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2021新高考生物人教版一轮学案：选择性必修部分模块3第2单元第1讲 基因工程
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第二单元 现代生物科技
第1讲 基因工程
考纲研读备考定位
考纲要求
核心素养
1.简述基因工程的诞生。
2.简述基因工程的原理及技术。
3.举例说出基因工程的应用。
4.简述蛋白质工程。
5.活动：DNA的粗提取和鉴定。
6.活动：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
1.生命观念——结构决定功能：基因的结构与功能。
2.理性思维——建立模型：理解基因工程的操作流程。
3.科学探究——解决问题：基因工程的应用和蛋白质工程。学会细胞中的DNA的提取和鉴定方法，学习PCR技术原理和操作。
考点一 基因工程的操作工具
1．基因工程的概念理解
(1)供体：提供目的基因。
(2)操作环境：体外。
(3)操作水平：分子水平。
(4)原理：基因重组。
(5)受体：表达目的基因。
(6)本质：性状在受体体内表达。
(7)优点
①与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
②与诱变育种相比：定向改造生物遗传性状。
2．DNA重组技术的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②作用：识别特定的核苷酸序列并切开相应两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
③结果：产生黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
①种类：
常用类型
E·coli DNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
功能
只缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端
结果
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
②作用：在两个核苷酸之间形成磷酸二酯键以连接两段DNA片段。
(3)载体
①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒特点
易错整合，判断正误。
(1)E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( × )
(2)限制酶也可以识别和切割RNA( × )
(3)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶( × )
(4)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因( × )
(5)每个质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点( √ )
下图中的图1和图2分别表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图，据图分析：
(1)请说出EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列及切割的位点。
(2)以上实例说明限制酶有何特性？
[提示](1)EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间。
(2)说明限制酶具有专一性。
1．基因工程的理论基础
2．基因工程的工具酶
(1)几种酶的比较
比较项目
限制酶
DNA连接酶
DNA 聚合酶
解旋酶
DNA(水解)酶
作用底物
DNA分子
DNA分子片段
脱氧核苷酸
DNA分子
DNA分子
作用部位
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对间的氢键
磷酸二酯键
作用结果
产生黏性末端或平末端
形成重组DNA分子
形成新的DNA分子
形成单链DNA分子
形成游离的脱氧核苷酸
(2)限制酶与DNA连接酶的关系
■
关于工具酶的五个注意点
(1)限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。
(2)为使目的基因与载体形成相同的DNA片段末端连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，但如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则两末端也可连接。
(3)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(4)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(5)DNA连接酶起作用时，不需要模板。
3．载体
(1)载体种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒，最常用的载体是质粒。
(2)作用
①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。
②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
(3)作为载体的条件
条件
适应性
稳定存在并能复制
目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因
便于重组DNA的鉴定和选择
■
(1)与膜载体的区别：基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
(2)载体上标记基因的标记原理：
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：
例1 (全国卷Ⅲ，40)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRI、BamHI和Sau3AI三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRI、Sau3AI的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHI酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接，理由是两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有甲和丙，不能表达的原因是甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有E·coli_DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶。
[解析] (1)由图(a)可知，尽管BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶的识别序列不相同，但两种酶切割后产生的DNA片段具有相同的黏性末端，故被BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与图(b)中表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)运载体上的启动子和终止子具有调控目的基因表达的作用，由于甲和丙的目的基因分别插入在启动子的上游和终止子的下游，所以这两个运载体上的目的基因都不能被转录和翻译。(3)常见的DNA连接酶是E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，但作用有所差别，T4DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端，而E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端。
技巧点拨
确定限制酶种类的两种方法
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
〔对应训练〕
1．(全国卷Ⅰ，40)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有能自我复制(能稳定遗传)、具有标记基因(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长；并且含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)的细胞也是不能区分的，其原因是二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自受体细胞。
[解析] (1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件：具有一个或多个限制酶切位点，具有标记基因，能够在宿主细胞中复制并表达等。(2)在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr。目的基因的插入破坏了质粒载体的Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌区分。(3)噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成DNA，需借助宿主细胞完成DNA复制。
考点二 基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的获取
①目的基因：主要是指编码蛋白质的基因。
②获取方法：
a．直接分离法：从自然界已有的物种中分离，如从基因组文库或部分基因文库中获取。
b．人工合成：
ⅰ.如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
ⅱ.以RNA为模板，在逆转录酶的作用下人工合成。
③扩增目的基因：利用PCR技术扩增目的基因。
(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心
①基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因。
a．启动子
ⅰ.位置：位于基因的首端。
ⅱ.作用：是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
b．终止子
ⅰ.位置：位于基因的尾端。
ⅱ.作用：使转录在所需要的地方停止下来。
②构建目的
a．使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；
b．使目的基因能够表达和发挥作用。
(3)将目的基因导入受体细胞
①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
②常用方法(连线)
(4)目的基因的检测与鉴定
方法
检测或鉴定目的
水平
DNA分子杂交技术
检测目的基因的有无
分子水平
分子杂交技术
目的基因是否转录
抗原—抗体杂交技术
目的基因是否翻译
生物性状的表达与否
目的基因是否表达
个体水平
易错整合，判断正误。
(1)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体( × )
(2)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达( √ )
(3)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术( √ )
(4)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达( × )
(5)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株( √ )
据图分析抗虫棉的培养过程
(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？
(2)该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？
(3)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？
[提示](1)目的基因是Bt毒蛋白基因，载体是Ti质粒。用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的黏性末端，便于构建基因表达载体。
(2)采用的方法是农杆菌转化法，由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了T－DNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。
(3)抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。
1．基因表达载体的构建
①基因表达载体的组成
(3)将目的基因导入受体细胞
生物种类
植物
动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
感受态细胞法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
2．目的基因的检测与鉴定
3．基因组文库与cDNA文库的比较
文库类型
cDNA文库
基因组文库
构建基因文库的过程
文库大小
小
大
基因中启动子
无
有
基因中内含子
无
有
基因多少
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
物种间的基因交流
可以
部分基因可以
说明
基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性
■
关于基因工程的四个注意点
(1)限制酶剪切目的基因与质粒的次数不同：获取一个目的基因需限制酶剪切2次，共产生4个黏性末端或平末端，切割质粒则只需要限制酶剪切1次，因为质粒是环状DNA分子，而目的基因在DNA分子链上。
(2)基因工程操作过程中只有第三步没有碱基互补配对现象；第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步存在分子水平杂交检测。
例2 (2017·全国卷Ⅰ，38)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快、容易培养(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是蛋白A的抗体(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。
[解析] (1)人为真核生物，从人的基因组文库中获取的基因A含有内含子，基因A转录出的产物中有与内含子对应的RNA序列。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，因此以大肠杆菌作为受体细胞，不能切除内含子对应的RNA序列，无法表达出蛋白A。(2)噬菌体和动物病毒均可作为基因工程的载体，但它们的宿主细胞不同。题中受体为家蚕，是一种昆虫，因此，选择昆虫病毒作为载体，噬菌体的宿主是细菌，不适合作为该实验的载体。(3)大肠杆菌具有繁殖快、容易培养、单细胞、遗传物质少等优点，因此，常作为基因工程的受体细胞。(4)常用抗原——抗体杂交的方法检测目的基因是否表达，故能用于检测蛋白A的物质为蛋白A的抗体。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型菌的DNA转移到了R型菌体内，其对基因工程理论的建立提供的启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。
易错提醒
(1)限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的碱基序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)切取目的基因与切割载体时并非“只能”使用“同一种酶”①在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性(或平)末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
②为了防止载体或目的基因的末端自己连接即所谓“环化”，可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的末端。
(3)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
①启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别、结合的部位。
②终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端。作用是使转录过程停止。
③起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
(4)目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因的插入位点应在启动子与终止子之间，若目的基因插在启动子内部，启动子将失去原功能。
〔对应训练〕
2．(2020·山东省普通高中学业水平等级考试)研究人员用三种基因探针，通过分子杂交技术分别对某动物三种细胞中的mRNA进行检测，结果如下表所示。下列说法错误的是( C )
细胞
杂交带
探针
输卵管细胞
未成熟红细胞
胰岛B细胞
卵清蛋白基因探针
有
无
无
β－珠蛋白基因探针
无
有
无
胰岛素基因探针
无
无
有
A.三种探针的核苷酸序列不同
B．有杂交带出现表明相应基因发生了转录
C．用上述探针分别检测三种细胞的DNA，实验结果不变
D．可用mRNA逆转录产生的DNA制作相应基因的探针
[解析] 三种基因不同，三种探针的核苷酸序列也不相同，A正确；由题意可知，用基因探针检测的是三种细胞的mRNA，若出现杂交带说明该细胞中出现mRNA，即细胞发生了特定基因的转录，B正确；三种细胞来自同一生物体，则三种细胞所含DNA相同，若用上述探针检测三种细胞中的DNA，均会出现杂交带，C错误；分子探针可以通过逆转录过程获得，D正确。
3．(2018·山东省菏泽市高三期末)糖尿病发病率在我国近30年来增长极为迅速，发病的年龄大大提前，这与人们不健康的生活方式有关，同时也与患者体内胰岛素的缺乏有关。生产速效胰岛素以及利用转基因技术实现胰岛素的批量生产就成为了目前治疗糖尿病的新思路，回答下列有关问题：
(1)速效胰岛素的获得是科学家将胰岛素B链的第28与第29个氨基酸调换顺序后实现的。该过程中，需要对胰岛素基因(填“胰岛素”“胰岛素基因”或“胰岛”)进行定向改造。
(2)利用转基因技术实现胰岛素的批量生产，其关键操作环节是基因表达载体的构建。
(3)对于胰岛素基因的获取，一是通过从胰岛B细胞中提取合成的胰岛素mRNA，经过逆转录过程合成；二是通过分析胰岛素的氨基酸序列，进行人工合成。利用上述两种方法获得的基因结构不同(填“相同”或“不同”)。
(4)为了将改造后的分子顺利导入大肠杆菌体内，一般需要用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之成为感受态细胞。若将重组的DNA导入植物细胞可采用的方法有农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法(写出两种)。
考点三 基因工程的应用和蛋白质工程及PCR技术
1．基因工程的应用
(1)转基因植物
植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力(如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等)，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。
(2)转基因动物
动物基因工程在动物品种改良、建立生物反应器、器官移植等方面显示了广阔的应用前景。
(3)基因工程药物
①来源：转基因的工程菌。
②成果：细胞因子、抗体、疫苗、激素等。
③作用：用来预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、糖尿病、类风湿等疾病。
(4)基因治疗
①方法：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能。
②效果：治疗遗传病的最有效的手段。
③分类：体内基因治疗和体外基因治疗。
2．蛋白质工程
(1)概念理解
①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
②操作：基因修饰或基因合成。
③结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。
④目的：满足人类的生产和生活的需求。
(2)操作过程
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)→基因表达→产生需要的蛋白质。
易错整合，判断正误。
(1)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株( √ )
(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中( × )
(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用( × )
(4)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质( √ )
(5)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构( × )
1．蛋白质工程与基因工程的关系
项目
蛋白质工程
基因工程
区别
过程
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列
获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
联系
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造
■
二者都属于分子水平的操作，蛋白质工程的本质是通过改造基因进而形成自然界不存在的蛋白质，所以被形象地称为第二代基因工程。
2．基因治疗与基因诊断
原理
操作过程
进展
基因治疗
基因表达
利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗
临床实验
基因诊断
碱基互补配对
制作特定DNA探针与病人样品DNA混合分析杂交带情况
临床应用
3.利用PCR技术扩增目的基因
(1)PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
(2)目的：短时间内大量扩增目的基因。
(3)原理：DNA双链复制。
(4)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。
(5)过程
过程
说明
图解
变性
温度上升到90 ℃左右，双链DNA解聚为单链
复性
温度下降到55 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸
温度上升到72 ℃左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸
例3 (2017·全国卷Ⅱ，38)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩叶组织细胞易破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。
[解析] (1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是相对于老叶而言嫩叶组织细胞更容易被破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。(2)以mRNA为材料获得cDNA的原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点且目的基因无表达所需启动子。(4)DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。(5)若获得的转基因植株不具备所期望的性状表现，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。
〔对应训练〕
3．(2019·全国卷Ⅰ，38)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括基因组文库和cDNA文库。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是解旋酶。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是加热至90～95_℃。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的氢键。
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活。
[解析] (1)基因工程中的基因文库包括基因组文库和部分基因文库(cDNA文库)。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，通过解旋酶解开DNA双链。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，通过高温(90～95 ℃)使反应体系中的模板DNA解链为单链。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的氢键。(3)大肠杆菌DNA聚合酶不耐高温，在高温下会失活，而PCR反应体系中加入的聚合酶需耐高温，故在PCR反应中要用能耐高温的Taq酶。
考点四 DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
2．操作流程
易错整合，判断正误。
(1)DNA溶解度随NaCl浓度的增大而增大( × )
(2)猪血细胞是DNA粗提取的良好材料( × )
(3)进行DNA粗提取和鉴定实验时，加入洗涤剂后用力进行快速、充分的研磨( × )
(4)洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度( × )
(5)将制备的含有DNA的滤液加入60～75 ℃的恒温水浴箱中保温10～15 min，可以将DNA析出( × )
下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作，请仔细观察并分析：
(1)操作①和④都是加入蒸馏水，其目的一样吗？
(2)操作②中加入酒精的目的是什么？此时搅拌要注意什么？
(3)操作③中的黏稠物是如何获取的？加入2 mol/LNaCl的目的是什么？
[提示](1)不一样。①是使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质；④是稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14 mol·L－1，去除溶于低浓度NaCl溶液的杂质。
(2)②中加入酒精的目的是析出DNA，去除其中溶于酒精的杂质，这时候搅拌要沿一个方向，轻缓的进行。
(3)黏稠物是经过单层纱布过滤获得的；加入2 mol/L NaCl的目的是使DNA再次溶解。
1．DNA和蛋白质在不同NaCl溶液中的溶解度比较
2 mol/L NaCl溶液
0.14 mol/L NaCl溶液
溶解规律
DNA
溶解
析出
蛋白质
部分发生盐析沉淀
溶解
NaCl溶液浓度从2 mol/L降低过程中，溶解度逐渐增大
2.DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”
加蒸馏水2次
①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；
②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14 mol/L，使DNA析出
用纱布过滤4次
①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②过滤用2 mol/L的NaCl溶液充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；③滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
用NaCl溶液4次
①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
例4 下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验过程中的一些重要操作示意图，据图回答下列有关该实验的问题。
(1)正确的操作顺序是C→B→E→D→A (用字母和箭头表示)。
(2)上图C、E步骤都加入蒸馏水，但其目的不同，分别是加速细胞的破裂和降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出。
(3)上图A步骤中的酒精必须是经过充分预冷的才能使用，该步骤的目的是提取含杂质较少(或较纯净)的DNA。
(4)为鉴定A中所得到的丝状物的主要成分为DNA，可用浓NaCl溶液溶解后滴加二苯胺试剂，混合均匀后沸水浴，如果出现蓝色则证明该丝状物的主要成分为DNA。
〔对应训练〕
5．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
试管
序号
A
B
1
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2
不加
加入提取的DNA丝状物并搅拌
3
加4 mL二苯胺，混匀
加4 mL二苯胺，混匀
4
沸水浴5 min
沸水浴5 min
实验现象
溶液不变蓝色
溶液逐渐变蓝色
实验结论
DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色
(1)根据上图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？溶液颜色基本不变。
(3)在沸水浴中加热的目的是加快颜色反应速度，同时说明DNA对高温有较强的耐受性。
(4)A试管在实验中的作用是对照。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与加入试管中的DNA(丝状物)的多少有关。
[解析] B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，其他条件均完全相同，A、B两试管形成对照。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。
课末总结
1．〔思维导图〕
2．〔简答题常考长句分析〕
1．限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键。
2．质粒是常用的载体，它是一种小型的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。
3．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点。
4．培育转基因动物时，受体细胞必须是受精卵；培育转基因植物时，受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。
5．目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法。
6．目的基因到了另一种生物体内能够成功表达的原理是所有生物共用一套遗传密码。
3．〔探究高考·明确考向〕
1．(2019·江苏卷，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( A )
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
[解析] 哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核，细胞内基本不含DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A项错误。DNA析出过程中，搅拌要轻柔，以防止DNA断裂，B项正确。DNA不溶于冷乙醇，向DNA提取液中加入适量预冷的乙醇溶液，会使DNA析出，从而进一步提纯DNA，C项正确。向溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热数分钟，溶液出现蓝色，D项正确。
2．(2019·江苏卷，16)下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是( D )
A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌
B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株
C．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛
D．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗
[解析] 基因工程菌中含目的基因，能通过繁殖遗传给子代，A项不符合题意。经组培获得的转基因植株的细胞中都含目的基因，能够遗传给子代，B项不符合题意。培育得到的转基因奶牛的细胞中都含目的基因，故能遗传给子代，C项不符合题意。由题干信息可知，进行题述基因治疗时只有淋巴细胞含目的基因，生殖细胞不含目的基因，故不能遗传给子代，D项符合题意。
3．(2019·江苏卷，33)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：
图1
(1)EcoR V酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为平末端。
(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为胸腺嘧啶(T)的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在DNA连接酶作用下，形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是B(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是A类菌落含有P0、C类菌落未转入质粒。
菌落类型
平板类型
A
B
C
无抗生素
＋
＋
＋
氨苄青霉素
＋
＋
－
四环素
＋
－
－
氨苄青霉素＋四环素
＋
－
－
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是乙丙。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是目的基因反向连接。
图2
[解析] (1)从图中可以看出，EcoR Ⅴ酶切出来的载体质粒为平末端。(2)从图中可以看出，目的基因的两端各有一个游离的腺嘌呤脱氧核苷酸，由于载体P1为平末端，所以载体P1的两端应该各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸，这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P1连接起来。(3)由题意可知，构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏，所以导入目的基因的菌落只能在没有抗生素或含有氨苄青霉素的培养基中存活，应该选B类菌落。A类菌落能在表中条件下存活，说明导入的是P0质粒。C类菌落只能在无抗生素的培养基中存活，说明C类菌落没有导入质粒。(4)据图分析，目的基因的外侧链只能用丙作引物，内侧链可用甲、乙作引物，若选用另一对甲、乙作引物，会出现目的基因反接扩增出的DNA片段为400 bp，则正好是目的基因反向连接后，外侧链用乙作引物，内侧链用甲作引物扩增出的片段。
4．(2018·全国卷Ⅰ，38)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的转化方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。
[解析] (1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是基因工程。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。
(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca2＋参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。
(3)为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。
5．(2018·全国卷Ⅱ，38)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是E1和E4。使用这两种酶进行酶切是为了保证甲的完整，也是为了保证甲与载体正确连接。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
[解析] (1)由题意可知，L1基因和GFP基因合成了L1GFP融合基因(简称为甲)，题图中显示了四个酶切位点，当将L1GFP融合基因插入质粒P0时，可用E1和E4限制酶进行酶切，用这两种酶进行酶切不会破坏甲的完整性，同时能保证甲按照正确的方向与载体连接。(2)若在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1GFP融合基因得到表达，即目的基因在受体细胞中通过转录和翻译合成了荧光蛋白。(3)为了获得含有甲的牛，可将含有目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中，然后进行体外培养、胚胎移植等。(4)利用PCR技术扩增目的基因，可以检测目的基因是否存在。PCR扩增的模板是DNA。
6．(2018·江苏， 32)为生产具有特定性能的α淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备α淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增α淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA。
(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连。
(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中②的设定与引物有关，⑥的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)
①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度 ④变性时间 ⑤退火时间 ⑥延伸时间
(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：
5′－U……3′
图中虚线框内mRNA片段包含8个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有13种。
(5)获得工程菌表达的α淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：
缓冲液
50 mmol/L
Na2HPO4KH2PO4
50 mmol/L
TrisHCl
50 mmol/L
GlyNaOH
pH
6.0
6.5
7.0
7.5
7.5
8.0
8.5
9.0
9.0
9.5
10.0
10.5
酶相对活性%
25.4
40.2
49.8
63.2
70.1
95.5
99.5
85.3
68.1
63.7
41.5
20.8
根据上述实验结果，初步判断该α淀粉酶活性最高的条件为pH为8.5，缓冲液为50_mmol/L_TrisHCl。
[解析] (1)利用 PCR 技术扩增α淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA作为模板，并依据α淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。
(2)利用PCR技术扩增DNA时，只能从3′端延伸DNA子链，为了便于扩增的 DNA 片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接。
(3)PCR技术包括变性、退火(复性)和延伸三步，变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链，且时间很短；退火时引物结合到互补的DNA单链上，退火温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及其浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在1 kb以内的延伸时间为1 min左右，3～4 kb的延伸时间为3～4 min。
(4)图中虚线框内共含有24个碱基，mRNA上决定一种氨基酸的三个相邻的碱基为一个密码子，故共包含8个密码子。虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U，第2和第3个碱基各有4种可能性，因此共16种可能性。题干表明控制α淀粉酶的基因有1 656个碱基对，说明图中虚线框后的第一个密码子肯定不是终止密码子(3种终止密码子为UAA、UAG、UGA)，故虚线框后第一个密码子实际最多有16－3＝13种可能性。
(5)分析表格中的数据，酶相对活性最高为99.5%，对应的条件是pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L TrisHCl。
第二单元 现代生物科技
第1讲 基因工程
考纲研读备考定位
考纲要求
核心素养
1.简述基因工程的诞生。
2.简述基因工程的原理及技术。
3.举例说出基因工程的应用。
4.简述蛋白质工程。
5.活动：DNA的粗提取和鉴定。
6.活动：利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
1.生命观念——结构决定功能：基因的结构与功能。
2.理性思维——建立模型：理解基因工程的操作流程。
3.科学探究——解决问题：基因工程的应用和蛋白质工程。学会细胞中的DNA的提取和鉴定方法，学习PCR技术原理和操作。
考点一 基因工程的操作工具
1．基因工程的概念理解
(1)供体：提供目的基因。
(2)操作环境：体外。
(3)操作水平：分子水平。
(4)原理：基因重组。
(5)受体：表达目的基因。
(6)本质：性状在受体体内表达。
(7)优点
①与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
②与诱变育种相比：定向改造生物遗传性状。
2．DNA重组技术的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)
①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②作用：识别特定的核苷酸序列并切开相应两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
③结果：产生黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
①种类：
常用类型
E·coli DNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
功能
只缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端
结果
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
②作用：在两个核苷酸之间形成磷酸二酯键以连接两段DNA片段。
(3)载体
①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒特点
易错整合，判断正误。
(1)E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端( × )
(2)限制酶也可以识别和切割RNA( × )
(3)限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶( × )
(4)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因( × )
(5)每个质粒DNA分子上至少含一个限制酶识别位点( √ )
下图中的图1和图2分别表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图，据图分析：
(1)请说出EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列及切割的位点。
(2)以上实例说明限制酶有何特性？
[提示](1)EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间。
(2)说明限制酶具有专一性。
1．基因工程的理论基础
2．基因工程的工具酶
(1)几种酶的比较
比较项目
限制酶
DNA连接酶
DNA 聚合酶
解旋酶
DNA(水解)酶
作用底物
DNA分子
DNA分子片段
脱氧核苷酸
DNA分子
DNA分子
作用部位
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对间的氢键
磷酸二酯键
作用结果
产生黏性末端或平末端
形成重组DNA分子
形成新的DNA分子
形成单链DNA分子
形成游离的脱氧核苷酸
(2)限制酶与DNA连接酶的关系
■
关于工具酶的五个注意点
(1)限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。
(2)为使目的基因与载体形成相同的DNA片段末端连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，但如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则两末端也可连接。
(3)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(4)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(5)DNA连接酶起作用时，不需要模板。
3．载体
(1)载体种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒，最常用的载体是质粒。
(2)作用
①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。
②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
(3)作为载体的条件
条件
适应性
稳定存在并能复制
目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因
便于重组DNA的鉴定和选择
■
(1)与膜载体的区别：基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
(2)载体上标记基因的标记原理：
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：
例1 (全国卷Ⅲ，40)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRI、BamHI和Sau3AI三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRI、Sau3AI的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHI酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接，理由是两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有甲和丙，不能表达的原因是甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有E·coli_DNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶。
[解析] (1)由图(a)可知，尽管BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶的识别序列不相同，但两种酶切割后产生的DNA片段具有相同的黏性末端，故被BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与图(b)中表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)运载体上的启动子和终止子具有调控目的基因表达的作用，由于甲和丙的目的基因分别插入在启动子的上游和终止子的下游，所以这两个运载体上的目的基因都不能被转录和翻译。(3)常见的DNA连接酶是E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，但作用有所差别，T4DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端，而E·coliDNA连接酶只能连接黏性末端。
技巧点拨
确定限制酶种类的两种方法
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
〔对应训练〕
1．(全国卷Ⅰ，40)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有能自我复制(能稳定遗传)、具有标记基因(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长；并且含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)的细胞也是不能区分的，其原因是二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自受体细胞。
[解析] (1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件：具有一个或多个限制酶切位点，具有标记基因，能够在宿主细胞中复制并表达等。(2)在含有氨苄青霉素的培养基上，只有具有Ampr的大肠杆菌才能够生长。而Ampr位于质粒上，故未被转化的和仅含环状目的基因的大肠杆菌细胞中无Ampr，仅含有质粒载体的和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌均具有Ampr。目的基因的插入破坏了质粒载体的Tetr，故含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌不能在含有四环素的平板上生长，从而与仅含有质粒载体的大肠杆菌区分。(3)噬菌体是病毒，无细胞结构，无法自主合成DNA，需借助宿主细胞完成DNA复制。
考点二 基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的获取
①目的基因：主要是指编码蛋白质的基因。
②获取方法：
a．直接分离法：从自然界已有的物种中分离，如从基因组文库或部分基因文库中获取。
b．人工合成：
ⅰ.如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
ⅱ.以RNA为模板，在逆转录酶的作用下人工合成。
③扩增目的基因：利用PCR技术扩增目的基因。
(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心
①基因表达载体的组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因。
a．启动子
ⅰ.位置：位于基因的首端。
ⅱ.作用：是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
b．终止子
ⅰ.位置：位于基因的尾端。
ⅱ.作用：使转录在所需要的地方停止下来。
②构建目的
a．使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；
b．使目的基因能够表达和发挥作用。
(3)将目的基因导入受体细胞
①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
②常用方法(连线)
(4)目的基因的检测与鉴定
方法
检测或鉴定目的
水平
DNA分子杂交技术
检测目的基因的有无
分子水平
分子杂交技术
目的基因是否转录
抗原—抗体杂交技术
目的基因是否翻译
生物性状的表达与否
目的基因是否表达
个体水平
易错整合，判断正误。
(1)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体( × )
(2)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体上也未必能正常表达( √ )
(3)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术( √ )
(4)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达( × )
(5)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株( √ )
据图分析抗虫棉的培养过程
(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？
(2)该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？
(3)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？
[提示](1)目的基因是Bt毒蛋白基因，载体是Ti质粒。用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的黏性末端，便于构建基因表达载体。
(2)采用的方法是农杆菌转化法，由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了T－DNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。
(3)抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。
1．基因表达载体的构建
①基因表达载体的组成
(3)将目的基因导入受体细胞
生物种类
植物
动物
微生物
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
感受态细胞法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
2．目的基因的检测与鉴定
3．基因组文库与cDNA文库的比较
文库类型
cDNA文库
基因组文库
构建基因文库的过程
文库大小
小
大
基因中启动子
无
有
基因中内含子
无
有
基因多少
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
物种间的基因交流
可以
部分基因可以
说明
基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性
■
关于基因工程的四个注意点
(1)限制酶剪切目的基因与质粒的次数不同：获取一个目的基因需限制酶剪切2次，共产生4个黏性末端或平末端，切割质粒则只需要限制酶剪切1次，因为质粒是环状DNA分子，而目的基因在DNA分子链上。
(2)基因工程操作过程中只有第三步没有碱基互补配对现象；第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步存在分子水平杂交检测。
例2 (2017·全国卷Ⅰ，38)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快、容易培养(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是蛋白A的抗体(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。
[解析] (1)人为真核生物，从人的基因组文库中获取的基因A含有内含子，基因A转录出的产物中有与内含子对应的RNA序列。大肠杆菌为原核生物，没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，因此以大肠杆菌作为受体细胞，不能切除内含子对应的RNA序列，无法表达出蛋白A。(2)噬菌体和动物病毒均可作为基因工程的载体，但它们的宿主细胞不同。题中受体为家蚕，是一种昆虫，因此，选择昆虫病毒作为载体，噬菌体的宿主是细菌，不适合作为该实验的载体。(3)大肠杆菌具有繁殖快、容易培养、单细胞、遗传物质少等优点，因此，常作为基因工程的受体细胞。(4)常用抗原——抗体杂交的方法检测目的基因是否表达，故能用于检测蛋白A的物质为蛋白A的抗体。(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型菌的DNA转移到了R型菌体内，其对基因工程理论的建立提供的启示是DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体。
易错提醒
(1)限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的碱基序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)切取目的基因与切割载体时并非“只能”使用“同一种酶”①在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性(或平)末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
②为了防止载体或目的基因的末端自己连接即所谓“环化”，可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的末端。
(3)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
①启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别、结合的部位。
②终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端。作用是使转录过程停止。
③起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
(4)目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因的插入位点应在启动子与终止子之间，若目的基因插在启动子内部，启动子将失去原功能。
〔对应训练〕
2．(2020·山东省普通高中学业水平等级考试)研究人员用三种基因探针，通过分子杂交技术分别对某动物三种细胞中的mRNA进行检测，结果如下表所示。下列说法错误的是( C )
细胞
杂交带
探针
输卵管细胞
未成熟红细胞
胰岛B细胞
卵清蛋白基因探针
有
无
无
β－珠蛋白基因探针
无
有
无
胰岛素基因探针
无
无
有
A.三种探针的核苷酸序列不同
B．有杂交带出现表明相应基因发生了转录
C．用上述探针分别检测三种细胞的DNA，实验结果不变
D．可用mRNA逆转录产生的DNA制作相应基因的探针
[解析] 三种基因不同，三种探针的核苷酸序列也不相同，A正确；由题意可知，用基因探针检测的是三种细胞的mRNA，若出现杂交带说明该细胞中出现mRNA，即细胞发生了特定基因的转录，B正确；三种细胞来自同一生物体，则三种细胞所含DNA相同，若用上述探针检测三种细胞中的DNA，均会出现杂交带，C错误；分子探针可以通过逆转录过程获得，D正确。
3．(2018·山东省菏泽市高三期末)糖尿病发病率在我国近30年来增长极为迅速，发病的年龄大大提前，这与人们不健康的生活方式有关，同时也与患者体内胰岛素的缺乏有关。生产速效胰岛素以及利用转基因技术实现胰岛素的批量生产就成为了目前治疗糖尿病的新思路，回答下列有关问题：
(1)速效胰岛素的获得是科学家将胰岛素B链的第28与第29个氨基酸调换顺序后实现的。该过程中，需要对胰岛素基因(填“胰岛素”“胰岛素基因”或“胰岛”)进行定向改造。
(2)利用转基因技术实现胰岛素的批量生产，其关键操作环节是基因表达载体的构建。
(3)对于胰岛素基因的获取，一是通过从胰岛B细胞中提取合成的胰岛素mRNA，经过逆转录过程合成；二是通过分析胰岛素的氨基酸序列，进行人工合成。利用上述两种方法获得的基因结构不同(填“相同”或“不同”)。
(4)为了将改造后的分子顺利导入大肠杆菌体内，一般需要用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之成为感受态细胞。若将重组的DNA导入植物细胞可采用的方法有农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法(写出两种)。
考点三 基因工程的应用和蛋白质工程及PCR技术
1．基因工程的应用
(1)转基因植物
植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力(如抗除草剂、抗虫、抗病、抗干旱和抗盐碱等)，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。
(2)转基因动物
动物基因工程在动物品种改良、建立生物反应器、器官移植等方面显示了广阔的应用前景。
(3)基因工程药物
①来源：转基因的工程菌。
②成果：细胞因子、抗体、疫苗、激素等。
③作用：用来预防和治疗人类肿瘤、心血管疾病、遗传病、各种传染病、糖尿病、类风湿等疾病。
(4)基因治疗
①方法：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能。
②效果：治疗遗传病的最有效的手段。
③分类：体内基因治疗和体外基因治疗。
2．蛋白质工程
(1)概念理解
①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
②操作：基因修饰或基因合成。
③结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。
④目的：满足人类的生产和生活的需求。
(2)操作过程
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)→基因表达→产生需要的蛋白质。
易错整合，判断正误。
(1)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株( √ )
(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中( × )
(3)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用( × )
(4)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质( √ )
(5)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构( × )
1．蛋白质工程与基因工程的关系
项目
蛋白质工程
基因工程
区别
过程
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列
获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
联系
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造
■
二者都属于分子水平的操作，蛋白质工程的本质是通过改造基因进而形成自然界不存在的蛋白质，所以被形象地称为第二代基因工程。
2．基因治疗与基因诊断
原理
操作过程
进展
基因治疗
基因表达
利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗
临床实验
基因诊断
碱基互补配对
制作特定DNA探针与病人样品DNA混合分析杂交带情况
临床应用
3.利用PCR技术扩增目的基因
(1)PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
(2)目的：短时间内大量扩增目的基因。
(3)原理：DNA双链复制。
(4)前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。
(5)过程
过程
说明
图解
变性
温度上升到90 ℃左右，双链DNA解聚为单链
复性
温度下降到55 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸
温度上升到72 ℃左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸
例3 (2017·全国卷Ⅱ，38)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩叶组织细胞易破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。
[解析] (1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是相对于老叶而言嫩叶组织细胞更容易被破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。(2)以mRNA为材料获得cDNA的原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点且目的基因无表达所需启动子。(4)DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。(5)若获得的转基因植株不具备所期望的性状表现，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。
〔对应训练〕
3．(2019·全国卷Ⅰ，38)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括基因组文库和cDNA文库。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是解旋酶。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是加热至90～95_℃。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的氢键。
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活。
[解析] (1)基因工程中的基因文库包括基因组文库和部分基因文库(cDNA文库)。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，通过解旋酶解开DNA双链。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，通过高温(90～95 ℃)使反应体系中的模板DNA解链为单链。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的氢键。(3)大肠杆菌DNA聚合酶不耐高温，在高温下会失活，而PCR反应体系中加入的聚合酶需耐高温，故在PCR反应中要用能耐高温的Taq酶。
考点四 DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
2．操作流程
易错整合，判断正误。
(1)DNA溶解度随NaCl浓度的增大而增大( × )
(2)猪血细胞是DNA粗提取的良好材料( × )
(3)进行DNA粗提取和鉴定实验时，加入洗涤剂后用力进行快速、充分的研磨( × )
(4)洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度( × )
(5)将制备的含有DNA的滤液加入60～75 ℃的恒温水浴箱中保温10～15 min，可以将DNA析出( × )
下图为“DNA粗提取和鉴定”实验的相关操作，请仔细观察并分析：
(1)操作①和④都是加入蒸馏水，其目的一样吗？
(2)操作②中加入酒精的目的是什么？此时搅拌要注意什么？
(3)操作③中的黏稠物是如何获取的？加入2 mol/LNaCl的目的是什么？
[提示](1)不一样。①是使鸡血细胞吸水涨破释放出核物质；④是稀释NaCl溶液使其浓度接近0.14 mol·L－1，去除溶于低浓度NaCl溶液的杂质。
(2)②中加入酒精的目的是析出DNA，去除其中溶于酒精的杂质，这时候搅拌要沿一个方向，轻缓的进行。
(3)黏稠物是经过单层纱布过滤获得的；加入2 mol/L NaCl的目的是使DNA再次溶解。
1．DNA和蛋白质在不同NaCl溶液中的溶解度比较
2 mol/L NaCl溶液
0.14 mol/L NaCl溶液
溶解规律
DNA
溶解
析出
蛋白质
部分发生盐析沉淀
溶解
NaCl溶液浓度从2 mol/L降低过程中，溶解度逐渐增大
2.DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”
加蒸馏水2次
①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水涨破；
②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度稀释到0.14 mol/L，使DNA析出
用纱布过滤4次
①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液；②过滤用2 mol/L的NaCl溶液充分溶解的DNA，滤去溶液中的杂质；③滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)；④过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
用NaCl溶液4次
①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取的细胞核物质；②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出；③用2mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物；④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
例4 下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验过程中的一些重要操作示意图，据图回答下列有关该实验的问题。
(1)正确的操作顺序是C→B→E→D→A (用字母和箭头表示)。
(2)上图C、E步骤都加入蒸馏水，但其目的不同，分别是加速细胞的破裂和降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出。
(3)上图A步骤中的酒精必须是经过充分预冷的才能使用，该步骤的目的是提取含杂质较少(或较纯净)的DNA。
(4)为鉴定A中所得到的丝状物的主要成分为DNA，可用浓NaCl溶液溶解后滴加二苯胺试剂，混合均匀后沸水浴，如果出现蓝色则证明该丝状物的主要成分为DNA。
〔对应训练〕
5．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
试管
序号
A
B
1
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2
不加
加入提取的DNA丝状物并搅拌
3
加4 mL二苯胺，混匀
加4 mL二苯胺，混匀
4
沸水浴5 min
沸水浴5 min
实验现象
溶液不变蓝色
溶液逐渐变蓝色
实验结论
DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色
(1)根据上图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？溶液颜色基本不变。
(3)在沸水浴中加热的目的是加快颜色反应速度，同时说明DNA对高温有较强的耐受性。
(4)A试管在实验中的作用是对照。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与加入试管中的DNA(丝状物)的多少有关。
[解析] B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，其他条件均完全相同，A、B两试管形成对照。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。
课末总结
1．〔思维导图〕
2．〔简答题常考长句分析〕
1．限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子。DNA连接酶的作用部位是磷酸二酯键。
2．质粒是常用的载体，它是一种小型的双链环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。
3．基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点。
4．培育转基因动物时，受体细胞必须是受精卵；培育转基因植物时，受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。
5．目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法；导入动物细胞常用显微注射技术，导入微生物细胞常用感受态细胞法。
6．目的基因到了另一种生物体内能够成功表达的原理是所有生物共用一套遗传密码。
3．〔探究高考·明确考向〕
1．(2019·江苏卷，10)下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，错误的是( A )
A．用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近
B．DNA析出过程中，搅拌操作要轻柔以防DNA断裂
C．预冷的乙醇可用来进一步纯化粗提的DNA
D．用二苯胺试剂鉴定DNA需要进行水浴加热
[解析] 哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核，细胞内基本不含DNA，故兔血不宜作为该实验的实验材料，A项错误。DNA析出过程中，搅拌要轻柔，以防止DNA断裂，B项正确。DNA不溶于冷乙醇，向DNA提取液中加入适量预冷的乙醇溶液，会使DNA析出，从而进一步提纯DNA，C项正确。向溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴加热数分钟，溶液出现蓝色，D项正确。
2．(2019·江苏卷，16)下列生物技术操作对遗传物质的改造，不会遗传给子代的是( D )
A．将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌，筛选获得基因工程菌
B．将花青素代谢基因导入植物体细胞，经组培获得花色变异植株
C．将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，培育出产低乳糖牛乳的奶牛
D．将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者，进行基因治疗
[解析] 基因工程菌中含目的基因，能通过繁殖遗传给子代，A项不符合题意。经组培获得的转基因植株的细胞中都含目的基因，能够遗传给子代，B项不符合题意。培育得到的转基因奶牛的细胞中都含目的基因，故能遗传给子代，C项不符合题意。由题干信息可知，进行题述基因治疗时只有淋巴细胞含目的基因，生殖细胞不含目的基因，故不能遗传给子代，D项符合题意。
3．(2019·江苏卷，33)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：
图1
(1)EcoR V酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为平末端。
(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为胸腺嘧啶(T)的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在DNA连接酶作用下，形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是B(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是A类菌落含有P0、C类菌落未转入质粒。
菌落类型
平板类型
A
B
C
无抗生素
＋
＋
＋
氨苄青霉素
＋
＋
－
四环素
＋
－
－
氨苄青霉素＋四环素
＋
－
－
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是乙丙。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是目的基因反向连接。
图2
[解析] (1)从图中可以看出，EcoR Ⅴ酶切出来的载体质粒为平末端。(2)从图中可以看出，目的基因的两端各有一个游离的腺嘌呤脱氧核苷酸，由于载体P1为平末端，所以载体P1的两端应该各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸，这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P1连接起来。(3)由题意可知，构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏，所以导入目的基因的菌落只能在没有抗生素或含有氨苄青霉素的培养基中存活，应该选B类菌落。A类菌落能在表中条件下存活，说明导入的是P0质粒。C类菌落只能在无抗生素的培养基中存活，说明C类菌落没有导入质粒。(4)据图分析，目的基因的外侧链只能用丙作引物，内侧链可用甲、乙作引物，若选用另一对甲、乙作引物，会出现目的基因反接扩增出的DNA片段为400 bp，则正好是目的基因反向连接后，外侧链用乙作引物，内侧链用甲作引物扩增出的片段。
4．(2018·全国卷Ⅰ，38)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的转化方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。
[解析] (1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是基因工程。该研究除了证明质粒可作为载体外，还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。
(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca2＋参与的转化方法；体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)进行组装获得；因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒，所以宿主细胞选用细菌。
(3)为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞；在蛋白质纯化过程中，为防止目的蛋白质被降解，需要添加蛋白酶的抑制剂。
5．(2018·全国卷Ⅱ，38)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是E1和E4。使用这两种酶进行酶切是为了保证甲的完整，也是为了保证甲与载体正确连接。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了转录和翻译过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
[解析] (1)由题意可知，L1基因和GFP基因合成了L1GFP融合基因(简称为甲)，题图中显示了四个酶切位点，当将L1GFP融合基因插入质粒P0时，可用E1和E4限制酶进行酶切，用这两种酶进行酶切不会破坏甲的完整性，同时能保证甲按照正确的方向与载体连接。(2)若在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1GFP融合基因得到表达，即目的基因在受体细胞中通过转录和翻译合成了荧光蛋白。(3)为了获得含有甲的牛，可将含有目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中，然后进行体外培养、胚胎移植等。(4)利用PCR技术扩增目的基因，可以检测目的基因是否存在。PCR扩增的模板是DNA。
6．(2018·江苏， 32)为生产具有特定性能的α淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备α淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增α淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA。
(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连。
(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中②的设定与引物有关，⑥的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)
①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度 ④变性时间 ⑤退火时间 ⑥延伸时间
(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：
5′－U……3′
图中虚线框内mRNA片段包含8个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有13种。
(5)获得工程菌表达的α淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：
缓冲液
50 mmol/L
Na2HPO4KH2PO4
50 mmol/L
TrisHCl
50 mmol/L
GlyNaOH
pH
6.0
6.5
7.0
7.5
7.5
8.0
8.5
9.0
9.0
9.5
10.0
10.5
酶相对活性%
25.4
40.2
49.8
63.2
70.1
95.5
99.5
85.3
68.1
63.7
41.5
20.8
根据上述实验结果，初步判断该α淀粉酶活性最高的条件为pH为8.5，缓冲液为50_mmol/L_TrisHCl。
[解析] (1)利用 PCR 技术扩增α淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA作为模板，并依据α淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。
(2)利用PCR技术扩增DNA时，只能从3′端延伸DNA子链，为了便于扩增的 DNA 片段与表达载体连接，需在引物的5′端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接。
(3)PCR技术包括变性、退火(复性)和延伸三步，变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链，且时间很短；退火时引物结合到互补的DNA单链上，退火温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及其浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在1 kb以内的延伸时间为1 min左右，3～4 kb的延伸时间为3～4 min。
(4)图中虚线框内共含有24个碱基，mRNA上决定一种氨基酸的三个相邻的碱基为一个密码子，故共包含8个密码子。虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U，第2和第3个碱基各有4种可能性，因此共16种可能性。题干表明控制α淀粉酶的基因有1 656个碱基对，说明图中虚线框后的第一个密码子肯定不是终止密码子(3种终止密码子为UAA、UAG、UGA)，故虚线框后第一个密码子实际最多有16－3＝13种可能性。
(5)分析表格中的数据，酶相对活性最高为99.5%，对应的条件是pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L TrisHCl。
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