提供水、无机盐、碳源、氮源等营养物质。(3)亚硝酸盐在适宜的pH、温度和一定的微生物作用等特定条件下，会转变成亚硝胺。(4)酸汤表面氧气含量高，因此其表面出现的一层白膜是酵母菌；与原核生物乳酸菌相比，酵母菌属于真核生物，具有核膜包被的成形的细胞核。(5)在酸汤制作时，密封之前向发酵液中加入少许优质的酸汤母液，可提供优质菌种。
答案：(1)乳酸菌　(2)除去水中的氧气并消毒　(3)适宜的pH、温度　亚硝胺　(4)酵母菌　具有核膜包被的细胞核　(5)提供优质菌种
2．以下是有关泡菜发酵过程中的相关问题，请回答：
(1)蔬菜刚入坛时，其表面带有不抗酸的大肠杆菌和酵母菌等微生物。其中的酵母菌最初的呼吸作用方式是________________，请写出相关反应式：________________________________________。
(2)到发酵中期，无氧环境形成，乳酸菌开始活跃，并产生大量乳酸，使乳酸积累量达到0.6%～0.8%，pH为3.5～3.8，试分析此时坛内其他微生物的活动情况及原因：________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)发酵后期，乳酸含量继续增加，当达到1.2%以上时，发酵速度逐渐变缓甚至停止，主要原因是________________________________________________________。
(4)请在下列坐标图中画出该过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐含量的变化趋势。

解析：蔬菜入坛的初期，坛内氧气充足，酵母菌主要进行有氧呼吸产生CO2和H2O。发酵后期发酵速度变缓甚至停止的主要原因是过多的乳酸使pH过低，抑制了乳酸菌的生长。
答案：(1)有氧呼吸　C6H12O6＋6O2＋6H2O6CO2＋12H2O＋能量　(2)其他微生物活动减慢甚至停止，因为pH不适宜　(3)pH过低抑制了乳酸菌的生长　(4)如图所示：


[归纳拓展]
泡菜腌制中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化
发酵时期
乳酸菌
乳酸
亚硝酸盐
发酵初期
少(有O2，乳酸菌活动受抑制)
少
增加(硝酸盐还原菌的作用)
发酵中期
最多(乳酸抑制其他菌活动)
积累、增多，pH下降
下降(硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解)
发酵后期
减少(乳酸继续积累，pH继续下降，抑制其活动)
继续增多，pH继续下降
下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制)
变化曲线



注意
亚硝酸盐是硝酸盐还原菌促进硝酸盐还原形成的，而不是硝化细菌氧化氨形成的

　 　　　课堂一刻钟
1．(2017·江苏高考，多选)如图是探究果酒与果醋发酵的装置示意图。下列相关叙述正确的是(　　)
A．改变通入气体种类，可以研究呼吸作用类型对发酵的影响
B．果酒发酵中期通入氮气，酵母菌将从有氧呼吸转变为无氧呼吸
C．果醋的发酵周期与实验设定的温度密切相关
D.
易错探因——辨识不清
对果酒和果醋制作的装置示意图各部分的作用认识不到位导致错误，若气体入口与出品交换会导致发酵液溢出。
解析：选ABC　改变通入气体的种类，例如分别通入氮气和氧气，可研究无氧呼吸和有氧呼吸对发酵的影响；果酒发酵中期通入氮气，更利于创造无氧条件，酵母菌将从有氧呼吸转变为无氧呼吸；果醋发酵的菌种是醋酸(杆)菌，其生长的适宜温度是30～35 ℃，温度能影响醋酸(杆)菌的代谢，从而影响果醋的发酵周期；气体的入口必须伸入培养液中，气体出口不能伸入培养液中，如果气体的入口和出口交换，会导致发酵液喷出。
2．(2017·江苏高考)下列关于“腐乳的制作”实验，叙述正确的是(　　)
A．控制发酵温度的主要目的是腐乳调味
B．腐乳制作后期加入香辛料和料酒有防腐作用
C．毛霉的主要作用是分解脂肪和淀粉
D.
易错探因——知识不全
对腐乳表面粘性物质产生原因不明是造成错选的原因，该粘性物质是由毛霉菌丝形成的，而毛霉属于真菌。
解析：选B　控制发酵温度的主要目的是利于菌种繁殖和代谢；腐乳制作后期加入香辛料和料酒有防腐作用；毛霉的主要作用是分解蛋白质和脂肪；成品腐乳表面的粘性物质主要是毛霉产生的菌丝，而毛霉属于真菌。


3．(2014·广东高考)下列叙述错误的是(　　)
A.
B．酵母菌在无氧条件下利用葡萄汁产生酒精
C．泡菜腌制利用了乳酸菌的乳酸发酵
D．腐乳制作利用了毛霉等微生物的蛋白酶和脂肪酶
易错探因——张冠李戴
酵母菌在无氧条件下进行无氧呼吸产生酒精，但醋酸菌是好氧菌，只有在氧气充足的条件下才能利用乙醇产生醋酸。　 　　　　　　　　　　　　　　 　　
解析：选A　醋酸菌是好氧细菌，只有当氧气充足时，才能利用乙醇发酵产生醋酸；酵母菌是兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行无氧呼吸产生酒精；泡菜制作利用的原理是乳酸菌在无氧条件下可将葡萄糖分解成乳酸；毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶可将脂肪分解为甘油和脂肪酸。
4．(2018·海南高考)葡萄酒是葡萄汁经酵母菌发酵而成的。酿制葡萄酒的两个简易装置如图所示。

回答下列问题：
(1)试管中的X溶液有助于维持甲装置的瓶中气压相对稳定，与乙装置相比，用甲装置酿制葡萄酒的优点是____________________________________________________(答出两点即可)。
(2)葡萄汁装入甲装置时，要留有约1/3的空间，这种做法的目的是________________________________________________________________________________________________(答出两点即可)。
(3)某同学若用乙装置进行发酵，并设置两个不同处理组(乙A和乙B)，乙A装置中保留一定量的氧气，乙B装置中没有氧气。在其他条件相同且适宜的情况下，测得一段时间内乙A和乙B中酒精含量的变化趋势及乙A中氧气含量的变化趋势如曲线图所示。图中曲线①、②、③依次表示______________、______________、_______________含量的变化趋势。
解题关键——图文结合，灵活迁移
本小题结合曲线考查酵母菌发酵产物的变化，解答此题需迁移必修①中有关细胞呼吸的知识。酵母菌既可进行有氧呼吸也可进行无氧发酵产生酒精。只有对必修模块知识进行灵活迁移才能解答此题。

(4)从细胞呼吸类型看，酵母菌属于________生物；从同化作用的类型看，酵母菌属于________(填“自养”或“异养”)生物。
解析：(1)试管中的X溶液有助于维持甲装置的瓶中气压相对稳定，与乙装置相比，用甲装置酿制葡萄酒的优点是不需要开盖放气；避免了因开盖引起的杂菌污染。(2)葡萄汁装入甲装置时，要留有约1/3的空间，这种做法的目的是为酵母菌大量繁殖提供适量的氧气；防止发酵旺盛时汁液溢出。(3)分析题意可知，图中曲线①、②、③依次表示乙A中的氧气、乙B中的酒精、乙A中的酒精含量的变化趋势。(4)从细胞呼吸类型看，酵母菌属于兼性厌氧生物；从同化作用的类型看，酵母菌属于异养生物。
答案：(1)不需要开盖放气；避免了因开盖引起的杂菌污染　(2)为酵母菌大量繁殖提供适量的氧气；防止发酵旺盛时汁液溢出　(3)乙A中的氧气　乙B中的酒精　乙A中的酒精　(4)兼性厌氧　异养
5．(2017·全国卷Ⅱ)豆豉是大豆经过发酵制成的一种食品。为了研究影响豆豉发酵效果的因素，某小组将等量的甲、乙两菌种分别接入等量的A、B两桶煮熟大豆中并混匀，再将两者置于适宜条件下进行发酵，并在32 h内定期取样观测发酵效果。回答下列问题：
(1)该实验的自变量是________、______________。
(2)如果发现发酵容器内上层大豆的发酵效果比底层的好，说明该发酵菌是________。
(3)如果在实验后，发现32 h内的发酵效果越来越好，且随发酵时间呈直线上升关系，则无法确定发酵的最佳时间；若要确定最佳发酵时间，还需要做的事情是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)从大豆到豆豉，大豆中的成分会发生一定的变化，其中，蛋白质转变为______________，脂肪转变为________________。
命题探源——以“本”为本
本小题源于人教版选修①教材P6腐乳制作的原理。高考试题对选修部分的考查大多比较基础，有些填空基本上属于送分题，因此在复习中应注意对教材基础知识的理解记忆。
解析：(1)实验使用甲、乙两种菌种，并在32 h内定期取样观测发酵效果，所以该实验的自变量是菌种和发酵时间。(2)如果发现发酵容器内上层大豆的发酵效果比底层的好，说明该发酵菌是好氧型微生物。(3)因“32 h内的发酵效果越来越好，且随发酵时间呈直线上升关系”，说明发酵的最佳时间超过32 h，故可继续延长发酵时间，定期取样观测发酵效果，以确定最好的发酵效果所对应的时间，此时间即为最佳发酵时间。(4)从大豆到豆豉，在相关微生物的作用下，大豆中的蛋白质转变为肽和氨基酸，脂肪转变为甘油和脂肪酸。
答案：(1)菌种　发酵时间　(2)好氧菌　(3)延长发酵时间，观测发酵效果，最好的发酵效果所对应的时间即为最佳发酵时间　(4)氨基酸和肽　脂肪酸和甘油

6．(2015·广东高考)泡菜是我国的传统食品之一，但制作过程中产生的亚硝酸盐对人体健康有潜在危害。某兴趣小组准备参加“科技创新大赛”，查阅资料得到下图。

(1)制作泡菜时，泡菜坛一般用水密封，目的是_________________________________。乳酸菌发酵第一阶段的产物有________________________________________________。
(2)据图，与第3天相比，第8天后的泡菜更适于食用，因为后者________________________；pH呈下降趋势，原因是__________________________________。
(3)该小组得到一株“优选”乳酸菌(亚硝酸盐还原酶活力比普通乳酸菌高5倍)，拟参照资料的实验方案和食盐浓度(4%～10%)，探究与普通乳酸菌相比用“优选”乳酸菌制作泡菜过程中亚硝酸盐含量的高低，并确定其最适条件。请你。
解题关键——表格制作
此小题主要考查考生根据实验目的设计统计表格的能力及预期实验结果获取结论的能力。表格制作要注明所要记录的各项数据(自变量、因变量等)。
解析：(1)制作泡菜时，泡菜坛要选择密封性好的容器，一般用水密封，以创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵，防止蔬菜腐烂。乳酸菌发酵第一阶段的产物有丙酮酸、[H]和少量ATP。(2)第3天时，泡菜中亚硝酸盐含量达到最高，在第8天后的泡菜中亚硝酸盐含量降到最低，故第8天后的泡菜更适于食用。乳酸菌无氧呼吸产生的乳酸会导致pH下降。(3)设计的记录表中要包含乳酸菌类型、食盐浓度和发酵时间等自变量，因变量为亚硝酸盐的含量。通过相互对照确定用“优选”乳酸菌制作泡菜过程中亚硝酸盐含量的高低，并确定最适发酵条件。
答案：(1)创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵　丙酮酸、[H](少量ATP)　(2)亚硝酸盐含量低　乳酸菌无氧呼吸产生了乳酸　(3)两种乳酸菌在泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量变化表
乳酸菌类型
及食盐浓度
亚硝酸盐含
量(mg/kg)
发酵时间(天)
普通乳酸菌
“优选”乳酸菌
4%
5%
6%
……
9%
10%
4%
5%
6%
……
9%

10%
1












2












3












……












10













推测实验结论：与普通乳酸菌相比，“优选”乳酸菌制作泡菜时，相同条件下产生的亚硝酸盐含量低。
[学情考情·了然于胸]
一、明考情·知能力——找准努力方向
考查知识
1.果酒、果醋、腐乳、泡菜制作的原理及方法是常规考点，难度较低。
2.果酒和果醋制作的实验装置的分析与应用是高频考点，也是易错点。
3.果酒、果醋、腐乳、泡菜制作的影响因素及有关实验探究是难点、易错点。
考查能力
1.识记能力：主要考查考生对果酒、果醋、腐乳、泡菜制作的原理、方法及影响因素等的记忆。
2.综合应用能力：如果酒和果醋制作的实验装置的分析及应用，果酒、果醋、腐乳、泡菜制作的原理、方法及影响因素等的综合分析等。
3.信息获取能力：主要考查考生分析曲线、获取有效信息的能力。
4.实验探究能力：如第4、5、6题，综合考查考生的实验探究及对实验结果的分析能力。

二、记要点·背术语——汇总本节重点
1．果酒和果醋的制作
(1)在葡萄酒的自然发酵中，菌种来源于附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。
(2)酵母菌是兼性厌氧型微生物，在有氧条件下进行有氧呼吸大量繁殖，在无氧条件下进行酒精发酵产生酒精。
(3)制作果酒和果醋的实验流程：挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→醋酸发酵。
(4)制作果酒和果醋的发酵装置中充气口的作用是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气，排气口是在酒精发酵时排出CO2，出料口用来取样。
(5)制作果酒时温度一般控制在18～25 ℃，时间为10～12 d，前期需氧后期不需氧；制作果醋时温度控制在30～35 ℃，时间为7～8 d，始终需氧。
2．腐乳的制作
(1)腐乳制作过程中起主要作用的微生物是毛霉，来源于空气中的毛霉孢子。(2)毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。
(3)腐乳制作的实验流程：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制。
(4)加盐腌制时应逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。
(5)加盐既可析出豆腐中的水分，又能抑制微生物的生长。卤汤是由酒和香辛料配制而成的，既能防腐杀菌，又能调味。卤汤中的酒的含量一般控制在12%左右。
3．泡菜的制作及亚硝酸盐含量的测定
(1)制作泡菜的主要菌种是乳酸菌，乳酸菌在无氧条件下可将葡萄糖分解为乳酸。
(2)泡菜制作的实验流程：原料加工→配制泡菜盐水→加入调味料，装坛→发酵→成品。
(3)泡菜制作中清水和盐的质量比为4∶1，盐水要煮沸后冷却。煮沸有两大作用，一是除去水中氧气，二是杀灭盐水中的其他细菌。
(4)在泡菜的腌制过程中，温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。

一、基础题点练
1．如图表示果酒和果醋制作过程中的物质变化过程，下列叙述正确的是(　　)

A．过程①和②都只能发生在缺氧条件下
B．过程①和③都发生在酵母细胞的线粒体中
C．过程③和④都需要氧气的参与
D．过程①～④所需的最适温度基本相同
解析：选C　据图分析可知：①是细胞呼吸的第一阶段；②是无氧呼吸的第二阶段；③是有氧呼吸的第二、三阶段；④是果醋制作中乙醇氧化为醋酸的阶段。过程①在有氧或无氧的条件下都可以进行；过程①是在细胞质基质中进行的；③和④过程都必须在有氧的条件下才可以进行；①②(③)是果酒制作的阶段，其适宜的温度为18～25 ℃，④是果醋制作的阶段，其适宜的温度为30～35 ℃。
2．下面是利用微生物制作果酒、果醋的流程示意图，请据图判断下列说法正确的是(　　)

A．制作果酒时，先去除烂子粒和枝梗，再用清水冲洗掉污物
B．榨汁前，榨汁机和发酵瓶都需要用体积分数为70%的盐酸消毒
C．A过程是酒精发酵，A过程结束后，只需要提高一定的环境温度就能产生果醋
D．导致发酵产物不同的重要因素是温度、时间、菌种等
解析：选D　制作果酒时，应该先用清水冲洗掉污物，再去除烂子粒和枝梗；榨汁机要清洗干净，并晾干，发酵瓶要清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒；A过程是酒精发酵，A过程完成后，除了需要提高一定的温度，还要通入氧气，才能产生果醋；根据流程图可知导致发酵产物不同的重要因素是温度、时间、菌种等。
3．下列关于腐乳制作的叙述，错误的是(　　)
A．毛霉可利用其体内的酶将豆腐中的蛋白质分解成小分子肽和氨基酸
B．卤汤中酒的含量越高，杂菌繁殖越快，豆腐越易腐败
C．用盐腌制腐乳的过程中，要控制盐的用量，盐的浓度过高会影响口味，过低则不足以抑制杂菌的生长，导致豆腐腐败
D．其制作过程可以表示为：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制
解析：选B　豆类中含量最多的有机物是蛋白质，毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸。卤汤中酒的含量过高，腐乳成熟的时间将会延长；卤汤中酒的含量过低，杂菌繁殖快，可能导致豆腐腐败。
4．下列有关泡菜的制作和亚硝酸盐含量测定实验的叙述，正确的是(　　)
A．将新鲜蔬菜与煮沸冷却的盐水(盐和清水的质量比为4∶1)混匀装瓶
B．发酵过程始终要保持密封状态，泡菜坛盖边缘的水槽中要始终装满水
C．在酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应形成玫瑰红色沉淀
D．随发酵进行，亚硝酸盐含量逐渐增加，用比色法可进行亚硝酸盐含量的测定
解析：选B　泡菜制作中应先加蔬菜，再加盐水，且盐与水的质量比为1∶4；由于乳酸菌严格厌氧，因此发酵过程始终要保持密封状态，泡菜坛盖边缘的水槽中要始终装满水；在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N­1­萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料；随发酵进行，亚硝酸盐含量先逐渐增加，后又逐渐降低，最终趋于稳定，用比色法可进行亚硝酸盐含量的测定。
5．(2019·临沂联考)下列有关传统发酵技术的叙述，正确的是(　　)
A．在果酒的制作过程中，应先去除葡萄的枝梗，再进行多次反复冲洗，这样才可以洗得彻底
B．果酒、果醋的发酵装置中，充气口的作用是在发酵时连接充气泵进行充气，排气口的作用是在酒精发酵时排出二氧化碳
C．豆腐上布满毛霉菌丝后，需加盐腌制8天左右，这样可以抑制微生物的生长，避免豆腐变质，又能使豆腐析出水分，使豆腐块变硬
D．制作泡菜时要选火候好、无裂纹、无砂眼、盖子吻合好的坛子，需要加水密封，目的是隔绝空气，抑制杂菌繁殖
解析：选C　在果酒的制作过程中，应先冲洗葡萄，然后再去除葡萄的枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会，且冲洗以洗去灰尘为目的，不能多次反复冲洗，以防洗去附着在葡萄皮上的野生型酵母菌；果酒、果醋的发酵装置中，充气口的作用是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气，排气口的作用是在酒精发酵时排出二氧化碳；豆腐上布满毛霉菌丝后，需加盐腌制8天左右，这样可以抑制微生物的生长，避免豆腐变质，又能析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬；制作泡菜时需要加水密封，目的是隔绝空气，以保证乳酸菌发酵所需的无氧环境。
6．利用卷心菜发酵制作泡菜过程中，乳酸菌、酵母菌细胞数量和pH的变化如图所示。下列叙述错误的是(　　)

A．酵母菌和乳酸菌均有核膜包被的细胞核
B．发酵初期乳酸菌建立了明显的菌种优势
C．前6天pH下降主要由乳酸菌代谢引起
D．发酵中期酵母菌通过无氧呼吸获取能量
解析：选A　乳酸菌是原核生物，细胞内没有核膜包围的细胞核；根据曲线图中乳酸菌和酵母菌的数量变化曲线对比分析可知，发酵初期乳酸菌远多于酵母菌，所以乳酸菌成为了明显的优势菌种；结合曲线图分析，前6天，由于乳酸菌远多于酵母菌，其产生的乳酸会降低培养液的pH；由于整个发酵过程都是在无氧环境条件下进行的，在发酵中期(22～26天)，酵母菌只能通过无氧呼吸获取能量。
二、高考题型练
7．下面是果酒和果醋制作的实验流程和发酵装置。根据图示回答下列问题：

(1)完成图1中的实验流程。
(2)图2装置中的充气口在__________过程中要关闭，否则可能发生使发酵液变酸的反应________________________________________________(写出该反应式)，而排气口在该过程中应开放，排气口要通过一个长而弯曲的胶管与排气管连接，目的是________________________________________________。
(3)葡萄酒呈现红色的原因是________________________，重铬酸钾在酸性条件下与酒精反应呈________色。
(4)果酒和果醋的制作分别利用了酵母菌和____________两种微生物的发酵原理，后者在结构上的主要特点是______________________________________。
解析：在酒精发酵阶段，充气口应关闭，否则醋酸菌会将乙醇氧化为醋酸，从而使发酵液变酸。酵母菌为真菌，属于真核生物，醋酸菌为细菌，属于原核生物，两者在结构上的主要区别是有无以核膜为界限的细胞核。
答案：(1)醋酸发酵　(2)酒精发酵　C2H5OH＋O2―→CH3COOH＋H2O　避免空气中其他微生物进入发酵装置(防止空气中的微生物污染)　(3)红色葡萄皮中的色素溶解在发酵液中　灰绿　(4)醋酸菌　无以核膜为界限的细胞核
8．(2019·济南模拟)利用不同微生物的发酵作用制作食品，一般称为传统发酵技术。回答下列问题：
(1)果酒发酵时酵母菌能在发酵液中生长繁殖，而其他绝大多数微生物则不可以，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)进行果醋深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡，醋酸菌的代谢类型属于________________型。
(3)腐乳制作时，从微生物培养的角度分析，豆腐相当于________________，豆腐中的脂肪可作为微生物生长所需的________。制作腐乳还要进行卤汤腌制，卤汤由酒和香辛料配制而成，这些材料不仅可以调制腐乳的风味，还具有________________________的作用。卤汤中的酒可以选用料酒、黄酒、米酒、高粱酒等，含量一般控制在________左右。
(4)泡菜腌制时可利用________法随时检测泡菜中亚硝酸盐的含量，原理是在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸反应后再与N­1­萘基乙二胺盐酸盐结合呈现________色。
解析：(1)酵母菌通过无氧呼吸产生酒精和二氧化碳，使得发酵液呈现酸性，在缺氧、呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长，而绝大多数其他微生物生长受到抑制。(2)根据题意分析，醋酸发酵时，短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡，说明醋酸菌的代谢类型是异养需氧型。(3)腐乳制作时，从微生物培养的角度分析，豆腐相当于固体培养基，豆腐中的脂肪可作为微生物生长所需的碳源。制作腐乳还要进行卤汤腌制，卤汤由酒和香辛料配制而成，这些材料不仅可以调制腐乳的风味，还具有抑制微生物生长的作用。卤汤中的酒含量一般控制在12%左右。(4)检测泡菜腌制时产生的亚硝酸盐可以用比色法，即在盐酸酸化的条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸反应后再与N­1­萘基乙二胺盐酸盐结合呈现玫瑰红色。
答案：(1)在缺氧、呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长，而绝大多数其他微生物生长受到抑制　(2)异养需氧
(3)固体培养基　碳源(或碳源和能源)　抑制微生物生长　12%　(4)比色　玫瑰红
9．中央电视台热播的美食纪录片《舌尖上的中国》受到广大观众的热捧，其中介绍的腐乳是我国独特的传统发酵食品，几百年来深受老百姓的喜爱。腐乳是用豆腐发酵制成，民间老法生产腐乳为自然发酵，现代腐乳生产多采用优良的毛霉菌种进行发酵。现代化生产流程如图。请回答下列问题：

(1)含水量为________左右的豆腐适合用来做腐乳。含水量过高的豆腐不适宜制作腐乳，原因是________________。
(2)传统制作腐乳，豆腐块上的毛霉来自________________________，现代腐乳生产是在严格______的条件下，将优良的毛霉菌种直接接种在豆腐上。
(3)现代化生产流程中扩大培养时使用的培养基与毛霉菌种分离时使用的培养基最大的区别是后者培养基中加入了________。
(4)影响腐乳的风味和质量的因素有________________________________(至少列举两项)。
(5)腐乳因加入的辅料不同而产生不同的风味，如红方因加入了________而味厚醇香；________因不加辅料，用豆腐本身渗出的水加盐腌制而成，因而绵软油滑，异臭奇香。
解析：(1)含水量为70%左右的豆腐适合用来做腐乳，含水量过高的豆腐不适宜制作腐乳，原因是豆腐不容易成形。(2)传统制作腐乳，豆腐块上的毛霉来自空气中的毛霉孢子，现代腐乳生产是在严格无菌的条件下，将优良的毛霉菌种直接接种在豆腐上。(3)现代化生产流程中扩大培养时使用的培养基与毛霉菌种分离时使用的培养基最大的区别是后者培养基中加入了琼脂。(4)影响腐乳的风味和质量的因素有盐的用量、酒的用量、发酵温度、发酵时间等。盐的浓度过低，不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高，会影响腐乳的口味。后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过腌制并配入各种辅料(红曲、面曲、酒酿)，使蛋白酶作用缓慢，促进其他生化反应，生成腐乳的香气。(5)腐乳因加入的辅料不同而产生不同的风味，如红方因加入了红曲而味厚醇香；青方因不加辅料，用豆腐本身渗出的水加盐腌制而成，因而绵软油滑，异臭奇香。
答案：(1)70%　豆腐不容易成形　(2)空气中的毛霉孢子　无菌　(3)琼脂　(4)盐的用量、酒的用量、发酵温度、发酵时间等　(5)红曲　青方
10．(2019·东营模拟)我国是桑椹种植大国，桑椹品种、产量均居世界首位。桑椹果实富含白黎芦醇、花青素等有良好防癌、抗衰老功效的物质，以桑椹果实为原料进行发酵制作果酒和果醋，既开发了桑椹的保健价值，又解决了桑椹果实难以保存的问题。如图为发酵过程示意图，请据图回答有关问题：

(1)处理桑椹果实时，应清洗后再除去枝梗，目的是防止________________。
(2)为了优化发酵工艺，科研人员研究了酵母菌接种量对果酒中酒精度的影响，结果如表：
酵母菌接种量(%)
5
10
15
20
25
酒精度(%)
5.05
5.41
5.37
5.21
5.13

由表可知，酵母菌接种量为____%时，果酒的酒精度最高；当酵母菌接种量过高时，果酒的酒精度会随接种量增大而下降，分析其原因是______________________________。果汁发酵后是否有酒精产生，可以用________________来检测。
(3)在发酵得到的桑椹果酒中接种醋酸菌，醋酸菌在____________条件下，可将乙醇转变为________，进而生成醋酸。
解析：(1)处理桑椹果实时，为防止杂菌污染，应清洗后再除去枝梗。(2)根据表中数据可知，酵母菌接种量为10%时，果酒的酒精度最高；当酵母菌接种量过高时，酵母菌种内斗争加剧，影响酒精生成，从而导致果酒的酒精度会随接种量增大而下降。果汁发酵后是否有酒精产生，可以用酸性的重铬酸钾来检测。如果颜色由橙色变成灰绿色，说明有酒精产生。(3)在发酵得到的桑椹果酒中接种醋酸菌，醋酸菌在氧气充足条件下，可将乙醇转变为乙醛，进而生成醋酸。
答案：(1)杂菌污染　(2)10　酵母菌种内斗争加剧，影响酒精生成　酸性的重铬酸钾　(3)氧气充足　乙醛
11．(2019·滨州模拟)科研人员通过实验研发含盐低，同时又保持产品质量与风味的低盐腐乳，过程如下：①筛选分离菌种：将待筛选的菌种涂布到特定的选择培养基上进行分离，挑选菌种接种于酪蛋白培养基上筛选出蛋白酶活力高的毛霉菌株。②菌种扩大培养：将毛霉接种在斜面培养基上，培养一段时间后将菌种制成悬液，加一定浓度的盐水调节菌种数。③将含菌种的液体喷洒在豆腐块上，然后培养、装瓶、腌制。④腐乳品质评定：通过氨基酸态氮含量和感官评价对腐乳品质进行综合评定，结果如图，请分析回答：

(1)毛霉的同化类型是________，豆腐块为毛霉的生长提供的营养物质有________________________。
(2)腐乳制作的原理主要是利用微生物产生的____________________(酶)，氨基酸态氮含量可代表________________________。
(3)步骤①中，毛霉产生的酶能将酪蛋白分解而产生透明圈，在酪蛋白培养基中筛选到三个单菌落甲、乙、丙，其菌落直径分别为3.2 cm、2.8 cm、2.9 cm，其菌落与透明圈一起的直径分别为3.7 cm、3.5 cm、3.3 cm。应选择菌落________(填“甲”“乙”或“丙”)作为产蛋白酶活力高的毛霉候选菌。
(4)据图分析盐含量为________左右适宜制作腐乳；盐含量不宜过低，其原因是盐含量过低________________________________。
解析：(1)毛霉的同化类型属于异养型，豆腐块为毛霉的生长提供的营养物质有碳源、氮源、水分和无机盐。(2)腐乳制作的原理主要是利用微生物产生的蛋白酶、脂肪酶，氨基酸态氮含量可代表蛋白质的分解情况。(3)根据菌落直径和菌落与透明圈一起的直径可以计算透明圈的大小，甲、乙、丙的透明圈径长分别为3.7－3.2＝0.5(cm)、3.5－2.8＝0.7(cm)、3.3－2.9＝0.4(cm)，蛋白酶活力越高，透明圈越大，因此应选择菌落乙作为产蛋白酶活力高的毛霉候选菌。(4)腐乳的质量需要通过氨基酸态氮含量和感官评价对腐乳品质进行综合评定，由曲线图可知，腐乳的盐含量约为11%较为适宜；盐含量过低不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质。
答案：(1)异养　碳源、氮源、水分和无机盐　(2)蛋白酶、脂肪酶　蛋白质的分解情况　(3)乙　(4)11%　不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质
12．乳酸菌能产生亚硝酸还原酶将亚硝酸盐分解，某兴趣小组从泡菜滤液中筛选出亚硝酸盐还原酶活力较高的乳酸菌，进行了相关实验。请回答下列问题：
(1)为保证泡菜发酵过程中的无氧环境，在装坛发酵前后需要检查泡菜坛____________________，并对泡菜坛进行________________处理，在腌制过程中，坛中会出现溶液量增多现象，主要原因是__________________________。
(2)将筛选出的乳酸菌，用于泡菜制作过程，进行食盐用量与亚硝酸盐含量的探索实验，结果如图。

①泡菜制作过程中，pH呈下降趋势，原因是乳酸菌发酵在第________阶段产生________。
②据图可知，腌菜时食盐的浓度越低，亚硝酸盐含量的峰值出现得越早，且峰值较高，原因是________________________。
③实验结果说明，食盐用量和________________影响亚硝酸盐含量，亚硝酸盐含量达到峰值后下降，一方面是因为________________环境抑制杂菌生长，使亚硝酸盐的产生量降低；另一方面是因为__________________________。
解析：(1)为保证泡菜发酵过程中的无氧环境，在装坛发酵前后需要检查泡菜坛有无裂纹和砂眼，并对泡菜坛进行用水密封坛口处理，在腌制过程中，坛中会出现溶液量增多现象，主要原因是外界溶液浓度高使蔬菜细胞渗透失水。(2)①泡菜制作的原理是乳酸菌的无氧呼吸，无氧呼吸第二阶段产生了乳酸，导致pH呈下降趋势。②食盐用量过低，会造成细菌大量繁殖，因此图中腌菜时食盐的浓度越低，亚硝酸盐含量的峰值出现得越早，且峰值较高。③据图分析可知，食盐用量和腌制时间都会影响亚硝酸盐含量，亚硝酸盐含量达到峰值后下降，是因为缺氧和酸性环境抑制杂菌生长，使亚硝酸盐的产生量降低，同时乳酸菌产生亚硝酸还原酶会将亚硝酸盐分解。
答案：(1)有无裂纹和砂眼　用水密封坛口　外界溶液浓度高使蔬菜细胞渗透失水　(2)①二　乳酸　②食盐用量过低，造成细菌大量繁殖　③腌制时间　缺氧和酸性　乳酸菌产生亚硝酸还原酶将亚硝酸盐分解