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所属成套资源：2021高考生物苏教版一轮复习学案
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2021版高考生物（苏教版）一轮复习学案：选修3第1讲 基因工程
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第1讲 基因工程
1.基因工程的诞生(Ⅰ)
2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)
3.基因工程的应用(Ⅱ)
4.蛋白质工程(Ⅰ)
5.生物武器对人类的威胁(Ⅰ)
6.生物技术中的伦理问题(Ⅰ)
1.基因的结构与功能。（生命观念）
2.基因工程的操作流程图及蛋白质的流程图等。（科学思维）
3.基因工程的应用和蛋白质工程。（科学探究）
4.正确看待转基因生物的安全性以及生物武器对人类的威胁等。（社会责任）
基因工程的基本工具
1．基因工程的概念
(1)概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(2)遗传原理：基因重组。
(3)优点
①与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
②与诱变育种相比：定向改造生物的遗传性状。
2．基因工程的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(简称限制酶)。
①来源：主要来自原核生物。
②特点：具有专一性，表现在两个方面：
识别——双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。
切割——特定核苷酸序列中的特定位点。
③作用：断裂特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
④结果：产生黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
种类
E·coli DNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
特点
缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端
作用
缝合双链DNA片段，恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键
(3)载体
①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒的特点
③运载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
1．基因工程技术使用限制酶需注意的四个问题
(1)获取目的基因和切割载体时，经常使用同一种限制酶(也可使用能切出相同末端的不同限制酶)，目的是产生相同的黏性末端或平末端。
(2)获取一个目的基因需限制酶切割两次，共产生4个黏性末端或平末端。
(3)限制酶切割位点的选择，必须保证标记基因的完整性，以便于检测。
(4)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。
2．限制酶和DNA连接酶的关系
(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。
(2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(3)DNA连接酶起作用时，不需要模板。
3．载体
(1)条件与目的
条件
目的
稳定并能复制
目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因
便于重组DNA的鉴定和选择
(2)作用
①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。
②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
4．载体上标记基因的作用
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：
人的胰岛素基因可以与细菌的质粒重组，并在细菌细胞中表达。其能重组的物质基础和结构基础分别是什么？成功表达的遗传学基础呢？
[提示] 人的胰岛素基因可以与细菌的质粒重组的物质基础是二者都是由四种脱氧核苷酸组成，结构基础是二者都是有遗传效应的DNA片段，都具有规则的双螺旋结构。成功表达的遗传学基础是遗传密码在生物界是通用的。
考查限制酶、DNA连接酶等酶的作用
确定选择限制酶种类的方法
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
1．(2016·全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
图(a)
图(b)
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是_______________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是
____________________________________________________。
图(c)
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有______________和______________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________。
[解析] (1)由题图可知，BamH Ⅰ 和Sau3A Ⅰ 两种限制性内切酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamH Ⅰ酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3A Ⅰ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。
[答案] (1)Sau3A Ⅰ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录
(3)E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
2．下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
图1 图2
(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用__________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌。
(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中________。
(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为________，对于该部位，这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。
(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。
[解析] (1)选择的限制酶应在目的基因两端且在质粒中存在识别位点，故可以用来切割的限制酶为BclⅠ、HindⅢ、BamHⅠ和Sau3AⅠ，但由于BamHⅠ和Sau3AⅠ可能使质粒中的启动子丢失或破坏抗性基因，所以应选用BclⅠ、HindⅢ两种限制酶切割。酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入感受态的大肠杆菌中，使其增殖。(2)根据质粒上抗性基因，为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素。平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物需要与单链两端相应互补序列结合，故所用引物组成是图2中的引物甲和引物丙。(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端和BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为，由于两种酶均不能识别该部位的碱基对序列，所用两种酶都不能切开该部位。(4)根据BclⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点，Sau3AⅠ在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为A、B、C三种片段，若部分位点被切开，可得到AB、AC、BC、ABC四种片段，所以用Sau3AⅠ切质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。
[答案] (1)BclⅠ和HindⅢ DNA连接 感受
(2)四环素 引物甲和引物丙
(3) 都不能 (4)7
考查载体的作用及特点等
3．(2016·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_________________；并且____________和___________的细胞也是不能区分的，其原因是__________________。
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于________。
[解析] (1)质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等等。(2)在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。(3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。
[答案] (1)能自我复制、具有标记基因、具有一至多个限制酶切割位点(答出两点即可)
(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 (3)受体细胞
基因工程的基本操作
1．基因工程的基本程序
(1)获取目的基因
①从基因文库中获取
②人工合成
③利用PCR技术扩增
(2)构建基因表达载体——基因工程的核心
①目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
②基因表达载体的组成
(3)导入目的基因
①转化含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内遗传和表达的过程。
②转化方法
生物类型
植物
动物
微生物
受体细胞
体细胞
受精卵
大肠杆菌或酵母菌等
常用方法
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
显微注射法
感受态细胞法
(4)检测和鉴定目的基因
方法
检测或鉴定目的
水平
DNA分子杂交技术
检测目的基因的有无
分子水平
分子杂交技术
目的基因是否转录
抗原—抗体杂交
目的基因是否翻译
抗虫或抗病接种实验
是否具有抗虫抗病特性
个体水平
2.PCR技术
(1)原理：DNA双链复制。
(2)条件
(3)过程
(4)结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
1．基因工程操作的四个易错点
(1)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。
(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。
(3)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染双子叶或裸子植物的细胞，并将其Ti质粒上的TDNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。
(4)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
2．基因组文库与eDNA文库(部分基因文库)的比较
文库类型
部分基因文库
基因组文库
构建基因文库的过程
文库大小
小
大
基因中启动子
无
有
基因中内含子
无
有
基因多少
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
物种间的基因交流
可以
部分基因可以
说明
基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性
用箭头及简要的文字简述基因组文库和部分基因文库构建过程。
[提示] 基因组文库的构建过程：某种生物全部DNA许多DNA片段受体菌群体。
部分基因文库的构建过程为：某种生物发育的某个时期的mRNAcDNA受体菌群体。
考查基因工程的操作程序
1．(2019·晋冀鲁豫高三联考)真核生物基因中通常含内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。研究发现绿色木霉合成并分泌的环氧化水解酶可降解黄曲霉素B1。现有含绿色木霉的菌液，为获得环氧化水解酶，研究小组进行以下两种尝试：
(1)方法一
①从含有绿色木霉的菌液中提取细胞的mRNA，在________酶的催化下，合成cDNA。
②以cDNA为模板，通过________技术大量扩增，获得目的基因。
③构建目的基因表达载体，导入大肠杆菌的体内。
④目的基因在大肠杆菌体内正常转录，但是翻译产生的环氧化水解酶没有生物活性，需做进一步的处理加工，原因在于___________________。
(2)方法二
①提取绿色木霉的全部DNA，选用适当的________酶处理后，会获得一些小的DNA片段。
②选择一些合适的载体与获取的DNA片段构建基因表达载体。与从cDNA文库中获取目的基因构建表达载体所用载体相比，该载体组成不需要添加__________________成分。
③载体和这些DNA片段连接起来，导入受体菌的群体中储存。
④从这些受体菌的群体中筛选出含有目的基因的受体菌，分离出目的基因，将该目的基因和载体结合，通过________法导入大肠杆菌体内。
⑤该目的基因在大肠杆菌的体内正常转录，但其不能进行翻译，原因在于___________________________。
[解析] (1)以mRNA合成cDNA的过程为逆转录。以已知的cDNA为模板扩增目的基因的过程称为PCR技术。绿色木霉为真核生物，合成并分泌的环氧化水解酶为分泌蛋白，而大肠杆菌为原核生物，细胞内无内质网和高尔基体，因此在其体内翻译产生的环氧化水解酶没有生物活性。
(2)由提取绿色木霉的全部DNA获取一些小的DNA片段需要用限制酶进行处理。从cDNA文库中获取目的基因中无启动子和终止子。将该目的基因导入大肠杆菌的方法为转化法。从基因组文库里分离出的该目的基因在大肠杆菌的体内正常转录，但其不能进行翻译，原因在于目的基因中存在内含子。
[答案] (1)①逆转录 ②PCR ④环氧化水解酶是分泌蛋白，需要内质网和高尔基体加工 (2)①限制 ②启动子、终止子 ④转化 ⑤目的基因中存在内含子
2．(2019·郴州市高三二模)甘蔗黄叶综合症是一种由甘蔗黄叶病毒所引起的禾本科植物病毒，科学家通过甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因(简称CP蛋白基因)转化植物来获得抗病转基因新品种。
(1)首先从甘蔗黄叶综合症的病叶中提取RNA，此过程中为了防止RNA被分解，需加入________抑制剂，以提取的RNA为模板通过________获得cDNA。
(2)对获取的cDNA进行PCR扩增，在此反应体系中，除了模板DNA、dNTP外，还需加入________，获得大量的cDNA需要在4 ℃的低温下保存备用，原因是_______________。
(3)将cDNA和质粒用同一种限制酶切割，产生相同的平末端，再用________将二者进行连接(填“E·coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)。在培养基上接种培养大肠杆菌作为受体细胞，同时加入一定量的CaCl2低温冷却液，目的是制备________细胞，其具有的特殊功能是____________________________。
(4)为检测大肠杆菌是否产生CP蛋白，需要将病毒颗粒注射入兔子体内，并从血清中分离获得________作为检测剂。
[解析] (1)RNA酶可将RNA水解，因此为了防止RNA被分解，需加入RNA酶抑制剂；以RNA为模板获得cDNA的过程称为逆转录。
(2)采用PCR技术扩增目的基因时的条件有模板DNA、dNTP、引物、Taq酶(热稳定DNA聚合酶)；获得大量的cDNA需要在4℃的低温下保存备用，原因是高温条件下，易使DNA分子中的氢键断裂，双螺旋结构打开而发生变性。
(3)DNA连接酶包括E·coliDNA连接酶、T4DNA连接酶，这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端。用CaCl2处理微生物细胞可使其成为感受态细胞，其具有的特殊功能是能吸收周围环境中的DNA分子。
(4)为检测大肠杆菌是否产生CP蛋白，需要将病毒颗粒注射入兔子体内，并从血清中分离获得CP蛋白抗体(黄叶病毒外壳蛋白抗体)作为检测剂。
[答案] (1)RNA酶 逆转录 (2)引物、Taq酶(热稳定DNA聚合酶) 高温条件下，易使DNA分子中的氢键断裂，双螺旋结构打开而发生变性 (3)T4DNA连接酶 感受态 能吸收周围环境中的DNA分子 (4)CP蛋白抗体(黄叶病毒外壳蛋白抗体)
3．(2019·沈阳市东北育才学校高三模拟)青蒿素是最有效的抗疟疾药物，但野生黄花蒿青蒿素产量低，为缓解青蒿素供应不足的状况，科学家将tms基因和tmr基因导入黄花蒿的愈伤组织从而获得了黄花蒿的冠瘿组织，改造过程用到的部分结构如图。
(1)科学家将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞的常用方法是______________________________________。
(2)图中结构P、T是基因成功转录的保证，其中结构P的作用____________________________________。为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，并将含有目的基因的细胞筛选出来，图中还缺少的结构是________________。
(3)在获得转基因的冠瘿组织过程中，_________是核心步骤，在具体操作中常常使用两种能产生不同黏性末端的限制酶对目的基因和运载体的两端分别进行切割，这样做的好处是___________。
(4)TDNA的作用是可以使______________________，并插入到植物细胞中染色体的DNA上，要检测目的基因是否插入到冠瘿组织细胞的染色体DNA上，可采用________技术。
(5)与愈伤组织相比，冠瘿组织的生长速度更快，原因可能是______________________________。
[解析] (1)目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法，而导入植物细胞最常用农杆菌转化法，因此，科学家将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞的常用方法是农杆菌转化法。
(2)图中结构P、T与基因的转录有关，即基因成功转录的保证，T为终止子，则P为启动子，它的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位。为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，并将含有目的基因的细胞筛选出来，图中还缺少的结构是标记基因。
(3)在获得转基因的冠瘿组织过程中，基因表达载体的构建是核心步骤，在具体操作中常常使用两种能产生不同黏性末端的限制酶对目的基因和运载体的两端分别进行切割，这样做的好处是可以避免目的基因和运载体的自身连接成环和反向连接。
(4)TDNA的作用是可以使目的基因进入植物细胞，并插入到植物细胞中染色体的DNA上，要检测目的基因是否插入到冠瘿组织细胞的染色体DNA上，可采用DNA分子杂交技术。
(5)冠瘿组织的生长与细胞的分裂和伸长等有关，由此推知冠瘿组织的生长速度更快，原因可能是tms和tmr基因编码产物控制合成了生长素和细胞分裂素，促进其生长。
[答案] (1)农杆菌转化法 (2)RNA聚合酶识别和结合的部位 标记基因 (3)基因表达载体的构建(或构建基因表达载体) 可以避免目的基因和运载体的自身连接成环和反向连接 (4)目的基因进入植物细胞 DNA分子杂交 (5)tms和tmr基因编码产物控制合成了生长素和细胞分裂素，促进了冠瘿组织的生长
关注基因工程
1．基因工程的应用
(1)植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质和利用植物生产药物。
(2)动物基因工程：用于提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。
(3)比较基因治疗与基因诊断
项目
原理
操作过程
进展
基因治疗
基因表达
利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)
临床实验
基因诊断
碱基互补配对
制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况
临床应用
2.转基因生物的安全性
(1)转基因植物的安全性
①食用安全问题。
②对生态系统的影响
a．转基因植物的扩散对生物多样性有无影响。
b．导入的目的基因是否会扩散漂移到其他物种体内而导致自然界的混乱。
c．若大面积种植转基因植物，其残体分解物、根部分泌物等是否会对生态与环境造成大规模的负面效应等。
(2)转基因动物的安全性
①对人体健康的影响。
②对生态系统的影响。
(3)转基因生物安全性的保障措施
①保障公众对所购食品是否来源于转基因生物拥有知情权。
②国家应建立相应的评估及预警机制。
3．生物武器的危害性
(1)所用微生物种类
①细菌：霍乱弧菌、炭疽杆菌等。
②病毒：埃博拉病毒、天花病毒等。
(2)被用作生物武器的方法
①将致病基因插入不致病的微生物体内。
②将抗普通疫苗或药物的基因插入致病细菌或病毒中。
③用于研制针对某一特定种群的生物武器。
1．利用转基因技术获得的已整合药用蛋白基因的转基因小鼠分泌的乳汁中检测不到药用蛋白，根据中心法则分析，其可能的原因是什么？
[提示] 药用蛋白基因没有转录或翻译。
2．尝试写出禁止生物武器的理由。
[提示] 生物武器包括致病菌、病毒、生化毒剂，以及经过基因重组的致病菌等。把这些病原体直接或通过食物、生活必需品等散布到敌方，可以对军队和平民造成大规模杀伤等后果。
考查基因工程的应用
1．(2019·河北省武邑中学高三质检)植物甲含有A基因，其编码的蛋白质中富含赖氨酸。科学家通过基因工程培育出的转基因玉米也能合成甲的富含赖氨酸的蛋白质，使玉米中赖氨酸的含量比原来提高30%。请回答：
(1)在获取目的基因时，常从甲的细胞中提取富含赖氨酸的蛋白质的mRNA，并利用mRNA人工合成cDNA。上述人工合成cDNA的过程称作________；与甲细胞中的A基因相比，cDNA中不具有调控基因表达的________________________________等组件。
(2)在利用农杆菌转化法转基因时，需将目的基因插入到质粒的TDNA中，原因是________________________。将携带了目的基因的农杆菌和玉米薄壁组织细胞共培养时，需用酚类化合物对玉米细胞进行处理，这种处理的作用是________________________。
(3)在获得转基因玉米后，可采用核酸分子杂交技术对玉米细胞中是否存在A基因的转录产物进行检测，检测时需用____________制作基因探针。
(4)实验发现，某携带了A基因的玉米植株(乙)自交，其子代中富含赖氨酸的个体占15/16，而用乙的体细胞离体培养所产生的植株100%富含赖氨酸。将玉米体细胞离体的培养成完整植株的过程称为______________。若乙中的A基因都能表达，且不考虑突变和染色体交叉互换，乙自交子代富含赖氨酸的个体占15/16，原因是____________________________________________。
[解析] (1)根据题意分析，上述人工合成cDNA的过程是以RNA为模板合成DNA的过程，为逆转录过程；与A基因相比，人工合成的cDNA中不含启动子、终止子和内含子。
(2)农杆菌细胞中的Ti质粒上的TDNA(可转移DNA)能进入玉米细胞并整合到玉米染色体DNA上，因此在利用农杆菌转化法转基因时，需将目的基因插入到质粒的TDNA中。将携带了目的基因的农杆菌和玉米薄壁组织细胞共同培养时，需用酚类化合物对玉米细胞进行处理，以吸引农杆菌对玉米细胞进行侵染。
(3)检测A基因(目的基因)可以用DNA分子杂交法，该过程需要用含A基因的DNA片段(或A基因)制作基因探针。
(4)将玉米体细胞离体的培养成完整植株的过程为植物组织培养。根据题意分析，将某携带了A基因的玉米植株(乙)自交，其子代中富含赖氨酸的个体占15/16，即只有1/16(1/4×1/4)的个体不富含赖氨酸，相当于两对杂合子的自交实验，说明乙的体细胞中有2条非同源染色体上含有A基因，所产生的配子中只有3/4的配子含A基因。
[答案] (1)逆转录 启动子、终止子、内含子 (2)TDNA能进入并整合到玉米染色体DNA上 吸引农杆菌对玉米细胞进行侵染 (3)含A基因的DNA片段(或A基因) (4)组织培养 乙的体细胞中有2条非同源染色体上含有A基因，所产生的配子中只有3/4的配子含A基因
2．(2019·保定市高三期末)干扰素具有抗病毒、抑制肿瘤及免疫调节等多种生物活性。质粒中的LacZ基因可表达出β半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和Xgal时，Xgal便会被β半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌形成蓝色菌落，反之则形成白色菌落。如图是将人干扰素基因导入大肠杆菌，培养后生产干扰素的过程。
(1)在获得干扰素基因后，常采用PCR技术大量扩增。该技术的基本过程是目的基因DNA受热变性后解链为单链，______________与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶的作用下进行______________，如此重复循环多次。
(2)过程①最好选用的限制酶是____________，在进行②过程前，需事先用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于________。为了筛选含有重组质粒的大肠杆菌，需要在培养大肠杆菌的培养基中额外加入________________________________，培养一段时间后挑选出________(填“蓝色”或“白色”)的菌落进一步培养获得大量目的菌。
(3)某些干扰素可抑制肿瘤细胞DNA的合成，通过减缓细胞______________分裂过程抑制肿瘤。还有些干扰素可提高吞噬细胞将抗原呈递给____________的能力，从而在免疫调节中发挥作用。
[解析] (1)PCR技术的基本过程是在高温下，目的基因DNA受热变性后解链为单链；温度降低，引物与单链相应互补序列结合；然后，温度回升时，在DNA聚合酶的作用下进行互补链的合成，如此重复循环多次。
(2)为了产生相同的黏性末端，获取目的基因和切割载体时通常使用同种限制酶。由题图可知，质粒和目的基因均具有EcoRⅤ、BamHⅢ和EcoRⅠ限制酶切割位点，但EcoRⅤ限制酶会破坏干扰素基因，因此过程①不能选用该酶，最好选用BamHⅢ和EcoRⅠ限制酶。将重组质粒导入大肠杆菌细胞，需事先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使大肠杆菌细胞处于感受态。选用BamHⅢ和EcoRⅠ限制酶切割质粒和目的基因，重组质粒中青霉素基因完好，可正常表达，对青霉素具有抗性；而LacZ基因被破坏，无法表达出β半乳糖苷酶，无法使无色的IPTG和Xgal变蓝，显白色。因此，在培养基中加入IPTG、Xgal和青霉素，只有成功导入目的基因的重组质粒的细菌(即目的菌)才能不被青霉素杀死，同时表现为白色。
(3)癌细胞的增殖方式为有丝分裂。因此，某些干扰素可抑制肿瘤细胞DNA的合成，通过减缓细胞有丝分裂过程抑制肿瘤。还有些干扰素可提高吞噬细胞将抗原呈递给T淋巴细胞的能力，从而在免疫调节中发挥作用。
[答案] (1)引物 互补链的合成(或延伸) (2)BamHⅢ和EcoRⅠ 感受态 IPTG、Xgal和青霉素 白色 (3)有丝 T淋巴细胞
考查转基因技术的安全性
3．(2019·安徽六安一中高三模拟)2018年11月，有关“中国基因编辑婴儿”新闻占据了各大网络媒介，一场“科学发展”与“伦理道德沦丧”争辩响彻全国。请根据你所学的知识，分析以下问题：
(1)为了达到所谓的“阻断感染艾滋病”效果，该实验团队主要针对CCR5基因进行编辑，实施基因敲除，该过程中可能要用到的工具酶是____________________，敲除后为了使DNA上“缺口”补上，可能用到的工具酶是__________________。
(2)人们担心这种行为会打开“潘多拉魔盒”，驱使另一些科研者开展人类基因编辑研究，出现“基因完美的定制人”。在这些研究中，外源基因能与受体细胞DNA成功重组的原因是________________________________，这些基因拼接成功后能正常表达的理论基础是_________________。
(3)由于基因组计划尚未圆满完成，人类对自身基因在DNA分子上的位置知之甚少，在这种情况下开展对人类的基因编辑计划风险非常大。你认为该转基因技术存在安全性争论的原因：________________。
(4)转基因技术并不是令人闻之色变的疯狂技术，它已在作物品种改良上取得一定的成绩。比如，为了获得“多彩的牵牛花”，可将__________________(填目的基因名称)与质粒形成重组质粒，导入到普通牵牛花细胞中，再通过____________技术培养得到符合要求的植株。
[解析] (1)实施基因敲除，该过程中可能要用到的工具酶是限制性核酸内切酶，敲除后为了使DNA上断裂的磷酸二酯键重新形成，可能用到的工具酶是DNA连接酶。
(2)在基因工程中，外源基因能与受体细胞中的DNA具有共同的结构和化学组成是成功重组的基础，这些基因拼接成功后能正常表达的理论基础是所有的生物都共用一套遗传密码子表，都遵循中心法则。
(3)“中国基因编辑婴儿”转基因技术存在安全性争论的原因：目前对基因的结构、基因间的相互作用以及基因的调控机制等都了解得相当有限；外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的，可能导致生命活动必需的正常基因遭到破坏。
(4)利用转基因技术获得“多彩的牵牛花”，即将与花青素代谢有关的基因与质粒形成重组质粒，导入到普通牵牛花细胞中，再利用植物细胞的全能性，通过植物组织培养技术培养得到符合要求的植株。
[答案] (1)限制性核酸内切酶 DNA连接酶 (2)两者都具有共同的结构和化学组成 所有的生物都共用一套遗传密码子表，都遵循中心法则 (3)目前对基因的结构、基因间的相互作用以及基因的调控机制等都了解得相当有限；外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的，可能导致生命活动必需的正常基因遭到破坏 (4)与花青素代谢有关的基因 植物组织培养
蛋白质工程
1．蛋白质工程
(1)概念：指通过物理化学与生物化学等技术了解蛋白质的结构与功能，并借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组DNA技术改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋白质的技术。
(2)流程图
写出流程图中字母代表的含义：
A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。
2．蛋白质工程与基因工程的比较
(1)区别
项目
蛋白质工程
基因工程
过程
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核糖核苷酸序列
获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
(2)联系
①蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。
1．研究发现，如果将白喉杆菌类毒素20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸，免疫效果更好，请写出此种技术的基本流程。
[提示] 从预期蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。
2．请简要写出从个体水平鉴定抗虫棉是否培育成功的设计思路。
[提示] 取一定量长势良好的转基因棉花植株接种适量的棉铃虫作为实验组，取等量长势一致的普通棉花植株接种等量棉铃虫作为对照组。在相同且适宜的条件下培养一段时间，观察并统计两组棉花叶片的受损程度。
考查蛋白质工程及应用
香港大学的研究人员将某印度芥菜的HMGS基因编码的蛋白质的第359位氨基酸“丝氨酸”替换成“丙氨酸”后形成s359a蛋白，通过一定的方法获得新HMGS基因，然后将其导入番茄细胞，获得类胡萝卜素增加111%的转基因番茄，该番茄具有强抗氧化性。请回答下列问题：
(1)请按照蛋白质工程的原理写出获得新HMGS基因的基本途径：
____________________________________________________
____________________________________________________。
(2)如图的4种质粒中，E表示EcoR Ⅰ的切割位点，将这些质粒用EcoR Ⅰ充分切割后，产生的线性双链DNA片段的种类分别为________个，接着将新HMGS基因分别与这4组酶切产物、DNA连接酶在适宜环境下混合，编号为1、2、3、4组，结果发现除第________组外，其余3组都有含新HMGS基因的基因表达载体(重组质粒)出现。基因表达载体的组成除目的基因和标记基因外，还包括________及复制原点。
(3)若质粒3是农杆菌的Ti质粒，则图示E所处的位置在Ti质粒上的________，将含新HMGS基因的重组Ti质粒的农杆菌导入番茄细胞，成功获得含新HMGS基因的转基因番茄，将其果实色素提取后，用________法分离，可发现滤纸条上____________(填颜色)的条带比第4组的宽。
[解析] (1)蛋白质工程的原理为从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)，由此可写出获得新HMGS基因的基本途径：从s359a蛋白的功能出发→设计s359a蛋白的结构→将HMGS蛋白的第359位丝氨酸替换成丙氨酸→找到并改造HMGS基因的脱氧核苷酸序列。
(2)图中质粒1、2、3、4上的限制酶EcoR Ⅰ切割位点分别为3、2、1、0，用EcoRⅠ充分切割后，产生的线性双链DNA片段的种类分别为3、2、1、0。第4组无EcoR Ⅰ切割位点，因此无法构建基因表达载体。基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子以及复制原点。
(3)Ti质粒上的TDNA可将目的基因转移到受体细胞且整合到受体细胞染色体的DNA上。色素的提取方法为纸层析法。新HMGS基因导入番茄细胞，获得的类胡萝卜素增加，因此滤纸条上橙黄色和黄色的条带比第4组的宽。
[答案] (1)从s359a蛋白的功能出发→设计s359a蛋白的结构→将HMGS蛋白的第359位丝氨酸替换成丙氨酸→找到并改造HMGS基因的脱氧核苷酸序列[或从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)] (2)3、2、1、0 4 启动子和终止子 (3)TDNA 纸层析 橙黄色和黄色
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1．(2019·全国卷Ⅰ)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是__________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_________________________________________。
[解析] (1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至90～95 ℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。(3)在PCR过程中，要加热至90～95 ℃，所以使用热稳定性高的Taq酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
[答案] (1)基因组文库 cDNA文库 (2)解旋酶 加热至90～95 ℃ 氢键 (3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
2．(2019·江苏高考)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：
图1
(1)EcoR V酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为________末端。
(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是________、________。
菌落类型
平板类型
A
B
C
无抗生素
＋
＋
＋
氨苄青霉素
＋
＋
－
四环素
＋
－
－
氨苄青霉素＋四环素
＋
－
－
图2
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是______________________________。
[解析] (1)EcoR V酶切位点在酶所识别序列的中心轴线处，产生的是平末端。(2)DNA连接酶对平末端的连接效率较低，因此通常要将平末端改造成黏性末端后再进行连接。由于目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，根据碱基互补配对原则，处理后的质粒两端需要各添加一个碱基为胸腺嘧啶的脱氧核苷酸；要将处理后的质粒与目的基因连接起来，需要用DNA连接酶。(3)由于四环素抗性基因中含有EcoR V酶识别的序列及切割位点，所以形成的重组质粒中四环素抗性基因已经被破坏，而氨苄青霉素抗性基因正常。根据表中结果可知，A菌落抗氨苄青霉素和四环素，说明A菌落中导入的是P0质粒；B菌落抗氨苄青霉素而不抗四环素，说明B菌落中导入的是重组质粒；C菌落既不抗氨苄青霉素，也不抗四环素，说明C菌落中没有导入质粒。(4)由于处理后的P0质粒的两个末端都含一个胸腺嘧啶的脱氧核苷酸，而目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，所以目的基因在和P0质粒连接时可能会出现两种情况：正向连接和反向连接。分析图2可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50 bp＋300 bp＋100 bp＝450 bp，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和P0质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300 bp＋100 bp＝400 bp的片段。
[答案] (1)平 (2)胸腺嘧啶(T)
DNA连接 (3)B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 (4)乙丙 目的基因反向连接
3．(2019·海南高考)人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
(1)若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取________作为模板，在________催化下合成cDNA，再利用______________技术在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的__________________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经__________。
(3)天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是___________。
[解析] (1)由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术(体外扩增DNA的技术)在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)农杆菌转化法中，TDNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的TDNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。
(3)蛋白质工程需要从预期的蛋白质的功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
[答案] (1)mRNA 逆转录酶 PCR (2)TDNA 整合到叶肉细胞染色体DNA上 (3)找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基
4．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了____________________________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用____________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
[解析] (1)两位科学家将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中并进行了表达，因此，该研究可以证明：质粒可以作为载体，真核细胞的基因在原核细胞中也可以表达(不同生物共用一套密码子)、体外重组的质粒可以进入受体细胞等。(2)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化，将质粒导入大肠杆菌时，常用的转化方法是首先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使其成为感受态。噬菌体DNA没有侵染能力，体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白组装成完整噬菌体才能完成侵染过程。噬菌体多寄生在细菌中，但不能寄生在心肌细胞和叶肉细胞中。(3)若要使蛋白质不被降解，则大肠杆菌体内不能存在蛋白酶，因此，实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞。同理，在蛋白质纯化过程中，也不能使蛋白质降解，因此，应添加蛋白酶抑制剂。
[答案] (1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达 (2)转化 外壳蛋白(或噬菌体蛋白) 细菌 (3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶
5．(2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是________。使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证________________。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的________移入牛的______________中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
[解析] (1)据图示信息分析：将L1GFP融合基因(甲)插入质粒时使用酶E1和E4进行酶切，既能保证L1GFP融合基因的完整，又能保证L1GFP融合基因与载体的正确连接。(2)目的基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个过程。(3)将体外培养的含有目的基因的动物体细胞核移入该动物的去核卵母细胞中，经过体外胚胎培养、胚胎移植等技术可获得转基因动物。(4)检测目的基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，采用PCR技术鉴定时，应以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。
[答案] (1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接 (2)转录 翻译 (3)细胞核 去核卵母细胞
(4)核DNA
第1讲 基因工程
1.基因工程的诞生(Ⅰ)
2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)
3.基因工程的应用(Ⅱ)
4.蛋白质工程(Ⅰ)
5.生物武器对人类的威胁(Ⅰ)
6.生物技术中的伦理问题(Ⅰ)
1.基因的结构与功能。（生命观念）
2.基因工程的操作流程图及蛋白质的流程图等。（科学思维）
3.基因工程的应用和蛋白质工程。（科学探究）
4.正确看待转基因生物的安全性以及生物武器对人类的威胁等。（社会责任）
基因工程的基本工具
1．基因工程的概念
(1)概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(2)遗传原理：基因重组。
(3)优点
①与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
②与诱变育种相比：定向改造生物的遗传性状。
2．基因工程的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(简称限制酶)。
①来源：主要来自原核生物。
②特点：具有专一性，表现在两个方面：
识别——双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。
切割——特定核苷酸序列中的特定位点。
③作用：断裂特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
④结果：产生黏性末端或平末端。
(2)DNA连接酶
种类
E·coli DNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
特点
缝合黏性末端
缝合黏性末端和平末端
作用
缝合双链DNA片段，恢复两个核苷酸之间的磷酸二酯键
(3)载体
①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒的特点
③运载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
1．基因工程技术使用限制酶需注意的四个问题
(1)获取目的基因和切割载体时，经常使用同一种限制酶(也可使用能切出相同末端的不同限制酶)，目的是产生相同的黏性末端或平末端。
(2)获取一个目的基因需限制酶切割两次，共产生4个黏性末端或平末端。
(3)限制酶切割位点的选择，必须保证标记基因的完整性，以便于检测。
(4)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。
2．限制酶和DNA连接酶的关系
(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。
(2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(3)DNA连接酶起作用时，不需要模板。
3．载体
(1)条件与目的
条件
目的
稳定并能复制
目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因
便于重组DNA的鉴定和选择
(2)作用
①作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞内。
②利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
4．载体上标记基因的作用
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：
人的胰岛素基因可以与细菌的质粒重组，并在细菌细胞中表达。其能重组的物质基础和结构基础分别是什么？成功表达的遗传学基础呢？
[提示] 人的胰岛素基因可以与细菌的质粒重组的物质基础是二者都是由四种脱氧核苷酸组成，结构基础是二者都是有遗传效应的DNA片段，都具有规则的双螺旋结构。成功表达的遗传学基础是遗传密码在生物界是通用的。
考查限制酶、DNA连接酶等酶的作用
确定选择限制酶种类的方法
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
1．(2016·全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
图(a)
图(b)
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是_______________________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是
____________________________________________________。
图(c)
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有______________和______________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________。
[解析] (1)由题图可知，BamH Ⅰ 和Sau3A Ⅰ 两种限制性内切酶的共同识别序列是，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamH Ⅰ酶切得到的目的基因可以与图(b)所示表达载体被Sau3A Ⅰ酶切后的产物连接。(2)在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。(3)常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。
[答案] (1)Sau3A Ⅰ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 (2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录
(3)E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
2．下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
图1 图2
(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用__________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌。
(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中________。
(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为________，对于该部位，这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。
(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。
[解析] (1)选择的限制酶应在目的基因两端且在质粒中存在识别位点，故可以用来切割的限制酶为BclⅠ、HindⅢ、BamHⅠ和Sau3AⅠ，但由于BamHⅠ和Sau3AⅠ可能使质粒中的启动子丢失或破坏抗性基因，所以应选用BclⅠ、HindⅢ两种限制酶切割。酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入感受态的大肠杆菌中，使其增殖。(2)根据质粒上抗性基因，为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素。平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物需要与单链两端相应互补序列结合，故所用引物组成是图2中的引物甲和引物丙。(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端和BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为，由于两种酶均不能识别该部位的碱基对序列，所用两种酶都不能切开该部位。(4)根据BclⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点，Sau3AⅠ在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为A、B、C三种片段，若部分位点被切开，可得到AB、AC、BC、ABC四种片段，所以用Sau3AⅠ切质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。
[答案] (1)BclⅠ和HindⅢ DNA连接 感受
(2)四环素 引物甲和引物丙
(3) 都不能 (4)7
考查载体的作用及特点等
3．(2016·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_________________；并且____________和___________的细胞也是不能区分的，其原因是__________________。
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于________。
[解析] (1)质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等等。(2)在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。(3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。
[答案] (1)能自我复制、具有标记基因、具有一至多个限制酶切割位点(答出两点即可)
(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 (3)受体细胞
基因工程的基本操作
1．基因工程的基本程序
(1)获取目的基因
①从基因文库中获取
②人工合成
③利用PCR技术扩增
(2)构建基因表达载体——基因工程的核心
①目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
②基因表达载体的组成
(3)导入目的基因
①转化含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内遗传和表达的过程。
②转化方法
生物类型
植物
动物
微生物
受体细胞
体细胞
受精卵
大肠杆菌或酵母菌等
常用方法
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
显微注射法
感受态细胞法
(4)检测和鉴定目的基因
方法
检测或鉴定目的
水平
DNA分子杂交技术
检测目的基因的有无
分子水平
分子杂交技术
目的基因是否转录
抗原—抗体杂交
目的基因是否翻译
抗虫或抗病接种实验
是否具有抗虫抗病特性
个体水平
2.PCR技术
(1)原理：DNA双链复制。
(2)条件
(3)过程
(4)结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
1．基因工程操作的四个易错点
(1)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。
(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。
(3)农杆菌转化法原理：农杆菌易感染双子叶或裸子植物的细胞，并将其Ti质粒上的TDNA转移并整合到受体细胞染色体DNA上。
(4)启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子
启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
2．基因组文库与eDNA文库(部分基因文库)的比较
文库类型
部分基因文库
基因组文库
构建基因文库的过程
文库大小
小
大
基因中启动子
无
有
基因中内含子
无
有
基因多少
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
物种间的基因交流
可以
部分基因可以
说明
基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性
用箭头及简要的文字简述基因组文库和部分基因文库构建过程。
[提示] 基因组文库的构建过程：某种生物全部DNA许多DNA片段受体菌群体。
部分基因文库的构建过程为：某种生物发育的某个时期的mRNAcDNA受体菌群体。
考查基因工程的操作程序
1．(2019·晋冀鲁豫高三联考)真核生物基因中通常含内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。研究发现绿色木霉合成并分泌的环氧化水解酶可降解黄曲霉素B1。现有含绿色木霉的菌液，为获得环氧化水解酶，研究小组进行以下两种尝试：
(1)方法一
①从含有绿色木霉的菌液中提取细胞的mRNA，在________酶的催化下，合成cDNA。
②以cDNA为模板，通过________技术大量扩增，获得目的基因。
③构建目的基因表达载体，导入大肠杆菌的体内。
④目的基因在大肠杆菌体内正常转录，但是翻译产生的环氧化水解酶没有生物活性，需做进一步的处理加工，原因在于___________________。
(2)方法二
①提取绿色木霉的全部DNA，选用适当的________酶处理后，会获得一些小的DNA片段。
②选择一些合适的载体与获取的DNA片段构建基因表达载体。与从cDNA文库中获取目的基因构建表达载体所用载体相比，该载体组成不需要添加__________________成分。
③载体和这些DNA片段连接起来，导入受体菌的群体中储存。
④从这些受体菌的群体中筛选出含有目的基因的受体菌，分离出目的基因，将该目的基因和载体结合，通过________法导入大肠杆菌体内。
⑤该目的基因在大肠杆菌的体内正常转录，但其不能进行翻译，原因在于___________________________。
[解析] (1)以mRNA合成cDNA的过程为逆转录。以已知的cDNA为模板扩增目的基因的过程称为PCR技术。绿色木霉为真核生物，合成并分泌的环氧化水解酶为分泌蛋白，而大肠杆菌为原核生物，细胞内无内质网和高尔基体，因此在其体内翻译产生的环氧化水解酶没有生物活性。
(2)由提取绿色木霉的全部DNA获取一些小的DNA片段需要用限制酶进行处理。从cDNA文库中获取目的基因中无启动子和终止子。将该目的基因导入大肠杆菌的方法为转化法。从基因组文库里分离出的该目的基因在大肠杆菌的体内正常转录，但其不能进行翻译，原因在于目的基因中存在内含子。
[答案] (1)①逆转录 ②PCR ④环氧化水解酶是分泌蛋白，需要内质网和高尔基体加工 (2)①限制 ②启动子、终止子 ④转化 ⑤目的基因中存在内含子
2．(2019·郴州市高三二模)甘蔗黄叶综合症是一种由甘蔗黄叶病毒所引起的禾本科植物病毒，科学家通过甘蔗黄叶病毒外壳蛋白基因(简称CP蛋白基因)转化植物来获得抗病转基因新品种。
(1)首先从甘蔗黄叶综合症的病叶中提取RNA，此过程中为了防止RNA被分解，需加入________抑制剂，以提取的RNA为模板通过________获得cDNA。
(2)对获取的cDNA进行PCR扩增，在此反应体系中，除了模板DNA、dNTP外，还需加入________，获得大量的cDNA需要在4 ℃的低温下保存备用，原因是_______________。
(3)将cDNA和质粒用同一种限制酶切割，产生相同的平末端，再用________将二者进行连接(填“E·coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)。在培养基上接种培养大肠杆菌作为受体细胞，同时加入一定量的CaCl2低温冷却液，目的是制备________细胞，其具有的特殊功能是____________________________。
(4)为检测大肠杆菌是否产生CP蛋白，需要将病毒颗粒注射入兔子体内，并从血清中分离获得________作为检测剂。
[解析] (1)RNA酶可将RNA水解，因此为了防止RNA被分解，需加入RNA酶抑制剂；以RNA为模板获得cDNA的过程称为逆转录。
(2)采用PCR技术扩增目的基因时的条件有模板DNA、dNTP、引物、Taq酶(热稳定DNA聚合酶)；获得大量的cDNA需要在4℃的低温下保存备用，原因是高温条件下，易使DNA分子中的氢键断裂，双螺旋结构打开而发生变性。
(3)DNA连接酶包括E·coliDNA连接酶、T4DNA连接酶，这二者都能连接黏性末端，此外T4DNA连接酶还可以连接平末端。用CaCl2处理微生物细胞可使其成为感受态细胞，其具有的特殊功能是能吸收周围环境中的DNA分子。
(4)为检测大肠杆菌是否产生CP蛋白，需要将病毒颗粒注射入兔子体内，并从血清中分离获得CP蛋白抗体(黄叶病毒外壳蛋白抗体)作为检测剂。
[答案] (1)RNA酶 逆转录 (2)引物、Taq酶(热稳定DNA聚合酶) 高温条件下，易使DNA分子中的氢键断裂，双螺旋结构打开而发生变性 (3)T4DNA连接酶 感受态 能吸收周围环境中的DNA分子 (4)CP蛋白抗体(黄叶病毒外壳蛋白抗体)
3．(2019·沈阳市东北育才学校高三模拟)青蒿素是最有效的抗疟疾药物，但野生黄花蒿青蒿素产量低，为缓解青蒿素供应不足的状况，科学家将tms基因和tmr基因导入黄花蒿的愈伤组织从而获得了黄花蒿的冠瘿组织，改造过程用到的部分结构如图。
(1)科学家将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞的常用方法是______________________________________。
(2)图中结构P、T是基因成功转录的保证，其中结构P的作用____________________________________。为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，并将含有目的基因的细胞筛选出来，图中还缺少的结构是________________。
(3)在获得转基因的冠瘿组织过程中，_________是核心步骤，在具体操作中常常使用两种能产生不同黏性末端的限制酶对目的基因和运载体的两端分别进行切割，这样做的好处是___________。
(4)TDNA的作用是可以使______________________，并插入到植物细胞中染色体的DNA上，要检测目的基因是否插入到冠瘿组织细胞的染色体DNA上，可采用________技术。
(5)与愈伤组织相比，冠瘿组织的生长速度更快，原因可能是______________________________。
[解析] (1)目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法，而导入植物细胞最常用农杆菌转化法，因此，科学家将目的基因导入黄花蒿愈伤组织细胞的常用方法是农杆菌转化法。
(2)图中结构P、T与基因的转录有关，即基因成功转录的保证，T为终止子，则P为启动子，它的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位。为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，并将含有目的基因的细胞筛选出来，图中还缺少的结构是标记基因。
(3)在获得转基因的冠瘿组织过程中，基因表达载体的构建是核心步骤，在具体操作中常常使用两种能产生不同黏性末端的限制酶对目的基因和运载体的两端分别进行切割，这样做的好处是可以避免目的基因和运载体的自身连接成环和反向连接。
(4)TDNA的作用是可以使目的基因进入植物细胞，并插入到植物细胞中染色体的DNA上，要检测目的基因是否插入到冠瘿组织细胞的染色体DNA上，可采用DNA分子杂交技术。
(5)冠瘿组织的生长与细胞的分裂和伸长等有关，由此推知冠瘿组织的生长速度更快，原因可能是tms和tmr基因编码产物控制合成了生长素和细胞分裂素，促进其生长。
[答案] (1)农杆菌转化法 (2)RNA聚合酶识别和结合的部位 标记基因 (3)基因表达载体的构建(或构建基因表达载体) 可以避免目的基因和运载体的自身连接成环和反向连接 (4)目的基因进入植物细胞 DNA分子杂交 (5)tms和tmr基因编码产物控制合成了生长素和细胞分裂素，促进了冠瘿组织的生长
关注基因工程
1．基因工程的应用
(1)植物基因工程：培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质和利用植物生产药物。
(2)动物基因工程：用于提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。
(3)比较基因治疗与基因诊断
项目
原理
操作过程
进展
基因治疗
基因表达
利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)
临床实验
基因诊断
碱基互补配对
制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况
临床应用
2.转基因生物的安全性
(1)转基因植物的安全性
①食用安全问题。
②对生态系统的影响
a．转基因植物的扩散对生物多样性有无影响。
b．导入的目的基因是否会扩散漂移到其他物种体内而导致自然界的混乱。
c．若大面积种植转基因植物，其残体分解物、根部分泌物等是否会对生态与环境造成大规模的负面效应等。
(2)转基因动物的安全性
①对人体健康的影响。
②对生态系统的影响。
(3)转基因生物安全性的保障措施
①保障公众对所购食品是否来源于转基因生物拥有知情权。
②国家应建立相应的评估及预警机制。
3．生物武器的危害性
(1)所用微生物种类
①细菌：霍乱弧菌、炭疽杆菌等。
②病毒：埃博拉病毒、天花病毒等。
(2)被用作生物武器的方法
①将致病基因插入不致病的微生物体内。
②将抗普通疫苗或药物的基因插入致病细菌或病毒中。
③用于研制针对某一特定种群的生物武器。
1．利用转基因技术获得的已整合药用蛋白基因的转基因小鼠分泌的乳汁中检测不到药用蛋白，根据中心法则分析，其可能的原因是什么？
[提示] 药用蛋白基因没有转录或翻译。
2．尝试写出禁止生物武器的理由。
[提示] 生物武器包括致病菌、病毒、生化毒剂，以及经过基因重组的致病菌等。把这些病原体直接或通过食物、生活必需品等散布到敌方，可以对军队和平民造成大规模杀伤等后果。
考查基因工程的应用
1．(2019·河北省武邑中学高三质检)植物甲含有A基因，其编码的蛋白质中富含赖氨酸。科学家通过基因工程培育出的转基因玉米也能合成甲的富含赖氨酸的蛋白质，使玉米中赖氨酸的含量比原来提高30%。请回答：
(1)在获取目的基因时，常从甲的细胞中提取富含赖氨酸的蛋白质的mRNA，并利用mRNA人工合成cDNA。上述人工合成cDNA的过程称作________；与甲细胞中的A基因相比，cDNA中不具有调控基因表达的________________________________等组件。
(2)在利用农杆菌转化法转基因时，需将目的基因插入到质粒的TDNA中，原因是________________________。将携带了目的基因的农杆菌和玉米薄壁组织细胞共培养时，需用酚类化合物对玉米细胞进行处理，这种处理的作用是________________________。
(3)在获得转基因玉米后，可采用核酸分子杂交技术对玉米细胞中是否存在A基因的转录产物进行检测，检测时需用____________制作基因探针。
(4)实验发现，某携带了A基因的玉米植株(乙)自交，其子代中富含赖氨酸的个体占15/16，而用乙的体细胞离体培养所产生的植株100%富含赖氨酸。将玉米体细胞离体的培养成完整植株的过程称为______________。若乙中的A基因都能表达，且不考虑突变和染色体交叉互换，乙自交子代富含赖氨酸的个体占15/16，原因是____________________________________________。
[解析] (1)根据题意分析，上述人工合成cDNA的过程是以RNA为模板合成DNA的过程，为逆转录过程；与A基因相比，人工合成的cDNA中不含启动子、终止子和内含子。
(2)农杆菌细胞中的Ti质粒上的TDNA(可转移DNA)能进入玉米细胞并整合到玉米染色体DNA上，因此在利用农杆菌转化法转基因时，需将目的基因插入到质粒的TDNA中。将携带了目的基因的农杆菌和玉米薄壁组织细胞共同培养时，需用酚类化合物对玉米细胞进行处理，以吸引农杆菌对玉米细胞进行侵染。
(3)检测A基因(目的基因)可以用DNA分子杂交法，该过程需要用含A基因的DNA片段(或A基因)制作基因探针。
(4)将玉米体细胞离体的培养成完整植株的过程为植物组织培养。根据题意分析，将某携带了A基因的玉米植株(乙)自交，其子代中富含赖氨酸的个体占15/16，即只有1/16(1/4×1/4)的个体不富含赖氨酸，相当于两对杂合子的自交实验，说明乙的体细胞中有2条非同源染色体上含有A基因，所产生的配子中只有3/4的配子含A基因。
[答案] (1)逆转录 启动子、终止子、内含子 (2)TDNA能进入并整合到玉米染色体DNA上 吸引农杆菌对玉米细胞进行侵染 (3)含A基因的DNA片段(或A基因) (4)组织培养 乙的体细胞中有2条非同源染色体上含有A基因，所产生的配子中只有3/4的配子含A基因
2．(2019·保定市高三期末)干扰素具有抗病毒、抑制肿瘤及免疫调节等多种生物活性。质粒中的LacZ基因可表达出β半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和Xgal时，Xgal便会被β半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌形成蓝色菌落，反之则形成白色菌落。如图是将人干扰素基因导入大肠杆菌，培养后生产干扰素的过程。
(1)在获得干扰素基因后，常采用PCR技术大量扩增。该技术的基本过程是目的基因DNA受热变性后解链为单链，______________与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶的作用下进行______________，如此重复循环多次。
(2)过程①最好选用的限制酶是____________，在进行②过程前，需事先用Ca2＋处理大肠杆菌使其处于________。为了筛选含有重组质粒的大肠杆菌，需要在培养大肠杆菌的培养基中额外加入________________________________，培养一段时间后挑选出________(填“蓝色”或“白色”)的菌落进一步培养获得大量目的菌。
(3)某些干扰素可抑制肿瘤细胞DNA的合成，通过减缓细胞______________分裂过程抑制肿瘤。还有些干扰素可提高吞噬细胞将抗原呈递给____________的能力，从而在免疫调节中发挥作用。
[解析] (1)PCR技术的基本过程是在高温下，目的基因DNA受热变性后解链为单链；温度降低，引物与单链相应互补序列结合；然后，温度回升时，在DNA聚合酶的作用下进行互补链的合成，如此重复循环多次。
(2)为了产生相同的黏性末端，获取目的基因和切割载体时通常使用同种限制酶。由题图可知，质粒和目的基因均具有EcoRⅤ、BamHⅢ和EcoRⅠ限制酶切割位点，但EcoRⅤ限制酶会破坏干扰素基因，因此过程①不能选用该酶，最好选用BamHⅢ和EcoRⅠ限制酶。将重组质粒导入大肠杆菌细胞，需事先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使大肠杆菌细胞处于感受态。选用BamHⅢ和EcoRⅠ限制酶切割质粒和目的基因，重组质粒中青霉素基因完好，可正常表达，对青霉素具有抗性；而LacZ基因被破坏，无法表达出β半乳糖苷酶，无法使无色的IPTG和Xgal变蓝，显白色。因此，在培养基中加入IPTG、Xgal和青霉素，只有成功导入目的基因的重组质粒的细菌(即目的菌)才能不被青霉素杀死，同时表现为白色。
(3)癌细胞的增殖方式为有丝分裂。因此，某些干扰素可抑制肿瘤细胞DNA的合成，通过减缓细胞有丝分裂过程抑制肿瘤。还有些干扰素可提高吞噬细胞将抗原呈递给T淋巴细胞的能力，从而在免疫调节中发挥作用。
[答案] (1)引物 互补链的合成(或延伸) (2)BamHⅢ和EcoRⅠ 感受态 IPTG、Xgal和青霉素 白色 (3)有丝 T淋巴细胞
考查转基因技术的安全性
3．(2019·安徽六安一中高三模拟)2018年11月，有关“中国基因编辑婴儿”新闻占据了各大网络媒介，一场“科学发展”与“伦理道德沦丧”争辩响彻全国。请根据你所学的知识，分析以下问题：
(1)为了达到所谓的“阻断感染艾滋病”效果，该实验团队主要针对CCR5基因进行编辑，实施基因敲除，该过程中可能要用到的工具酶是____________________，敲除后为了使DNA上“缺口”补上，可能用到的工具酶是__________________。
(2)人们担心这种行为会打开“潘多拉魔盒”，驱使另一些科研者开展人类基因编辑研究，出现“基因完美的定制人”。在这些研究中，外源基因能与受体细胞DNA成功重组的原因是________________________________，这些基因拼接成功后能正常表达的理论基础是_________________。
(3)由于基因组计划尚未圆满完成，人类对自身基因在DNA分子上的位置知之甚少，在这种情况下开展对人类的基因编辑计划风险非常大。你认为该转基因技术存在安全性争论的原因：________________。
(4)转基因技术并不是令人闻之色变的疯狂技术，它已在作物品种改良上取得一定的成绩。比如，为了获得“多彩的牵牛花”，可将__________________(填目的基因名称)与质粒形成重组质粒，导入到普通牵牛花细胞中，再通过____________技术培养得到符合要求的植株。
[解析] (1)实施基因敲除，该过程中可能要用到的工具酶是限制性核酸内切酶，敲除后为了使DNA上断裂的磷酸二酯键重新形成，可能用到的工具酶是DNA连接酶。
(2)在基因工程中，外源基因能与受体细胞中的DNA具有共同的结构和化学组成是成功重组的基础，这些基因拼接成功后能正常表达的理论基础是所有的生物都共用一套遗传密码子表，都遵循中心法则。
(3)“中国基因编辑婴儿”转基因技术存在安全性争论的原因：目前对基因的结构、基因间的相互作用以及基因的调控机制等都了解得相当有限；外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的，可能导致生命活动必需的正常基因遭到破坏。
(4)利用转基因技术获得“多彩的牵牛花”，即将与花青素代谢有关的基因与质粒形成重组质粒，导入到普通牵牛花细胞中，再利用植物细胞的全能性，通过植物组织培养技术培养得到符合要求的植株。
[答案] (1)限制性核酸内切酶 DNA连接酶 (2)两者都具有共同的结构和化学组成 所有的生物都共用一套遗传密码子表，都遵循中心法则 (3)目前对基因的结构、基因间的相互作用以及基因的调控机制等都了解得相当有限；外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的，可能导致生命活动必需的正常基因遭到破坏 (4)与花青素代谢有关的基因 植物组织培养
蛋白质工程
1．蛋白质工程
(1)概念：指通过物理化学与生物化学等技术了解蛋白质的结构与功能，并借助计算机辅助设计、基因定点诱变和重组DNA技术改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的蛋白质的技术。
(2)流程图
写出流程图中字母代表的含义：
A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。
2．蛋白质工程与基因工程的比较
(1)区别
项目
蛋白质工程
基因工程
过程
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核糖核苷酸序列
获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测和鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型和生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
(2)联系
①蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。
1．研究发现，如果将白喉杆菌类毒素20位和24位的氨基酸改变为半胱氨酸，免疫效果更好，请写出此种技术的基本流程。
[提示] 从预期蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。
2．请简要写出从个体水平鉴定抗虫棉是否培育成功的设计思路。
[提示] 取一定量长势良好的转基因棉花植株接种适量的棉铃虫作为实验组，取等量长势一致的普通棉花植株接种等量棉铃虫作为对照组。在相同且适宜的条件下培养一段时间，观察并统计两组棉花叶片的受损程度。
考查蛋白质工程及应用
香港大学的研究人员将某印度芥菜的HMGS基因编码的蛋白质的第359位氨基酸“丝氨酸”替换成“丙氨酸”后形成s359a蛋白，通过一定的方法获得新HMGS基因，然后将其导入番茄细胞，获得类胡萝卜素增加111%的转基因番茄，该番茄具有强抗氧化性。请回答下列问题：
(1)请按照蛋白质工程的原理写出获得新HMGS基因的基本途径：
____________________________________________________
____________________________________________________。
(2)如图的4种质粒中，E表示EcoR Ⅰ的切割位点，将这些质粒用EcoR Ⅰ充分切割后，产生的线性双链DNA片段的种类分别为________个，接着将新HMGS基因分别与这4组酶切产物、DNA连接酶在适宜环境下混合，编号为1、2、3、4组，结果发现除第________组外，其余3组都有含新HMGS基因的基因表达载体(重组质粒)出现。基因表达载体的组成除目的基因和标记基因外，还包括________及复制原点。
(3)若质粒3是农杆菌的Ti质粒，则图示E所处的位置在Ti质粒上的________，将含新HMGS基因的重组Ti质粒的农杆菌导入番茄细胞，成功获得含新HMGS基因的转基因番茄，将其果实色素提取后，用________法分离，可发现滤纸条上____________(填颜色)的条带比第4组的宽。
[解析] (1)蛋白质工程的原理为从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)，由此可写出获得新HMGS基因的基本途径：从s359a蛋白的功能出发→设计s359a蛋白的结构→将HMGS蛋白的第359位丝氨酸替换成丙氨酸→找到并改造HMGS基因的脱氧核苷酸序列。
(2)图中质粒1、2、3、4上的限制酶EcoR Ⅰ切割位点分别为3、2、1、0，用EcoRⅠ充分切割后，产生的线性双链DNA片段的种类分别为3、2、1、0。第4组无EcoR Ⅰ切割位点，因此无法构建基因表达载体。基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子以及复制原点。
(3)Ti质粒上的TDNA可将目的基因转移到受体细胞且整合到受体细胞染色体的DNA上。色素的提取方法为纸层析法。新HMGS基因导入番茄细胞，获得的类胡萝卜素增加，因此滤纸条上橙黄色和黄色的条带比第4组的宽。
[答案] (1)从s359a蛋白的功能出发→设计s359a蛋白的结构→将HMGS蛋白的第359位丝氨酸替换成丙氨酸→找到并改造HMGS基因的脱氧核苷酸序列[或从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)] (2)3、2、1、0 4 启动子和终止子 (3)TDNA 纸层析 橙黄色和黄色
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1．(2019·全国卷Ⅰ)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成，也可以从基因文库中获得。基因文库包括________和________。
(2)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是__________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_________________________________________。
[解析] (1)基因文库包括基因组文库和cDNA文库。(2)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至90～95 ℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。(3)在PCR过程中，要加热至90～95 ℃，所以使用热稳定性高的Taq酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
[答案] (1)基因组文库 cDNA文库 (2)解旋酶 加热至90～95 ℃ 氢键 (3)Taq酶热稳定性高，而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
2．(2019·江苏高考)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题：
图1
(1)EcoR V酶切位点为，EcoR V酶切出来的线性载体P1为________末端。
(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外两类菌落质粒导入情况分别是________、________。
菌落类型
平板类型
A
B
C
无抗生素
＋
＋
＋
氨苄青霉素
＋
＋
－
四环素
＋
－
－
氨苄青霉素＋四环素
＋
－
－
图2
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是______________________________。
[解析] (1)EcoR V酶切位点在酶所识别序列的中心轴线处，产生的是平末端。(2)DNA连接酶对平末端的连接效率较低，因此通常要将平末端改造成黏性末端后再进行连接。由于目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，根据碱基互补配对原则，处理后的质粒两端需要各添加一个碱基为胸腺嘧啶的脱氧核苷酸；要将处理后的质粒与目的基因连接起来，需要用DNA连接酶。(3)由于四环素抗性基因中含有EcoR V酶识别的序列及切割位点，所以形成的重组质粒中四环素抗性基因已经被破坏，而氨苄青霉素抗性基因正常。根据表中结果可知，A菌落抗氨苄青霉素和四环素，说明A菌落中导入的是P0质粒；B菌落抗氨苄青霉素而不抗四环素，说明B菌落中导入的是重组质粒；C菌落既不抗氨苄青霉素，也不抗四环素，说明C菌落中没有导入质粒。(4)由于处理后的P0质粒的两个末端都含一个胸腺嘧啶的脱氧核苷酸，而目的基因片段的两端各自带一个腺嘌呤脱氧核苷酸，所以目的基因在和P0质粒连接时可能会出现两种情况：正向连接和反向连接。分析图2可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50 bp＋300 bp＋100 bp＝450 bp，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和P0质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300 bp＋100 bp＝400 bp的片段。
[答案] (1)平 (2)胸腺嘧啶(T)
DNA连接 (3)B A类菌落含有P0 C类菌落未转入质粒 (4)乙丙 目的基因反向连接
3．(2019·海南高考)人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y)，该蛋白质由一条多肽链组成。目前可以利用现代生物技术生产Y。回答下列问题。
(1)若要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取________作为模板，在________催化下合成cDNA，再利用______________技术在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法。若将上述所得Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的__________________中，得到含目的基因的重组Ti质粒，则可用农杆菌转化法将该基因导入某种植物的叶肉细胞中。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经__________。
(3)天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性，若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性，具体思路是___________。
[解析] (1)由于人的T细胞可以产生蛋白质Y，要获得Y的基因，可从人的T细胞中提取mRNA作为模板，在逆转录酶催化下，利用四种游离的脱氧核苷酸合成cDNA，再利用PCR技术(体外扩增DNA的技术)在体外扩增获得大量Y的基因。
(2)农杆菌转化法中，TDNA可以携带目的基因转移至受体细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，故需要Y的基因插入农杆菌Ti质粒上的TDNA中得到含目的基因的重组Ti质粒，把含目的基因的重组Ti质粒导入到农杆菌中，再让含目的基因的农杆菌侵染植物的叶肉细胞。若该叶肉细胞经培养、筛选等得到了能稳定表达Y的愈伤组织，则说明Y的基因已经整合到叶肉细胞染色体DNA上。
(3)蛋白质工程需要从预期的蛋白质的功能出发，设计预期的蛋白质结构，推出相应的氨基酸序列，找到相应的脱氧核苷酸序列，故对Y进行改造以提高其热稳定性，需要找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基。
[答案] (1)mRNA 逆转录酶 PCR (2)TDNA 整合到叶肉细胞染色体DNA上 (3)找到第6位氨基酸中的碱基所在的基因位置，参照密码子表，将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基
4．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了____________________________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用____________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
[解析] (1)两位科学家将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中并进行了表达，因此，该研究可以证明：质粒可以作为载体，真核细胞的基因在原核细胞中也可以表达(不同生物共用一套密码子)、体外重组的质粒可以进入受体细胞等。(2)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化，将质粒导入大肠杆菌时，常用的转化方法是首先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使其成为感受态。噬菌体DNA没有侵染能力，体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白组装成完整噬菌体才能完成侵染过程。噬菌体多寄生在细菌中，但不能寄生在心肌细胞和叶肉细胞中。(3)若要使蛋白质不被降解，则大肠杆菌体内不能存在蛋白酶，因此，实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞。同理，在蛋白质纯化过程中，也不能使蛋白质降解，因此，应添加蛋白酶抑制剂。
[答案] (1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达 (2)转化 外壳蛋白(或噬菌体蛋白) 细菌 (3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶
5．(2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是________。使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证________________。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的________移入牛的______________中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
[解析] (1)据图示信息分析：将L1GFP融合基因(甲)插入质粒时使用酶E1和E4进行酶切，既能保证L1GFP融合基因的完整，又能保证L1GFP融合基因与载体的正确连接。(2)目的基因在受体细胞中的表达包括转录和翻译两个过程。(3)将体外培养的含有目的基因的动物体细胞核移入该动物的去核卵母细胞中，经过体外胚胎培养、胚胎移植等技术可获得转基因动物。(4)检测目的基因是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，采用PCR技术鉴定时，应以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。
[答案] (1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接 (2)转录 翻译 (3)细胞核 去核卵母细胞
(4)核DNA
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